食品生物技术导论酶工程.ppt

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1、食品生物技术导论酶工程食品生物技术导论酶工程现在学习的是第1页，共92页第一节第一节 酶工程发展概况酶工程发展概况1.酶的化学本质酶的化学本质l是指一类由活性细胞产生的、具有催化活性作用和高度专一性的特殊蛋白质，又称生物催化剂。现在学习的是第2页，共92页l不自觉的应用：不自觉的应用：传统的酿酒、制酱、制曲等。传统的酿酒、制酱、制曲等。l初步认识酶的存在及作用：初步认识酶的存在及作用：l1833年，佩恩和帕索兹发现能水解淀粉的酒精沉淀物年，佩恩和帕索兹发现能水解淀粉的酒精沉淀物（淀粉酶）并提出其热不稳定性；（淀粉酶）并提出其热不稳定性；l1896年，巴斯德发现酒精发酵是由酵母引起的；年，巴斯德

2、发现酒精发酵是由酵母引起的；l1897年，巴纳兄弟用酵母抽提液生产出了酒精；年，巴纳兄弟用酵母抽提液生产出了酒精；2.酶工程发展简史酶工程发展简史现在学习的是第3页，共92页l对酶的催化理论及本质的研究：对酶的催化理论及本质的研究：l1913年，米彻里斯和曼吞由中间产物学说推导出米年，米彻里斯和曼吞由中间产物学说推导出米氏方程；氏方程；l1926年，萨母纳从刀豆中提出脲酶，并通过大量研究证年，萨母纳从刀豆中提出脲酶，并通过大量研究证实酶的本质是蛋白质。实酶的本质是蛋白质。l20世纪世纪60年代，固定化技术的发展标志着酶工程产业年代，固定化技术的发展标志着酶工程产业化形成；化形成；l20世纪世纪

3、80年代，酶分子修饰技术发展使酶工程得到空前年代，酶分子修饰技术发展使酶工程得到空前发展。发展。现在学习的是第4页，共92页3.酶工程的概念酶工程的概念l酶工程（enzyme engineering）又称酶技术，指利用酶的催化酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品的过程，是酶学理论与化学工程相结合而形成的一门科学技术。现在学习的是第5页，共92页第二节第二节 酶的制备与发酵生产酶的制备与发酵生产l主要途径主要途径l从生物细胞内合成或直接提取分离；l从微生物发酵生产获取。现在学习的是第6页，共92页（一）从生物细胞获取（一）从生物细胞获取1.植物细胞产酶植物细胞产酶l

4、P76-78：表4-12.动物细胞产酶动物细胞产酶lP78-79现在学习的是第7页，共92页（二）微生物发酵产酶（二）微生物发酵产酶1.常用产酶微生物常用产酶微生物l细菌、放线菌、霉菌和酵母菌等（P80表4-3）。l用于食品酶制剂的细胞应具备条件：l安全可靠，非致病菌；l稳定性好不易感染噬菌体；l酶产量高，有较好的开发应用价值；l容易培养和管理，产酶细胞易生长繁殖；l能利用廉价的原料，发酵周期短。现在学习的是第8页，共92页2.发酵方法发酵方法（1）固体发酵法）固体发酵法 l即以麸皮、米糠等为基本原料，加无机盐和适量水分即以麸皮、米糠等为基本原料，加无机盐和适量水分(通常通常50左右左右)进行

5、的一种微生物培养法。进行的一种微生物培养法。l用青霉、曲霉生产果胶酶；用木霉生产纤维素酶用青霉、曲霉生产果胶酶；用木霉生产纤维素酶（2）液体发酵法）液体发酵法l利用合成的液体培养基在发酵罐内进行搅拌通气培养，利用合成的液体培养基在发酵罐内进行搅拌通气培养，是目是目前主要的方式前主要的方式。现在学习的是第9页，共92页间歇发酵法：间歇发酵法：l特点：特点：先在适于菌体生长条件下培养，然后再转入产酶条件先在适于菌体生长条件下培养，然后再转入产酶条件下进行发酵。产酶量高，同时营养物质与诱导物浪费少。下进行发酵。产酶量高，同时营养物质与诱导物浪费少。连续发酵法：连续发酵法：l特点：特点：先将菌体培养至

