发酵工艺原理PPT课件.ppt

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1、关于发酵工艺原理第一张，PPT共四十一页，创作于2022年6月第一节 微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长第二张，PPT共四十一页，创作于2022年6月二：工业化菌种的要求q 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物q 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染它种微生物或噬菌体q 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致

2、病 菌无关）q 生产特性要符合工艺要求第三张，PPT共四十一页，创作于2022年6月放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：第二节 已工业化产品生产菌的介绍第四张，PPT共四十一页，创作于2022年6月二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：第

3、五张，PPT共四十一页，创作于2022年6月HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节和异亮氨酸的合成调节机制机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶第六张，PPT共四十一页，创作于2022年6月氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌第七张，PPT共四十一页，创作于2022年6月三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一

4、个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌第八张，PPT共四十一页，创作于2022年6月三、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌q 生长迅速、蛋白产量高;q 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；q 外源基因的导入相对容易；q 已建立了整套表达理论及技术.第九张，PPT共四十一页，创作于2022年6月(二)真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)q 生长迅速，营养要求不高，易培养；q 安全性好；

5、q 比哺乳动物细胞操作简单；q 具有一定的修饰蛋白的能力。第十张，PPT共四十一页，创作于2022年6月 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统q 具有准确的转录后修饰功能；q 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；q 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；q CHO很少分泌自身的内源蛋白。第十一张，PPT共四十一页，创作于2022年6月微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Eli lilly),花了1

6、0年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：第十二张，PPT共四十一页，创作于2022年6月第三节 自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取土样的采取 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题：第十三张，PPT共四十一页，创作于2022年6月二、采样时要注意的问题q 气候、水分、空气q 来源要广q 结合产品的特点

7、q 标签：地点、时间、气候等第十四张，PPT共四十一页，创作于2022年6月富集的三种方案：q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法第十五张，PPT共四十一页，创作于2022年6月定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，表2-2（P31）但主要是通过培养的方法第十六张，PPT共四十一页，创作于2022年6月定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、

8、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。第十七张，PPT共四十一页，创作于2022年6月四、菌落的选出q 从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）q 从形态的角度 菌菌落落的的外外观观形形态态，是是微微生生物物的的一一个个重重要要表表征征。如如多多糖糖产产生生菌菌在在适适当当的的培培养养基基上上生生长长，从从具具有有粘粘液液性性的的菌菌落落外外观观上上就就可可以以初初步步识别。识别。第十八张，PPT

9、共四十一页，创作于2022年6月实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型第十九张，PPT共四十一页，创作于2022年6月例：醛肟水解酶的筛选例：

10、醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落第二十张，PPT共四十一页，创作于2022年6月五、目的微生物富集方法的研究进展q 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同同 源性分析，基因序列分析及源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等杂交技术等

11、q 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的微生物的 多样性及资源的开发多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。仍然是今后若干年的研究重点。2002,陈文新（科学院院士）陈文新（科学院院士）q In contrast to this traditional approach,modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening,which also enables access to enzymes of nonculturable org

12、anisms.By this strategy,for instance,the company Diversa(San Diego,CA,USA)identised 120 unique esterases/lipases from only 16%of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.FEMS Microbiology Reviews 26(2002)7381第二十一张，PPT共四十一页，创作于2022年6月第四节 菌株选育、分子改造目的q 提高生产能力提高生产能力q 提高产品质量提高产品质量q 开发新产品开发新产品q

13、 解决生产实际问题解决生产实际问题q 防止菌种退化防止菌种退化第二十二张，PPT共四十一页，创作于2022年6月方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等第二十三张，PPT共四十一页，创作于2022年6月自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9自然突变有两种情况自然突变有两种情况：一一种种是是我我们们生生产产上上所所不不希希望望看看到到的的，表表现现为为菌菌株株的的衰衰退退和和生生产产质质量的下降，这种突变成为负突变量的下降，这种突变成为负突变。

14、另另一一种种是是我我们们生生产产上上希希望望看看到到的的，对对生生产产有有利利，这这种种突突变变成成为正突变。为正突变。一、自然选育一、自然选育第二十四张，PPT共四十一页，创作于2022年6月自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回回复复突突变变：高高产产菌菌株株在在传传代代的的过过程程中中，由由于于自自然然突突变变导导致致高高产产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变问题：问题：高产菌株是正突变高，还

15、是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？第二十五张，PPT共四十一页，创作于2022年6月自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验第二十六张，PPT共四十一页，创作于2022年6月二、诱变育种二、诱变育种用用各各种种物物理理、化化学学的的因因素素人人工工诱诱发发基基因因突突变变进进行行的的筛筛选选，称称为为诱诱变变育种育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物

