毛细管电泳原理及分析策略精选PPT.ppt

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1、关于毛关于毛细管管电泳原理泳原理及分析策略及分析策略第1页，讲稿共80张，创作于星期二贝克曼高效毛细管电泳仪贝克曼高效毛细管电泳仪第2页，讲稿共80张，创作于星期二毛细管电泳是带电粒毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进或和分配系数不同进行高效、快速分离的行高效、快速分离的电泳新技术，也称为电泳新技术，也称为高效毛细管电泳高效毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,Capillary Electrophoresis,CECE)。第3页，讲稿共80张，创作于星期二毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理1

2、1 装置装置装置装置 毛细管毛细管毛细管毛细管 数据处理数据处理数据处理数据处理 电极电极电极电极 检测器检测器检测器检测器 电极电极电极电极 试样试样试样试样 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 高压电源高压电源高压电源高压电源 （可高至（可高至（可高至（可高至30303030KVKVKVKV）第4页，讲稿共80张，创作于星期二2 2 电泳和电渗电泳和电渗 电泳电泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。电渗电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。表面移动的现

3、象。第5页，讲稿共80张，创作于星期二2 2 电泳和电渗电泳和电渗 电泳电泳行行为为与与特特性性使使用用淌淌度度描描述述 即即单单位位场场强强(E E)下下下下离离离离子子子子的的的的平平平平均均均均电电电电泳泳泳泳速度速度速度速度 ep=/E实验中，只发生电泳时有效淌度实验中，只发生电泳时有效淌度 ef ef=ef ef (L/V)=(l/tl/tm)(L/V)(L/V)毛细管有效长度毛细管有效长度毛细管有效长度毛细管有效长度 迁移时间迁移时间迁移时间迁移时间 毛细管总长度毛细管总长度毛细管总长度毛细管总长度 电压电压电压电压 第6页，讲稿共80张，创作于星期二2 2 电泳和电渗电泳和电渗

4、电渗电渗与固液界面的双电层有着密切的关系与固液界面的双电层有着密切的关系与固液界面的双电层有着密切的关系与固液界面的双电层有着密切的关系 在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对

5、运动，携带着溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（electroosmotic flow,EOFelectroosmotic flow,EOF）。）。）。）。第7页，讲稿共80张，创作于星期二固液两相间的总固液两相间的总电势电势-热力学电势热力学电势-0 Zeta电势电势-第8页，讲稿共80张，创作于星期二2 2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗流

6、的流型特点电渗流的流型特点电渗流电渗流电渗流电渗流 HPLCHPLCHPLCHPLC塞流塞流塞流塞流 层流层流层流层流 第9页，讲稿共80张，创作于星期二2 2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗流的表示电渗流的表示电渗流的大小可用淌度电渗流的大小可用淌度(eo)或电渗流系数表示或电渗流系数表示 eo=eo/E=l/(teoE)电渗流速度电渗流速度电渗流速度电渗流速度 毛细管有效长度毛细管有效长度毛细管有效长度毛细管有效长度 电渗流流出时间电渗流流出时间电渗流流出时间电渗流流出时间 电场强度电场强度电场强度电场强度 第10页，讲稿共80张，创作于星期二第第2222章章 毛细管电泳毛细管电泳 22221

7、 1 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗流的意义电渗流的意义1.1.1.1.电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象2.2.2.2.电渗流的速度比电泳速度快电渗流的速度比电泳速度快电渗流的速度比电泳速度快电渗流的速度比电泳速度快5 5 5 57 7 7 7倍倍倍倍3.3.3.3.利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差

8、速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析电渗流是毛细管电泳分离的重要参数电渗流是毛细管电泳分离的重要参数控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。效率、重现性、分离度。分情况而论第11页，讲稿共80张，创作于星期二2 2 电泳和电渗电泳和电渗 改变电渗流的方法改变电渗流的方法1.1.改变外加径向电场改变外加径向电场2.2.改变缓冲液成分和浓度改变缓冲液成分和