6、某一生长期如对数期，然后一边连先将菌体培养至某一生长期如对数期，然后一边连续加入新鲜培养液，另外又不断地以相同速度放出培养产续加入新鲜培养液，另外又不断地以相同速度放出培养产物，二者的速度应和生长速度一致，使菌体生长处于恒态物，二者的速度应和生长速度一致，使菌体生长处于恒态条件，同时还可能打破酶合成的反馈阻遏，使产酶率提高。条件，同时还可能打破酶合成的反馈阻遏，使产酶率提高。现在学习的是第10页，共92页3.微生物发酵产酶工艺条件及控制微生物发酵产酶工艺条件及控制（1）培养基：碳源、氮源、无机盐、生长因子）培养基：碳源、氮源、无机盐、生长因子（2）温度：）温度：（3）pH：（4）溶氧量：）溶氧

7、量：（5）发酵时间：）发酵时间：现在学习的是第11页，共92页l选育优良细胞（基因重组技术）选育优良细胞（基因重组技术）l强化生产过程强化生产过程：l控制合理发酵条件：控制合理发酵条件：pH、温度、基质浓度等、温度、基质浓度等l添加诱导物：如乳糖诱导添加诱导物：如乳糖诱导-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l控制阻遏物浓度：产物积累一定浓度，合成受阻控制阻遏物浓度：产物积累一定浓度，合成受阻l添加表面活性剂：主要是非离子型表面活性剂添加表面活性剂：主要是非离子型表面活性剂l添加产酶促进剂：添加产酶促进剂：植酸钙镁、聚乙烯等植酸钙镁、聚乙烯等4.提高微生物产酶量的措施提高微生物产酶量的措施现在学习的是第12页

8、，共92页（三）（三）酶的分离纯化酶的分离纯化1.细胞分离（胞外酶）细胞分离（胞外酶）:离心或过滤离心或过滤2.细胞破碎（胞内酶）：细胞破碎（胞内酶）：许多酶存在于细胞内，提取这些胞内酶许多酶存在于细胞内，提取这些胞内酶时首先需要对细胞进行破碎处理。时首先需要对细胞进行破碎处理。l机械破碎机械破碎l物理破碎物理破碎l化学破碎化学破碎l酶解破碎酶解破碎现在学习的是第13页，共92页机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表

9、面活性剂：表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏而使细胞破碎。坏而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破结构受到破坏，而达到细胞破碎碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原

10、理 现在学习的是第14页，共92页提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液提取 0.020.5mol/L的盐溶液 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 酸溶液提取 pH26的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 碱溶液提取 pH812的水溶液 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂 用于提取与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 3.提取提取现在学习的是第15页，共92页第三节第三节 酶的分子修饰酶的分子修饰l酶分子修饰（酶分子修饰（molecularmodificationenzyme）：）：通过改变酶分子的结构，使酶的某些特

11、性和功能发生改变的技术。l化学修饰l物理修饰现在学习的是第16页，共92页（一）酶分子的化学修饰（一）酶分子的化学修饰l酶的化学修饰酶的化学修饰（chemical modification）：利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子的某些部分删除或置换，改变酶的理化性质，最终达到改变酶催化性质的目的。现在学习的是第17页，共92页1.大分子结合修饰大分子结合修饰l常用大分子修饰剂：右旋糖苷、聚乙二醇、聚蔗糖-环糊精、琼脂糖、壳聚糖、白蛋白、明胶、淀粉、硬脂酸、聚丙氨酸等。l作用：稳定性提高、抗原性降低，等等l如：1分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合可使其活力提高5.1倍。

12、现在学习的是第18页，共92页2.肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰l指在肽链的限定肽键位点水解，使酶空间结构发生某些改变而改变酶特性和功能的方法。l常用修饰剂为专一性较高的蛋白酶或肽酶。l特点：既保持酶活力，又降低其抗原性。l如木瓜蛋白酶水解去除其肽链上2/3氨基酸，仍可保持其活力。现在学习的是第19页，共92页3.侧链基团修饰：侧链基团修饰：如将如将-胰凝乳蛋白酶的氨基修饰成亲水性更强胰凝乳蛋白酶的氨基修饰成亲水性更强的的-COOH等，酶活提高等，酶活提高1000倍，且更耐热倍，且更耐热4.分子内或分子间交联：分子内或分子间交联：使用双功能试剂交联，更稳定使用双功能试剂交联，更稳定5.氨基酸

13、置换修饰：氨基酸置换修饰：改变活力中心的氨基酸改变活力中心的氨基酸6.金属离子置换修饰：金属离子置换修饰：如将酰基化氨基酸水解酶的活力中心的如将酰基化氨基酸水解酶的活力中心的Zn2+置换为置换为Co2+。现在学习的是第20页，共92页（二）酶分子的物理修饰（二）酶分子的物理修饰l酶分子物理修饰（酶分子物理修饰（physicalmodificayion）：）：通过物通过物理方法，不改变理方法，不改变酶的组成单位及基团酶的组成单位及基团，只使，只使酶分子酶分子的空间构象发生改变的空间构象发生改变（副键变化或重排），而改变（副键变化或重排），而改变酶的某些特性和功能。酶的某些特性和功能。l高压处理：

