荧光分光光度法与检测技术.ppt
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1、荧光分光光度法与检测技术1现在学习的是第1页，共43页学习目的学习目的u通过学习荧光分析法的基本原理，产生荧光的条件以及荧光光谱特征和用途，加深对荧光分析的依据、条件和应用的理解，并能选择荧光物质的激发波长和荧光波长进行分析。为学习药物分析、天然药物化学等专业课程奠定基础。2现在学习的是第2页，共43页知识要求知识要求u熟悉掌握荧光和磷光产生的原理和特点及区别；激发光谱与荧光光谱的概念及用途；溶液荧光光谱的特征；产生荧光的条件；荧光定量分析的依据、条件和方法。了解。u了解影响荧光强度的因素，荧光分析仪器及其与紫外-可见分光光度计的区别，荧光分析新技术在分析中的应用。3现在学习的是第3页，共43
2、页能力要求能力要求u掌掌握握荧荧光光分分光光光光度度计计的的基基本本结结构构及及仪仪器器的的基基本本操操作作方方法法，学学会会使使用用荧荧光光分分光光光光度度计计对对药药物物进进行行分分析析的的操操作作技术。技术。4现在学习的是第4页，共43页第一节 荧光分光光度法的基本原理 u某某些些物物质质吸吸收收紫紫外外-可可见见光光后后，可可以以发发射射其其波波长长比比吸吸收收光光更更长长的的光光，并并且且随随照照射射光光的的消消失失而而消消失失，这这种种发发射射光称为荧光（光称为荧光（fluorescence）。）。u荧荧光光分分析析法法（fluorometry）是是利利用用某某些些物物质质发发射射
3、荧荧光光的的特特性性进进行行定定性性、定定量量分分析析的的光光学学分分析析方方法法，又又称称荧荧光光谱法光光谱法5现在学习的是第5页，共43页第一节 基本原理一、荧光的产生过程一、荧光的产生过程（一）单重态与三重态（一）单重态与三重态A 单重基态单重基态 B 激发单重态激发单重态 C 激发三重态激发三重态6现在学习的是第6页，共43页第一节 基本原理（二）荧光的产生（二）荧光的产生 电电子子由由激激发发单单重重态态基基态态单单重重态态的的跃跃迁迁7现在学习的是第7页，共43页第一节 基本原理（二）磷光的产生（二）磷光的产生 电子由激发三重态电子由激发三重态基态单重态的跃迁基态单重态的跃迁课堂互
4、动课堂互动您能比较荧光和磷光的主要区别吗？您能比较荧光和磷光的主要区别吗？8现在学习的是第8页，共43页第一节 基本原理二、二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱和荧光光谱（发射光谱）9现在学习的是第9页，共43页第一节 基本原理 任何荧光物质都具有两个特征光谱：任何荧光物质都具有两个特征光谱：激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光波长而激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光波长而变化的关系曲线（以激发光波长变化的关系曲线（以激发光波长ex为横坐标，荧光的发为横坐标，荧光的发光强度光强度F为纵坐标的光谱）。为纵坐标的光
5、谱）。10现在学习的是第10页，共43页第一节 基本原理荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质物质所产生的所产生的荧光通过发射分光系统荧光通过发射分光系统(II)分光，测定每一发射波长荧分光，测定每一发射波长荧光强度光强度F，以发射光波长，以发射光波长em为横坐标，荧光的发光强度为横坐标，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。为纵坐标作图所得的关系曲线。11现在学习的是第11页，共43页第一节 基本原理 溶液荧光光谱具有如下溶液荧光光谱具有如下特征：特征：斯托克斯位移斯托克斯位移荧光光谱的形状与激荧光光谱的形状与激发波长无关发波长无关荧光光谱
6、与激发光谱的荧光光谱与激发光谱的镜像关系镜像关系蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）12现在学习的是第12页，共43页第一节 基本原理三、荧光与分子结构三、荧光与分子结构 （一）荧光物质的特征（一）荧光物质的特征具有强的可见具有强的可见-紫外吸收，即具有紫外吸收，即具有K带强吸收带强吸收具有高的荧光效率具有高的荧光效率荧光效率荧光效率13现在学习的是第13页，共43页第一节 基本原理（二）分子结构与荧光的关系二）分子结构与荧光的关系大的共轭大的共轭键结构键结构ex（激发）em（激发）F苯2052780.11萘2863210.29蒽3654000.46四苯3904
7、800.6014现在学习的是第14页，共43页第一节 基本原理分子的刚性和共平面性分子的刚性和共平面性取代基的影响取代基的影响联苯联苯F=0.18芴芴F=1.0 15现在学习的是第15页，共43页第一节 基本原理（三）影响荧光强度的外界因素（三）影响荧光强度的外界因素温度温度溶剂溶剂溶液酸碱性溶液酸碱性荧光熄灭剂荧光熄灭剂散射光散射光激发光源激发光源16现在学习的是第16页，共43页第一节 基本原理 （四）荧光分光光度计（四）荧光分光光度计荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光谱
8、的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。从各个角度反映了分子的成键和结构情况。17现在学习的是第17页，共43页第一节 基本原理（一）仪器类型（一）仪器类型滤光片荧光计滤光片荧光计滤光片滤光片-单色器荧光计单色器荧光计荧光分光光度计荧光分光光度计18现在学习的是第18页，共43页第一节 基本原理（二）荧光分光光度计的基本结构（二）荧光分光光度计的基本结构1.光源光源 2.4.7.9.狭缝狭缝3.激发单色器激发单色器 5.样品池样品池6.表面吸光物质
9、表面吸光物质8.发射单色器发射单色器10.检测器检测器 11.放大器放大器 12.指示器指示器 13.记录器记录器19现在学习的是第19页，共43页第一节 基本原理光源光源 目前最常用的是氙灯目前最常用的是氙灯单色器（分光系统）单色器（分光系统）激发单色器激发单色器 发射单色器发射单色器样品池样品池 测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英检测器检测器 光电倍增管光电倍增管20现在学习的是第20页，共43页第一节 基本原理（三）仪器校准（三）仪器校准灵敏度校准灵敏度校准波长校准波长校准激发光谱和发射光谱校准激发光谱和发射光谱校准21现在学习的是第21页，
10、共43页课堂互动课堂互动请请您您比比较较荧荧光光分分光光光光度度计计与与紫紫外外-可可见见分分光光光光度度计的主要区别计的主要区别 第一节 基本原理22现在学习的是第22页，共43页点滴积累点滴积累荧荧光光和和磷磷光光在在实实验验现现象象上上的的区区别别：激激发发光光停停止止照照射射时时，荧荧光光随之消失而磷光则将延续一段时间。随之消失而磷光则将延续一段时间。最最强强荧荧光光波波长长em和和最最强强激激发发波波长长ex是是物物质质的的定定性性依依据据，也是定量测定时的最适宜波长。也是定量测定时的最适宜波长。强强荧荧光光物物质质的的分分子子结结构构体体征征：一一、具具有有长长共共轭轭结结构构，如
11、芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。第一节 基本原理23现在学习的是第23页，共43页第二节 荧光定量分析第二节第二节 荧光定量分析荧光定量分析由由于于荧荧光光物物质质的的结结构构不不同同，其其吸吸收收光光的的波波长长不不同同，发发射射出出荧荧光光的的波波长长也也不不同同，这这就就是是荧荧光光分分光光光光度度法法对对能能产产生生荧荧光光的的物物质质进进行行定定性性分分析析的的依依据据。实实验验证证明明，在在稀稀溶溶液液中中，荧荧光光强强度度与与荧荧光光物物质质的的
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