9、浓度 ZetaZeta电势电势3.3.改变缓冲液改变缓冲液pHpH4.4.加入添加剂加入添加剂5.5.5.5.改变温度改变温度改变温度改变温度 粘度粘度 盐盐-离子强度离子强度表面活性剂表面活性剂eo正比于正比于Zeta电势和介质的介介电常数电常数 反比于介质的黏度介质的黏度Zeta电势正比于双电层厚度双电层厚度和界界面有效电荷密度面有效电荷密度 反比于介质的介电常数介电常数第12页，讲稿共80张，创作于星期二表观电泳淌度表观电泳淌度 apapap=ap/E ap为离子的表观迁移速度为离子的表观迁移速度 ap=ef+eo ap=ef+eo2 2 电泳和电渗电泳和电渗电泳和电渗电泳和电渗 第13

10、页，讲稿共80张，创作于星期二3 3 分离效率和分离度分离效率和分离度 分离效率分离效率分离效率分离效率柱效可以用理论塔板数柱效可以用理论塔板数柱效可以用理论塔板数柱效可以用理论塔板数n n表示表示表示表示 n n=(epep+eoeo)V l/(2/(2DLDL)毛细管电泳分离的柱效方程毛细管电泳分离的柱效方程毛细管电泳分离的柱效方程毛细管电泳分离的柱效方程 理论塔板高理论塔板高理论塔板高理论塔板高 H=L/n n n=5.54(=5.54(/W W)2 2 实验上可按上式求出理论塔板数实验上可按上式求出理论塔板数实验上可按上式求出理论塔板数实验上可按上式求出理论塔板数 为电泳图上从起点至电

11、泳峰最大值之间的距离为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离 W W W W为电泳峰的半高峰宽为电泳峰的半高峰宽为电泳峰的半高峰宽为电泳峰的半高峰宽 第14页，讲稿共80张，创作于星期二3 3 分离效率和分离度分离效率和分离度 分离度分离度电电电电泳泳泳泳中中中中两两两两峰峰峰峰的的的的分分分分离离离离度度度度（R Rs s），也也也也称称称称为为为为分分分分辨辨辨辨率率率率，它它它它表表表表示示示示了了了了淌淌淌淌度度度度相相相相近的组近的组近的组近的组分分分分分开的能力，可表达为分开的能力，可表达为分开的能力，

12、可表达为分开的能力，可表达为 Rs s=（n 1/21/2/4 4）（/平平平平 ）相邻两区带的迁移速度差相邻两区带的迁移速度差相邻两区带的迁移速度差相邻两区带的迁移速度差平平平平为两者的平均速度为两者的平均速度为两者的平均速度为两者的平均速度/平平平平表示分离选择性表示分离选择性表示分离选择性表示分离选择性n n n n为柱效为柱效为柱效为柱效第15页，讲稿共80张，创作于星期二分离度计算式分离度计算式Rs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)t tm1m1、t tm2 m2 分别为两个组份的迁移时间分别为两个组份的迁移时间分别为两个组份的迁移时间分别为两个组份的迁移时间WW 为为为为峰底的

13、宽度峰底的宽度峰底的宽度峰底的宽度 3 3 分离效率和分离度分离效率和分离度分离效率和分离度分离效率和分离度 第16页，讲稿共80张，创作于星期二4 4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 区带宽度区带宽度展宽因素展宽因素 1.焦耳热焦耳热 2.进样进样3.电泳扩散电泳扩散4.毛细管壁对组分的吸附毛细管壁对组分的吸附 第17页，讲稿共80张，创作于星期二焦耳热焦耳热 细内径（细内径（细内径（细内径（100100mm），），），），粗外径的毛细管柱粗外径的毛细管柱粗外径的毛细管柱粗外径的毛细管柱 温度轮廓温度轮廓-黏度轮廓黏度轮廓 -速度轮廓速度轮廓4 4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其