14、高压处理：酶活提高；最适条件改变l适当变性改变空间构象：适当变性改变空间构象：稳定性适当提高现在学习的是第21页，共92页第四节第四节 酶的非水相催化酶的非水相催化（自学）（自学）酶催化反应的介质有机介质反应体系 酶在有机介质中的催化特性 有机介质中酶催化反应的条件及其控制 GoGoGoGo酶非水相催化的应用 Go现在学习的是第22页，共92页一、酶催化反应的介质一、酶催化反应的介质l水：水：酶促反应最常用的反应介质。酶促反应最常用的反应介质。l有机介质：有机介质：含有一定量水的有机溶剂l气相介质：气相介质：底物是气体或者能够转化为气体的物质l超临界介质：超临界介质：超临界流体l离子液介质：离

15、子液介质：由有机阳离子与阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类现在学习的是第23页，共92页二、二、有机介质反应体系有机介质反应体系1.反应体系中水对酶催化反应的影响反应体系中水对酶催化反应的影响l酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成水是不可缺少的成分分之一。有机介质中的水含量多少对酶的之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、催化活性、稳空间构象、催化活性、稳定性、催化反应速度定性、催化反应速度等都有密切关系

16、，水还与酶催化作用的等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和底物和反应产物的溶解度反应产物的溶解度有关。有关。l酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。因此，酶分子需要一层件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。因此，酶分子需要一层水化层（必须水），以维持其完整的空间构象。同时有机介质中水的水化层（必须水），以维持其完整的空间构象。同时有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响，存在含量对酶催化反应速度有显著影响，存在最适水含量最适水含量。现在学习的是第24页，共92页2.

17、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响l常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。乙腈，已酯，二氯甲烷等。l在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。催化反应。根据酶分子和有机溶剂特性的不同，保持其空间结构根据酶分子和有机溶剂特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别完整性的情况也有所差别。l极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分

18、子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚甚至引起酶的变性失活。因至引起酶的变性失活。因避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性催化活性。l有机溶剂的极性不同，在反应过程中会影响有机溶剂的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。从而影响酶的催化反应。现在学习的是第25页，共92页三、三、酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性l热稳定性热稳定性l改变底物特异性改变底物特异性l产生新的酶促反应产生新的酶促反应lpH记忆记忆l键选择性键选

19、择性现在学习的是第26页，共92页有机介质酶催化反应的优点有机介质酶催化反应的优点l酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性”特点。l由于有机溶剂的存在,水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反应，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。l在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程,提高收率。现在学习的是第27页，共92页四、有机介质中酶催化反应及控制四、有机介质中酶催化反应及控制l反应类型：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。l控制：酶的种类和浓度、底物的种类和

20、浓度、有机溶剂的种类、水含量、温度、pH、离子强度现在学习的是第28页，共92页五、酶非水相催化的应用五、酶非水相催化的应用 酶 催化反应 应用 脂肪脂肪酶酶 肽合成 青霉素G前体肽合成 酯合成 醇与有机酸合成酯类 转酯 各种酯类生产 聚合 二酯的选择性聚合 酰基化 甘醇的酰基化蛋白酶 肽合成 合成多肽 酰基化 糖类酰基化羟基化酶 氧化 甾体转化过氧化物酶 聚合 酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化多酚氧化酶酶 氧化 芳香化合物的羟基化 胆固醇氧化酶 氧化 胆固醇测定醇脱氢酶 酯化 有机硅醇的酯化现在学习的是第29页，共92页第五节第五节 酶的固定化酶的固定化l产生背景：产生背景：由于酶对食品的影响

21、广泛且成本很高，人由于酶对食品的影响广泛且成本很高，人们基于生物体内的酶固定在细胞壁和膜的现象，提出们基于生物体内的酶固定在细胞壁和膜的现象，提出酶的固定化，希望酶能重复使用，同时又能稳定酶、酶的固定化，希望酶能重复使用，同时又能稳定酶、改变酶的专一性、提高酶活力，从而改善酶的各种特改变酶的专一性、提高酶活力，从而改善酶的各种特性。性。现在学习的是第30页，共92页l酶的固定化：是指将酶与不溶性载体结合，使游离酶、细胞或细胞器等的催化活动完全或基本上限制在一定空间内的过程。l固定化后的酶其仍具有酶的催化活性，能连续进行反应，并且反应后的酶可以回收重复使用。现在学习的是第31页，共92页固定化酶