16、体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍第二十七张，PPT共四十一页，创作于2022年6月（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂的选择诱变剂的选择出发菌株的选择出发菌株的选择（一）、诱变剂的作用原理（略）（一）、诱变剂的作用原理（略）压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH第二十八张，PPT共四十一页，创作于2022年6月（三）、诱变育种的一般步骤（三）、诱变育种的一

17、般步骤(p83)（四）、筛选的方法（四）、筛选的方法q 随机筛选随机筛选q 形态形态q 理性化筛选理性化筛选从从产产物物形形成成的的生生理理生生化化途途径径着着手手，进进行行有有的的放放矢矢的的筛筛选选。如如结结构构类类似似物物抗抗性性、营营养养缺缺陷陷型型等等，筛筛选选而而产产生生的的这这些些特特性性，称称为为遗遗传传标标记。记。结结构构类类似似物物：在在化化学学和和空空间间结结构构上上和和代代谢谢的的中中间间物物（终终产产物物）相相似似，因因而而在在代代谢谢调调节节方方面面可可以以代代替替代代谢谢中中间间物物（终终产产物物）的的功功能能，但但细胞不能以其作为自身的营养物质。细胞不能以其作为

18、自身的营养物质。第二十九张，PPT共四十一页，创作于2022年6月HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型营养缺陷型：如Thr缺陷型第三十张，PPT共四十一页，创作于2022年6月黄色短杆菌黄色短杆菌F9-50的诱变谱系的诱变谱系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-)lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (leu-,Thr-)20.8 g/lF9

19、-50(leu-,Thr-,AEC r)33.5 g/l第三十一张，PPT共四十一页，创作于2022年6月三、基因的直接进化三、基因的直接进化(directed evolution)q 突变 基因突变库的建立基因突变库的建立q 筛选 基因突变库的筛选基因突变库的筛选q 基因复制与遗传步骤：在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。第三十二张，PPT共四十一页，创作于2022年6月主要应用：酶学性能的提高:q pHq 温度q 有机溶剂生理环境工业催化环境q 底物专一性第三十三张，PPT共四十一页，创作于2022年6月脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPL

20、A光学拆分选择性(%)2 31 57 75 81 905次错位PCR 2次定点突变Reetz(1997)Liebeton(2000)第二章 菌种的来源第三十四张，PPT共四十一页，创作于2022年6月定点突变第三十五张，PPT共四十一页，创作于2022年6月错位PCR第三十六张，PPT共四十一页，创作于2022年6月DNA Shuffling:指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。第三十七张，PPT共四十一页，创作于2022年6月X XXX X XX X XX X XXX X XX XX XXX XX X X XX X XXX XX

21、 XXX XX X X XX X XXX X XX X XX XXX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select bestwith DNAseI fragments recombinantsRepeat for multiple cyclesDNA shuffling第三十八张，PPT共四十一页，创作于2022年6月项目项目进化速度进化速度进化对象进化对象进化进化周期周期影响对象影响对象突变效率突变效率常规定向常规定向进化进化缓慢进化缓慢进化整个基因组整个基因组多年多年完整基因组完整基因组低低DNADNAShufflingShuffling快速进

22、化快速进化特定基因特定基因/操纵子操纵子/病毒病毒几天几天部分基因组部分基因组高高DNA Shuffling与常规定向进化的比较第三十九张，PPT共四十一页，创作于2022年6月类类 型型示示 例例特特 性性活性增加倍数活性增加倍数潜在应用领域潜在应用领域抗抗 体体人源抗体人源抗体亲和性亲和性400400生物制药生物制药酶酶天冬氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶催化特异性催化特异性1010，000000生物制药生物制药-内酰胺酶内酰胺酶抗生素抗性抗生素抗性3232，000000抗生素抗生素枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E E耐热性耐热性6565耐热时间耐热时间1717200200工业酶工业酶细胞细胞因子因子人类干扰素人类干扰素抗病毒抗病毒285285，000000基因治疗基因治疗肿瘤抑制因子肿瘤抑制因子P53P533737半衰期半衰期1212基因治疗基因治疗代谢代谢途径途径砷酸盐代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒砷酸盐解毒4040生物制药生物制药汞代谢途径汞代谢途径汞解毒汞解毒1212生物制药生物制药部分DNA Shuffling技术的研究成果第四十张，PPT共四十一页，创作于2022年6月感谢大家观看第四十一张，PPT共四十一页，创作于2022年6月