14、展宽因素区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 第18页，讲稿共80张，创作于星期二 进样进样进样进样 试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。一般进样区带控制在柱长的一般进样区带控制在柱长的1%1%电泳扩散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，试样

15、区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。s s-b b 峰前展或拖尾？峰前展或拖尾？4 4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 第19页，讲稿共80张，创作于星期二毛细管壁对组分的吸附毛细管壁对组分的吸附

16、电泳峰拖尾或变形，甚至消失。电泳峰拖尾或变形，甚至消失。电泳峰拖尾或变形，甚至消失。电泳峰拖尾或变形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：抑制吸附作用常用的方法有：抑制吸附作用常用的方法有：抑制吸附作用常用的方法有：使用极端使用极端使用极端使用极端pHpHpHpH条件条件条件条件 加入中性盐或两性离子化合物加入中性盐或两性离子化合物加入中性盐或两性离子化合物加入中性盐或两性离子化合物 对毛细管内壁进行涂层处理对毛细管内壁进行涂层处理对毛细管内壁进行涂层处理对毛细管内壁进行涂层处理 需要注意：方法也会抑制或改变电渗流需要注意：方法也会抑制或改变电渗流 4 4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽

17、因素区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 第20页，讲稿共80张，创作于星期二CE分离原理分离原理-与模式有关与模式有关毛细管区带电泳（CZECZE）毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC）毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等电聚焦（cIEF）亲和毛细管电泳（ACE）毛细管电色谱（毛细管电色谱（CEC）第21页，讲稿共80张，创作于星期二第一章第一章 毛细管区带电泳毛细管区带电泳样样品在品在电电解液解液中泳中泳动动,根根据据物物质的荷质的荷/质比质比差差异来进异来进行分行分离离，比值愈大，比值愈大,跑得愈快跑得愈快第22页，讲稿共80张，创作于星期二进样方式进样方式n压力进样压

18、力进样n电动进样电动进样n浓缩进样浓缩进样第23页，讲稿共80张，创作于星期二毛细管种类毛细管种类 非涂层毛细管（裸管）非涂层毛细管（裸管）内壁涂层毛细管（涂层管）内壁涂层毛细管（涂层管）第24页，讲稿共80张，创作于星期二非涂层毛细管非涂层毛细管-电渗流的概念电渗流的概念第25页，讲稿共80张，创作于星期二-H+高高pH低低pH第26页，讲稿共80张，创作于星期二电渗流的特点电渗流的特点EOF第27页，讲稿共80张，创作于星期二-+纯电泳状态纯电泳状态第28页，讲稿共80张，创作于星期二-+EOF电泳电泳+电渗流电渗流0tm(min)第29页，讲稿共80张，创作于星期二电渗流的作用电渗流的作

19、用第30页，讲稿共80张，创作于星期二电渗流的活塞流特点电渗流的活塞流特点 Hydrodynamic flowHydrodynamic flow ParabolicParabolic Resistance to flow at surfaceResistance to flow at surface More diffusion/broader More diffusion/broader detection zonedetection zone EOF gives plug flowEOF gives plug flow Minimizes band broadeningMinimizes

20、band broadening Narrows detection zoneNarrows detection zone第31页，讲稿共80张，创作于星期二 Hydrodynamic flowHydrodynamic flow ParabolicParabolic Resistance to flow at surfaceResistance to flow at surface More diffusion/broader More diffusion/broader detection zonedetection zone EOF gives plug flowEOF gives plug