22、的优点固定化酶的优点l易于将酶与底物及产物分离，因而产物相对容易提纯；l酶能够重复利用，使用效率提高，成本低；l大多数情况下可以提高酶的稳定性；l可以增加产物的收率，提高产物质量；l有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用。现在学习的是第32页，共92页固定化酶的缺点固定化酶的缺点l由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶的活力难免有一定损失；l而底物则要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应；l不适宜于需要辅助因子的反应。现在学习的是第33页，共92页（一）酶的固定化原则l必须维持酶的催化活性和专一性l固定化的载体必须有一定的机械强度l固定化酶应有最小的

23、空间位阻l固定化酶的载体应具有最大的稳定性现在学习的是第34页，共92页b.包埋法包埋法a.吸附法吸附法c.共价偶联法共价偶联法d.交联法交联法（二）（二）酶的固定化方法酶的固定化方法现在学习的是第35页，共92页1.吸附法吸附法（1）物理吸附：）物理吸附：通过氢键、疏水作用和通过氢键、疏水作用和电子亲和力电子亲和力等物理作用将酶固定于水不溶载体上的方法。等物理作用将酶固定于水不溶载体上的方法。l有机载体：有机载体：淀粉、谷蛋白、纤维、甲壳素等。如木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶吸附后在载体表面形成单分如木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约子层，吸附蛋白能力约70mg/

24、cm2。现在学习的是第36页，共92页l无机载体：无机载体：活性炭、多孔玻璃、多孔陶瓷、氧化铝、硅胶等；l如：用多孔硅为载体吸附米曲霉和枯草杆菌的淀粉酶以及黑如：用多孔硅为载体吸附米曲霉和枯草杆菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在曲霉的糖化酶，在45进行固定化。进行固定化。l代表性酶：代表性酶：-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶l特点：吸附容量较低(一般小于1mg蛋白/g吸附剂)；酶活力损失少；与载体结合力较弱，容易脱落。现在学习的是第37页，共92页（2）离子吸附）离子吸附l将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法（酶吸附较牢固）（酶吸附较牢固）。l常用的载体有阴离子交换剂

25、，如二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素、DEAE-Sephadex葡聚糖凝胶；阳离子交换剂，如羧甲基(CMC)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Dowex-50等。l代表性酶：代表性酶：葡萄糖异构酶、糖化酶、-淀粉酶现在学习的是第38页，共92页lDEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀用0.5mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.07.5的米曲霉3042粗酶液，充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4备用。l此外，DEAE-纤维素吸附的-淀粉

26、酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。现在学习的是第39页，共92页优点：优点：l操作简单，处理条件温和，可以得到较多高活性的固定化酶；可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时载体可以回收再利用。缺点：缺点：l吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和操作的稳定性。现在学习的是第40页，共92页2.包埋法包埋法l指用一定方法将酶包埋于半透性的载体中，制成固定化酶的方法。（1）凝胶包埋法：）凝胶包埋法：l指将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中制成的固定化酶或固定化菌体。l常见凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交

27、联树脂等。l特点：特点：条件温和，对酶活影响小，但强度差现在学习的是第41页，共92页（2）半透膜包埋法）半透膜包埋法l又称微胶囊包埋法，指将酶分子定位于半透性的聚合体膜内制成微胶囊型酶。l常用半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜、硝化纤维、聚苯乙烯、壳聚糖等。l特点：特点：微胶囊大小可控制、胶囊化时间短、酶与底物接触表面积大、多种酶可固定于同一胶囊，利于多酶固定。现在学习的是第42页，共92页 优点优点:l包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制

28、剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。完整的微生物细胞都是适用的。缺点缺点:l只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。定化酶动力学行为的变化、活力降低。现在学习的是第43页，共92页3.共价键结合法共价键结合法l酶蛋白的侧链基团和载体表面的功能基团之间形成共价键而固定的方法。l特点：特点：结合牢固，不易脱落，利于连续使用；但载体活化操作复杂，且制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶结构变化，使固定化酶活力降低或破坏