21、 flow Minimizes band broadeningMinimizes band broadening Narrows detection zoneNarrows detection zone电渗流的活塞流特点电渗流的活塞流特点第32页，讲稿共80张，创作于星期二电渗流是电渗流是CE中最大的驱动力来源之一中最大的驱动力来源之一第33页，讲稿共80张，创作于星期二电渗流的正面及负面作用电渗流的正面及负面作用 正面作用正面作用 增加分离速度增加分离速度 使得正、负电荷物质同时使得正、负电荷物质同时分离分离 负面作用负面作用 减少分离时间和分离有效距减少分离时间和分离有效距离离 电渗流的波

22、动极大的影响了电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性迁移时间的重复性第34页，讲稿共80张，创作于星期二影响电渗流的因素影响电渗流的因素pH值值 pHpH越高，电渗流越大离子强度 离子强度越高，电渗流越小缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精第35页，讲稿共80张，创作于星期二电渗流随电渗流随pH的变化情况的变化情况第36页，讲稿共80张，创作于星期二控制电渗流的三个重要手段控制电渗流的三个重要手段1.1.采用涂层毛细管，消除电渗流的影响采用涂层毛细管，消除电渗流的影响2.改变pHpH，从而调整电渗流的大小。pH10以后，电渗流基本不增加以后，电

23、渗流基本不增加3.添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用第37页，讲稿共80张，创作于星期二缓冲溶液的影响和选择缓冲溶液的影响和选择 在在CECE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液：中应该根据以下性质来选择缓冲溶液：1.1.在所选的在所选的pHpH范围内有较强缓冲能力；范围内有较强缓冲能力；2.2.在检测波长处有低的紫外吸收；在检测波长处有低的紫外吸收；3.3.小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。那些被称为生物那些被称为生物“优良缓冲液优良

24、缓冲液”的，如的，如Tris,borate,CAPSTris,borate,CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。第38页，讲稿共80张，创作于星期二常用的常用的CE缓冲体系缓冲体系 磷酸钠体系磷酸钠体系 宽缓冲范围宽缓冲范围硼酸钠体系 高pH范围范围 Tris-HClTris-HCl体系 低pHpH范围范围 醋酸醋酸-醋酸铵体系醋酸铵体系 CE/MSCE

25、/MS常用体系常用体系第39页，讲稿共80张，创作于星期二CZE分离条件的选择分离条件的选择 毛细管类型毛细管类型-涂层还是非涂层？毛细管长度-长毛细管还是短毛细管？缓冲液体系-种类和种类和pH值 添加剂类型添加剂类型-甲醇|环糊精环糊精|乙腈乙腈检测器选择-紫外紫外|二极管阵列二极管阵列|激光诱导荧光第40页，讲稿共80张，创作于星期二缓冲溶液的选择缓冲溶液的选择 可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，紫外吸收低，pHpH缓

26、冲范围比较宽（pH=1.5pH=1.51313），但电导也比较大。第41页，讲稿共80张，创作于星期二缓冲溶液及缓冲溶液及pH值的选择值的选择 研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（品，采用酸性（pH 2）或碱性（pH9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=9pH=911之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在在pH=5pH=59 9之间选择分离条件。第42页，讲稿共80张，创作于星期二缓冲溶液及缓冲溶液及pH值的选择值的选择 pH pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂

27、层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3pHpH8的范围以外工作，其涂层容易水解失效。第43页，讲稿共80张，创作于星期二缓冲溶液及缓冲溶液及pH值的选择值的选择 在相同的在相同的 pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，硼酸盐

28、缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。第44页，讲稿共80张，创作于星期二缓冲溶液及缓冲溶液及pH值的选择值的选择 缓冲试剂及缓冲试剂及pHpH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在1010200 mmol/L200 mmol/L之间。电导率之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20 20 mmol/Lmmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及附近，而电导

29、小的试剂如硼酸及HEPES等，等，其浓度可在其浓度可在100 mmol/L100 mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（附等特殊目的，可采用很高（0.5mol/L）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。第45页，讲稿共80张，创作于星期二添加剂的选择添加剂的选择目的：1.改善分离2.2.抑制分析物在毛细管上的吸附抑制分析物在毛细管上的吸附第46页，讲稿共80张，创作于星期二添加剂的选择添加剂的选择1.1.甲醇甲醇|乙腈（乙腈（5-50%5-50%）降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果降低电渗流，增加分离有效距