29、，回收率低（约30%）。现在学习的是第44页，共92页l与载体共价结合的酶功能基团：与载体共价结合的酶功能基团：氨基、羧基、酚基、巯基、羟基、咪唑基、吲哚基等l最常见的：最常见的：氨基、羧基、酪氨酸和组氨酸的芳环。l常用的载体：常用的载体：l天然有机载体：纤维素、琼脂糖l合成高聚物：尼龙、多聚氨基酸l无机载体：多孔玻璃、金属氧化物l结合方法：重氮化法、烷基化法、芳基化法、溴化氰法、巯基-二硫键交换法等。现在学习的是第45页，共92页4.交联法交联法l指使用双功能试剂或多功能试剂与酶分子之间进行交联的固定化方法。交联反应可以发生在酶分子之间，也可以发生在酶分子内部。酶浓度低时发生在酶分子内部，酶

30、浓度高时分子间交联比例上升，形成固定化酶后往往为不溶态。l特点：特点：结合牢固，可长时间使用；但条件剧烈，酶活损失大，且固定化酶颗粒小，使用不方便。l改进：可与吸附法或包埋法结合使用。现在学习的是第46页，共92页l常用交联剂：常用交联剂：戊二醛戊二醛、双重氮联苯胺-2,2-二磺酸等l交联方法：l酶直接交联法：l酶辅助蛋白交联法：l吸附交联法：l载体交联法：现在学习的是第47页，共92页（1）直接交联法：直接交联法：一定条件下，加入一定量戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。l如：木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0长时间反应，只得可溶性固定化酶，若在室温下0一5h，即可形成不溶性固定化酶。

31、这种情况对不同酶可能有不同结果。现在学习的是第48页，共92页（2）酶辅助蛋白交联法：）酶辅助蛋白交联法：用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联从而制备固定化酶。l辅助蛋白，如牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等，与酶一起进行交联。l例如：10mg脲酶与2.5ml含6白蛋自、0.2戊二醛的0.02mol/L pH8磷酸缓冲液混合，冷却到-30 后，再升温至4 ，放置4h将形成的泡沫聚合物彻底洗除后，冻干，即为固定化脲酶。现在学习的是第49页，共92页（3）载体交联法：）载体交联法：用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。l单用戊二醛等试剂交联

32、制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。现在学习的是第50页，共92页（4）吸附交联法：）吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝等吸附剂上，再与双功能试剂交联。现在学习的是第51页，共92页（三）固定化酶的性质（三）固定化酶的性质1.固定化酶的活力固定化酶的活力l与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有：固定化酶活力下降的原因主要有：l酶与不溶性载体相结合引起结构发生了变化；l酶活性中心的重要氨基酸残基与载体相结合。现在学习的是第52页，共92页2.固定化酶的稳定性固定化酶的稳定性l大多数酶在固定

33、化后都不同程度地提高了稳定性延长了有效寿命。固定化酶稳定性提高的主要原因：固定化酶稳定性提高的主要原因：l固定化增加了酶构象的牢固程度。l抵挡住了不利因素对酶的侵袭。l限制了酶分子间的相互作用。现在学习的是第53页，共92页（1）热稳定性热稳定性l大多数酶固定化后与溶液酶相比，有较高的热稳定性 l如氨基酰化酶：溶液酶在75保温15min，活力为0；其DEAE-Sephadex固定化酶在同样条件下仍有80；DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60活力。这种性质对工业上的应用是有益的。l固定化酶反应的温度一般较溶液酶的高，如用CM-纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比溶液酶高515。现在

34、学习的是第54页，共92页（2）pH一酶活力关系一酶活力关系l反应的最适pH和酶活力-pH曲线的变动依据酶蛋白和载体的电荷而定。带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。l例如：DEAE纤维素固定化氨基酰化酶与其游离酶比较，低0.5个pH而偏向酸性方向。CM-纤维素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最适pH与游离酶比较，向碱性方向偏移0.51个pH单位。现在学习的是第55页，共92页（3）对蛋白酶的抵抗力提高）对蛋白酶的抵抗力提高l溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。l比如：氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20，而将其固定于DEAE纤维素上在同样条件下仍

35、有80的活力。l这可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中。现在学习的是第56页，共92页（4）对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高）对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高l酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力。l例如：氨基酰化酶与固定于DEAE-Sephadex的氨基酰化酶比较，前者在6mol、2mol胍、1SDS和4mmol丙酮溶液中活力分别为9、49、1和55，而后者在相应溶液中活力则分别为146、117、35和138。现在学习的是第57页，共92页（5）操作稳定性）操作稳定性l固定化酶在操作中可以长期使用。通常用半衰期(t1/2)来衡量，即酶活性达到原有酶活性一半时

36、所需的时间较长。工业中半衰期通常在一个月以上才有应用价值 现在学习的是第58页，共92页（6）贮藏稳定性）贮藏稳定性l大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在4下，120d 酶活力无变化。现在学习的是第59页，共92页第六节第六节 酶工程在食品工业中的酶工程在食品工业中的应用应用现在学习的是第60页，共92页l生物技术对食品工业生产影响最大的还是生物技术对食品工业生产影响最大的还是酶工程和发酵工酶工程和发酵工程。程。2001年世界酶制剂年销售额达年世界酶制剂年销售额达16亿美元，亿美元，2008年销年销售额达到售额达到30亿美元。我国酶制剂的主要应用领域是食品工亿美元

37、。我国酶制剂的主要应用领域是食品工业，全世界食品工业用酶约占总量的业，全世界食品工业用酶约占总量的60%，我国更高达，我国更高达85%以上。如应用于酒精、味精、有机酸、啤酒、淀粉糖、以上。如应用于酒精、味精、有机酸、啤酒、淀粉糖、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等许多工业领域，创果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等许多工业领域，创造工业附加值数千亿元。造工业附加值数千亿元。现在学习的是第61页，共92页 一、改进啤酒生产工艺，提高啤酒质量一、改进啤酒生产工艺，提高啤酒质量 传统的啤酒生产主要依靠麦芽中的传统的啤酒生产主要依靠麦芽中的、-淀粉酶淀粉酶的水解作用，生成麦芽糖，进而发酵过滤等，的水解作

38、用，生成麦芽糖，进而发酵过滤等，又称全麦啤酒。其生产过程缓慢，效率低，难又称全麦啤酒。其生产过程缓慢，效率低，难以适应现代化的要求，正逐步向外加酶制剂的以适应现代化的要求，正逐步向外加酶制剂的方向发展。方向发展。现在学习的是第62页，共92页（一）固定化生物催化剂酿造啤酒新工艺（一）固定化生物催化剂酿造啤酒新工艺 利用固定化酶和固定化细胞技术酿造酒是近年来国外啤酒利用固定化酶和固定化细胞技术酿造酒是近年来国外啤酒工业的新工艺。工业的新工艺。固定化的方法主要有下述两种：固定化的方法主要有下述两种：一种是以藻朊酸作为交联剂通过与酶共价结合起来，再把一种是以藻朊酸作为交联剂通过与酶共价结合起来，再把

39、微生物细胞包埋进去；微生物细胞包埋进去；另一种是将干燥的微生物酵母细胞悬浮在酶液中，使两者充另一种是将干燥的微生物酵母细胞悬浮在酶液中，使两者充分混合，脱水后加戊二醛和鞣酸（单宁）使两者结合起来。分混合，脱水后加戊二醛和鞣酸（单宁）使两者结合起来。现在学习的是第63页，共92页前苏联专家把酵母细胞镶嵌在陶瓷或聚乙烯材料的环前苏联专家把酵母细胞镶嵌在陶瓷或聚乙烯材料的环形载体上形载体上(直径为直径为10-20mm)进行啤酒发酵，发酵周期缩进行啤酒发酵，发酵周期缩短到短到2d，鲜啤酒的理化指标均可达到传统工艺水平，但产，鲜啤酒的理化指标均可达到传统工艺水平，但产量比传统工艺增加量比传统工艺增加22

40、.5倍。倍。上海微生物研究所和上海华光啤酒厂把卡伯尔酵母固定化后上海微生物研究所和上海华光啤酒厂把卡伯尔酵母固定化后用于啤酒酿造，试验表明，啤酒的主发酵时间可以控制在用于啤酒酿造，试验表明，啤酒的主发酵时间可以控制在24h以内，后酵时间缩短到以内，后酵时间缩短到7d左右，比传统工艺缩短一左右，比传统工艺缩短一半以上，酿成的啤酒口味纯正、泡沫性良好，各项理半以上，酿成的啤酒口味纯正、泡沫性良好，各项理化指标均符合标准。化指标均符合标准。现在学习的是第64页，共92页（二）（二）固定化酶用于啤酒澄清固定化酶用于啤酒澄清 啤酒中含有多肽和多酚物质，在长期放置过程中，会发啤酒中含有多肽和多酚物质，在长