30、离，从而改善分离效果 增加非极性物质的水溶性增加非极性物质的水溶性2.2.环糊精环糊精|SDS|SDS等表面活性剂等表面活性剂 增加分离选择性，提高分析效果增加分离选择性，提高分析效果 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果3.3.非极性高分子聚合物非极性高分子聚合物 掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附 降低电渗流降低电渗流 形成一定的分子筛，提高分子大小选择性形成一定的分子筛，提高分子大小选择性第47页，讲稿共80张，创作于星期二第二章第二章 毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱 电解质电解质中加入中加入表表

31、面活性剂(surfactantsurfactant，例如例如SDS)，使之之形成形成胶束（MicelleMicelle），样品根据其疏水性疏水性(Hydrophobicity)强弱的差差异，异，在在胶束与电解质的胶束与电解质的分配系数数有所不同來有所不同來进进行分行分离离 ，样品疏水性愈強疏水性愈強，则进则进入胶束的的机会机会愈大愈大。通常物质进物质进入入胶束后，泳动的速度的速度会变会变慢慢，因此疏水性愈強的物因此疏水性愈強的物质则质则愈慢出來。第48页，讲稿共80张，创作于星期二毛细管胶束电动色谱原理第49页，讲稿共80张，创作于星期二SDS第50页，讲稿共80张，创作于星期二-+EOFMi

32、cellar Electrokinetic Chromatography(MEKC)第51页，讲稿共80张，创作于星期二七种青霉素的分离(A)CZE:20mM Pi-Borate,pH 8.5(B)MEKC:0.1 M SDS in(A)soln.第52页，讲稿共80张，创作于星期二胶束电动色谱的特点胶束电动色谱的特点 优点优点 增加对弱极性物质分离的分增加对弱极性物质分离的分离度离度 在中药分析、天然产物分在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用析、农药分析中经常使用 缺点缺点 稳定性不佳，达到好的重稳定性不佳，达到好的重复性比较困难复性比较困难第53页，讲稿共80张，创作于星期二第三章

33、第三章 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 毛細管內先填充毛細管內先填充凝胶(例如例如polyacrylamide或cellulose)，此此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，筛，样样品依分子量品依分子量的的大小在毛細管內移动动速度不同而速度不同而进行分离。离。主要用于核酸片断及蛋白分子量分析主要用于核酸片断及蛋白分子量分析第54页，讲稿共80张，创作于星期二毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳第55页，讲稿共80张，创作于星期二CE双链及单链核酸分析双链及单链核酸分析45-寡核苷酸质控寡核苷酸质控 1.0 2.0 3.0123 45678910111213141516171819202324252627282

34、9303031323334IS21 10.0 15.0Relative Fluorescence IntensitydsDNA片段片段(72 bp-12 Kbp)第56页，讲稿共80张，创作于星期二CE-SDS蛋白分子量分析蛋白分子量分析第57页，讲稿共80张，创作于星期二第四章第四章 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦第58页，讲稿共80张，创作于星期二第五章第五章 亲和毛细管电泳亲和毛细管电泳-分离条件基于分离条件基于CZE 当在CZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，其他方面的选择

35、与CZECZE等相同。等相同。用于研究1.1.分子间相互作用测定，分子构型变化分子间相互作用测定，分子构型变化2.特定物质检测3.活性物质筛选第59页，讲稿共80张，创作于星期二ACE测定分子间结合常数与解离速率测定分子间结合常数与解离速率JAK2与与SH2-B之间的相互作用研究之间的相互作用研究第60页，讲稿共80张，创作于星期二CE药物筛选药物筛选第61页，讲稿共80张，创作于星期二ACE用于相互作用筛选用于相互作用筛选 适体适体AptamerAptamer类似于抗体，类似于抗体，但可以体外合成，结合但可以体外合成，结合常数比抗体更高，有广常数比抗体更高，有广泛的药物筛选和临床诊泛的药物筛