41、期放置过程中，会发生聚合反应，使啤酒变混浊。在啤酒中添加木瓜蛋白酶生聚合反应，使啤酒变混浊。在啤酒中添加木瓜蛋白酶等蛋白酶，可以水解其中的蛋白质和多肽，防止出现混等蛋白酶，可以水解其中的蛋白质和多肽，防止出现混浊。但是，如果水解作用过度，会影响啤酒泡沫的保持浊。但是，如果水解作用过度，会影响啤酒泡沫的保持性。性。Witt等人（等人（1970年）用戊二醛交联法对木瓜蛋白酶固定化，年）用戊二醛交联法对木瓜蛋白酶固定化，可连续水解啤酒中的多肽。将经预过滤的啤酒在可连续水解啤酒中的多肽。将经预过滤的啤酒在0和和-1下及一定二氧化碳压力，通过木瓜蛋白酶的反应柱，得下及一定二氧化碳压力，通过木瓜蛋白酶的反

42、应柱，得到的啤酒可在长期贮存中保持稳定。到的啤酒可在长期贮存中保持稳定。现在学习的是第65页，共92页（三）（三）添加蛋白酶和葡萄糖氧化酶，提高啤酒添加蛋白酶和葡萄糖氧化酶，提高啤酒稳定性稳定性 1、添加蛋白酶提高啤酒稳定性、添加蛋白酶提高啤酒稳定性通过蛋白酶来降解啤酒中的蛋白质，提高啤酒稳定通过蛋白酶来降解啤酒中的蛋白质，提高啤酒稳定性。目前主要采用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶。多数性。目前主要采用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶。多数是在成熟啤酒过滤之前，与酒液混合进过滤机，或是在成熟啤酒过滤之前，与酒液混合进过滤机，或者直接加入清酒罐中。者直接加入清酒罐中。每每1kg固定化木瓜蛋白酶可处理啤酒固定化木瓜

43、蛋白酶可处理啤酒1t以上，在连续式反以上，在连续式反应器中，可连续使用应器中，可连续使用3个月以上。个月以上。现在学习的是第66页，共92页2、添加葡萄糖氧化酶，提高啤酒稳定性和保质期。、添加葡萄糖氧化酶，提高啤酒稳定性和保质期。啤酒中多酚类物质的氧化不仅加速了混浊物质的形成，而啤酒中多酚类物质的氧化不仅加速了混浊物质的形成，而且使啤酒色泽加深，影响啤酒风味。且使啤酒色泽加深，影响啤酒风味。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖生成葡萄糖酸，同时消耗了葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖生成葡萄糖酸，同时消耗了氧，起到了脱氧作用。葡萄糖氧化酶的存在可以去除啤氧，起到了脱氧作用。葡萄糖氧化酶的存在可以去除啤酒中的溶氧和成

44、品酒中瓶颈氧，阻止啤酒氧化变质、防酒中的溶氧和成品酒中瓶颈氧，阻止啤酒氧化变质、防止老化、保持啤酒原有风味、延长保质期。实践证明，止老化、保持啤酒原有风味、延长保质期。实践证明，添加葡萄糖氧化酶后的啤酒溶氧量大幅度减少，老化减添加葡萄糖氧化酶后的啤酒溶氧量大幅度减少，老化减轻，口感好，澄清度高，可延长保质期轻，口感好，澄清度高，可延长保质期12个月。个月。现在学习的是第67页，共92页啤酒原料大麦中含有啤酒原料大麦中含有-葡聚糖葡聚糖，含量约，含量约5-8。适量的。适量的-葡聚糖是构成啤酒酒体和泡沫的重要成分，但过多的葡聚糖是构成啤酒酒体和泡沫的重要成分，但过多的-葡葡聚糖会使麦芽汁难于过滤，

45、降低出汁率，易使麦芽汁浑浊。聚糖会使麦芽汁难于过滤，降低出汁率，易使麦芽汁浑浊。同时在发酵阶段，过量的同时在发酵阶段，过量的-葡聚糖可与蛋白质结合，使葡聚糖可与蛋白质结合，使啤酒酵母产生沉降，影响发酵的正常进行。如果成品啤酒酵母产生沉降，影响发酵的正常进行。如果成品啤酒啤酒-葡聚糖含最超标，容易形成雾浊或凝胶沉淀，严重影葡聚糖含最超标，容易形成雾浊或凝胶沉淀，严重影响产品质量。响产品质量。（四）葡聚糖酶提高啤酒的持泡性（四）葡聚糖酶提高啤酒的持泡性现在学习的是第68页，共92页双乙酰即丁二酮（双乙酰即丁二酮（CH3COCOCH3）的含量多少是影响啤酒风）的含量多少是影响啤酒风味的重要因素，是品