36、选和临床诊断应用潜力断应用潜力 目前已有以下的一些蛋白的目前已有以下的一些蛋白的aptameraptamer是采用是采用CECE方法筛选方法筛选得到的得到的1.1.IgEIgE2.2.HIV type 1 reverse transcriptaseHIV type 1 reverse transcriptase3.3.ThrombinThrombin4.4.Anti-thrombin IIIAnti-thrombin III5.5.Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase第62页，讲稿共80张，创作于星期二ACE用于相互作用筛选用于相互作用筛选 传统筛选方法如亲

37、和色谱传统筛选方法如亲和色谱或者或者CECCEC筛选一个筛选一个AptamerAptamer需要需要4-64-6周周 而而CECE只需要几天就可以了，只需要几天就可以了，大大提高了筛选速度大大提高了筛选速度-MicroScale Bioseparations 2006MicroScale Bioseparations 2006第63页，讲稿共80张，创作于星期二第六章第六章 检测器选择检测器选择小分子检测 大分子检测大分子检测第64页，讲稿共80张，创作于星期二CE检测器种类及性能检测器种类及性能第65页，讲稿共80张，创作于星期二小分子检测小分子检测1.1.有紫外吸收有紫外吸收 首先选择二极

38、管阵列检测器或紫外检测器首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器2.2.无紫外吸收无紫外吸收 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等器检测，如氨基酸、还原性糖等 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器也可以尝试电化学检测器3.3.有荧光或需要高灵敏度检测的可采用有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIFLIF检测器检测器4.4.需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测

39、检测第66页，讲稿共80张，创作于星期二大分子检测大分子检测1.1.蛋白、核酸蛋白、核酸 可以首先选择紫外检测器可以首先选择紫外检测器 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用荧光，然后用LIFLIF检测检测 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIFLIF检测检测 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测2.2.多糖多糖 含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外

40、检测器检测 含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIFLIF、UVUV的方的方式检测式检测第67页，讲稿共80张，创作于星期二第七章 分离条件选择流程 分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：下九步选择流程，仅供参考：第第一一步步，尽尽可可能能多多地地了了解解分分离离样样品品的的类类型型、来来源源、组组成成及及其其性质；性质；第第二二步步，

41、根根据据样样品品的的可可能能性性质质和和来来源源，选选择择分分离离模模式式，若若无样品信息可先选无样品信息可先选CZECZE；第68页，讲稿共80张，创作于星期二条件选择流程 第第三三步步，根根据据样样品品性性质质确确定定检检测测方方法法，一一般般先先选选直直接接紫紫外外吸收；吸收；第第四四步步，确确定定样样品品处处理理方方式式，包包括括衍衍生生方方案案以以及及离离心心过过滤滤除除蛋白等；蛋白等；第第五五步步，根根据据样样品品解解离离常常数数计计算算最最佳佳pHpH，或或利利用用75mID75mID毛细管和磷酸缓冲体系确定毛细管和磷酸缓冲体系确定pHpH范围范围;第69页，讲稿共80张，创作于

42、星期二条件选择流程 第第六六步步，根根据据所所需需pHpH构构建建缓缓冲冲体体系系，包包括括进进一一步步优优化化pHpH、缓缓冲冲试试剂浓度等；剂浓度等；第第七七步步，优优化化其其他他操操作作参参数数，如如毛毛细细管管尺尺寸寸、分分离离电电压压和和温温度等；度等；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第九步，确定是否需要换用其他分离模式。第九步，确定是否需要换用其他分离模式。第70页，讲稿共80张，创作于星期二条件选择流程 在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项：在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项：最好对样品和缓冲液