46、评啤酒是否成熟的主要依据，在一定程度上味的重要因素，是品评啤酒是否成熟的主要依据，在一定程度上决定着啤酒的质量，双乙酰由决定着啤酒的质量，双乙酰由-乙酰乳酸经非酶氧化脱羧形成，乙酰乳酸经非酶氧化脱羧形成，是啤酒酵母在发酵过程中形成的代谢副产物。是啤酒酵母在发酵过程中形成的代谢副产物。一般成品啤酒的双乙酰含量不得超过一般成品啤酒的双乙酰含量不得超过0.1mg/L，否则会使，否则会使啤酒带有不愉快的馊味。啤酒带有不愉快的馊味。-乙酰乳酸脱羧酶可使乙酰乳酸脱羧酶可使-乙酰乳酸乙酰乳酸转化为转化为3羟基丙酮，改变了羟基丙酮，改变了-乙酰乳酸转化途径，从而有效乙酰乳酸转化途径，从而有效地降低啤酒中双乙酰

47、的含量，加快啤酒的成熟。地降低啤酒中双乙酰的含量，加快啤酒的成熟。（五）（五）降低啤酒中双乙酰含量降低啤酒中双乙酰含量现在学习的是第69页，共92页与普通啤酒相比，干啤酒具有发酵度高、残糖量低、热量低，干爽与普通啤酒相比，干啤酒具有发酵度高、残糖量低、热量低，干爽及饮后无余味等特点。及饮后无余味等特点。啤酒生产主要原料麦芽中含淀粉啤酒生产主要原料麦芽中含淀粉55-65，辅料大米含淀粉，辅料大米含淀粉71-73，这些淀粉主要依靠麦芽自身的，这些淀粉主要依靠麦芽自身的-淀粉酶、淀粉酶、-淀粉酶淀粉酶的水解作用而生成以麦芽糖为主的可发酵性糖。正常麦汁中，的水解作用而生成以麦芽糖为主的可发酵性糖。正常

48、麦汁中，可发酵性糖只占总糖的可发酵性糖只占总糖的75-80，占总浸出物的，占总浸出物的65-73。仅靠麦芽中的酶进行糖化，很难达到麦汁发酵度仅靠麦芽中的酶进行糖化，很难达到麦汁发酵度75以上的指标。以上的指标。通过添加通过添加-淀粉酶、异淀粉酶、糖化酶、普鲁兰酶等酶制剂，淀粉酶、异淀粉酶、糖化酶、普鲁兰酶等酶制剂，可以提高发酵度，酿造干啤酒。可以提高发酵度，酿造干啤酒。（六）（六）改进工艺，生产干啤酒改进工艺，生产干啤酒现在学习的是第70页，共92页橘苷酶可用于分解柑橘类果肉和果汁中的柚皮苷以除橘苷酶可用于分解柑橘类果肉和果汁中的柚皮苷以除去苦味，同时有效防止柑橘类罐头食品出现白色浑浊；去苦味

49、，同时有效防止柑橘类罐头食品出现白色浑浊；果胶酶可用于果酒、果汁的澄清；果胶酶可用于果酒、果汁的澄清；纤维素酶可将传统工艺中的果皮渣进行综合利用，促进纤维素酶可将传统工艺中的果皮渣进行综合利用，促进果汁的提取与澄清，提高可溶性固形物含量。果汁的提取与澄清，提高可溶性固形物含量。二、二、改进果酒、果汁饮料的生产工艺改进果酒、果汁饮料的生产工艺现在学习的是第71页，共92页苹果经压榨后其果汁中仍然含较多的不溶性果胶而呈浑浊苹果经压榨后其果汁中仍然含较多的不溶性果胶而呈浑浊状，通过外加酶制剂，即可澄清果汁。具体做法是在浑浊状，通过外加酶制剂，即可澄清果汁。具体做法是在浑浊果汁内加入果胶酶并轻轻搅拌，

50、在酶作用下，不溶性果胶果汁内加入果胶酶并轻轻搅拌，在酶作用下，不溶性果胶渐渐凝聚成絮状物析出，从而可以获得清澈的琥珀色苹果渐渐凝聚成絮状物析出，从而可以获得清澈的琥珀色苹果汁。有的苹果因果肉柔软难以压出果汁，添加果胶酶可大汁。有的苹果因果肉柔软难以压出果汁，添加果胶酶可大大促进果汁的提取。通常把果肉搅拌大促进果汁的提取。通常把果肉搅拌1530min后，直接添后，直接添加加0.04果胶酶，并于果胶酶，并于45下处理下处理10min，即可多产果汁，即可多产果汁1224。还可以把纤维素酶与果胶酶结合使用，使果肉全部液。还可以把纤维素酶与果胶酶结合使用，使果肉全部液化，用于生产苹果汁、胡萝卜汁和杏仁乳