43、进行过滤或离心处理。最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。毛毛细细管管的的洗洗涤涤或或平平衡衡，与与缓缓冲冲体体系系、pHpH以以及及柱柱子子有有关关。磷磷酸酸根根与与石石英英和和玻玻璃璃之之间间存存在在慢慢相相互互作作用用，需需要要延延长长平平衡衡或或冲冲洗洗时时间间，处处理的时间应由分离重现性决定。理的时间应由分离重现性决定。第71页，讲稿共80张，创作于星期二条件选择流程 欲欲降降低低缓缓冲冲液液的的电电导导，应应尽尽量量使使用用所所谓谓的的“生生物物缓缓冲冲试试剂剂”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。欲欲保保持持分分离离重重现现，要

44、要尽尽量量采采用用相相同同的的条条件件，包包括括毛毛细细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。第72页，讲稿共80张，创作于星期二第八章第八章 各类物质的分离要点各类物质的分离要点1.阴离子及有机酸此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法 间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸收物间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸收物CTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰，提高峰的尖锐度要使用反向极性分离第73页，讲稿共80张，创作于星期二各类物质的分离要点各类物质的分离要点2.2.阳离子及金属离子的分离阳离子及金属离子的分离此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法间接紫外法一般以

45、氨基吡啶等物质作为背景吸收物与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓冲溶液中添加电渗流反向试剂 也不需要使用反向极性分离也不需要使用反向极性分离第74页，讲稿共80张，创作于星期二各类物质的分离要点各类物质的分离要点3.3.易电离有极性的化合物易电离有极性的化合物一般采用长60cm60cm的毛细管分离的最佳pH在分析物在分析物pKa+/-1pKa+/-1左右通常不需要添加剂第75页，讲稿共80张，创作于星期二各类物质的分离要点各类物质的分离要点4.弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成分、农药等）要注意分析物的溶解性，防止在毛细管中的沉淀 通过有机溶剂的添加，提高分析物在通过有机溶剂的添加，提高

46、分析物在buffer中的溶解度添加SDS，增加溶解度降低样品中分析物的浓度，延长ramp timeramp time也可以也可以防止分析物的析出防止分析物的析出第76页，讲稿共80张，创作于星期二各类物质的分离要点各类物质的分离要点5.5.还原性的单糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等及还原性的单糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等及其聚合物）其聚合物）通常无紫外和荧光，注意检测问题可用APTS等衍生试剂衍生，使其带上电荷和紫外/荧光基团荧光基团 多糖也可以采用末端吸收来检测（多糖也可以采用末端吸收来检测（180-200nm180-200nm），不需要衍生化处理，但是要尽量采用高pHpH使得使得羟基部

47、分电离带电羟基部分电离带电第77页，讲稿共80张，创作于星期二各类物质的分离要点各类物质的分离要点6.6.非还原性的单糖、寡糖和多糖非还原性的单糖、寡糖和多糖很难采用衍生的方法检测，通常对单糖和寡糖采用间接检测法 对多糖采用末端吸收的方法来检测对多糖采用末端吸收的方法来检测 通常采用高通常采用高pH使得羟基部分电离带电高pH缓冲液还有防止多糖在毛细管内壁吸附的作缓冲液还有防止多糖在毛细管内壁吸附的作用用第78页，讲稿共80张，创作于星期二各类物质的分离要点各类物质的分离要点7.7.单链核苷酸、双链核苷酸片断及单链核苷酸、双链核苷酸片断及PCR产物 容易在毛细管内壁吸附，通常需要使用涂层管或者容易在毛细管内壁吸附，通常需要使用涂层管或者对毛细管进行动态涂层对毛细管进行动态涂层分子筛原理，凝胶的种类和浓度决定了分辨率的最佳范围和大小第79页，讲稿共80张，创作于星期二感感谢谢大大家家观观看看第80页，讲稿共80张，创作于星期二