蛋白质分离纯化和定性定量分析PPT课件.ppt

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1、关于蛋白关于蛋白质的分离的分离纯化与定性定量分析化与定性定量分析第一张，PPT共一百页，创作于2022年6月什么是蛋白什么是蛋白质的分离的分离纯化化vv分离：将蛋白分离：将蛋白分离：将蛋白分离：将蛋白质质混合物分成混合物分成混合物分成混合物分成单单一的蛋白成分。一的蛋白成分。一的蛋白成分。一的蛋白成分。v纯化：得到化：得到单一蛋白的一蛋白的纯品。品。第二张，PPT共一百页，创作于2022年6月为什么要什么要纯化蛋白化蛋白质？vv研究特定蛋白研究特定蛋白研究特定蛋白研究特定蛋白质质的生物学功能（的生物学功能（的生物学功能（的生物学功能（酶酶、生物活性蛋、生物活性蛋、生物活性蛋、生物活性蛋白，白，

2、白，白，etc）vv制制制制备备抗体抗体抗体抗体v蛋白蛋白蛋白蛋白质质晶体学研究晶体学研究晶体学研究晶体学研究v研究蛋白研究蛋白质-蛋白蛋白蛋白蛋白质质相互作用相互作用相互作用相互作用第三张，PPT共一百页，创作于2022年6月怎怎样纯化蛋白化蛋白质？v生化学家根据特定蛋白生化学家根据特定蛋白生化学家根据特定蛋白生化学家根据特定蛋白质质与其他蛋白与其他蛋白与其他蛋白与其他蛋白质质的的的的性性性性质质差异差异差异差异，来分离或，来分离或纯化它。化它。v可溶性、等可溶性、等可溶性、等可溶性、等电电点、分子大小、生物学性点、分子大小、生物学性点、分子大小、生物学性点、分子大小、生物学性质质 可溶性：

3、硫酸可溶性：硫酸可溶性：硫酸可溶性：硫酸铵铵沉淀沉淀沉淀沉淀 等等等等电电点：离子交点：离子交点：离子交点：离子交换层换层析析析析 分子大小：凝胶分子大小：凝胶分子大小：凝胶分子大小：凝胶过滤层过滤层析析析析 生物学性生物学性生物学性生物学性质质：亲亲和和和和层层析析析析第四张，PPT共一百页，创作于2022年6月蛋白蛋白质纯化的基本化的基本设计原原则v原料原料原料原料应应易得到，并尽可能富含目的蛋白；易得到，并尽可能富含目的蛋白；易得到，并尽可能富含目的蛋白；易得到，并尽可能富含目的蛋白；v应有有特异性的蛋白特异性的蛋白质检测方法（最重要的因方法（最重要的因素，决定了素，决定了纯化能否成功）

4、化能否成功）；vv分分分分级级分离，先粗后分离，先粗后分离，先粗后分离，先粗后细细；vv纯纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。化条件尽量温和，避免蛋白失活。化条件尽量温和，避免蛋白失活。化条件尽量温和，避免蛋白失活。第五张，PPT共一百页，创作于2022年6月蛋白蛋白质的的检测方法方法vv蛋白蛋白蛋白蛋白质质的活性的活性的活性的活性检测检测方法：必方法：必方法：必方法：必须须快，必快，必快，必快，必须须是特异性是特异性是特异性是特异性的的的的vv蛋白蛋白蛋白蛋白质质的免疫学的免疫学的免疫学的免疫学检测检测方法：方法：方法：方法：western-blotwestern-blot，前提是，前提是，前提

5、是，前提是有特异的抗体有特异的抗体有特异的抗体有特异的抗体第六张，PPT共一百页，创作于2022年6月分离分离纯化的一般程序化的一般程序1.前前处理（取决于采用的材料）理（取决于采用的材料）动动物材料物材料物材料物材料处处理：剔除理：剔除理：剔除理：剔除结缔组织结缔组织和脂肪和脂肪和脂肪和脂肪组织组织 种子种子种子种子处处理：去种皮，有机溶理：去种皮，有机溶理：去种皮，有机溶理：去种皮，有机溶剂剂脱脂脱脂脱脂脱脂 动动物物物物细细胞破碎：匀胞破碎：匀胞破碎：匀胞破碎：匀浆浆器、超声波器、超声波器、超声波器、超声波处处理理理理 植物植物组织：研磨，：研磨，纤维素素酶 细细菌破碎：超声波，溶菌菌破

6、碎：超声波，溶菌菌破碎：超声波，溶菌菌破碎：超声波，溶菌酶酶vv如果蛋白如果蛋白如果蛋白如果蛋白质质定位于某一定位于某一定位于某一定位于某一细细胞器，可用差速离心法将其分胞器，可用差速离心法将其分胞器，可用差速离心法将其分胞器，可用差速离心法将其分离。离。离。离。第七张，PPT共一百页，创作于2022年6月相对离心力相对离心力/g时间时间/min沉降的组分沉降的组分1 0005真核细胞真核细胞4 00010叶绿体、细胞碎片、叶绿体、细胞碎片、细胞核细胞核15 00020线粒体、细菌线粒体、细菌30 00030溶酶体、细菌细胞溶酶体、细菌细胞碎片碎片100 000310 h核糖体核糖体第八张，P

7、PT共一百页，创作于2022年6月第九张，PPT共一百页，创作于2022年6月2.粗分粗分级分离（分离（roughrough fractionationfractionation）获获得蛋白得蛋白得蛋白得蛋白质质提取液后，用一定方法，将蛋白提取液后，用一定方法，将蛋白提取液后，用一定方法，将蛋白提取液后，用一定方法，将蛋白质质与其与其与其与其它它它它杂杂蛋白分离开来。蛋白分离开来。蛋白分离开来。蛋白分离开来。常用方法：常用方法：常用方法：常用方法：盐盐析析析析、等、等、等、等电电点沉淀、有机溶点沉淀、有机溶点沉淀、有机溶点沉淀、有机溶剂剂分分分分级级分离分离分离分离等等等等 特点：特点：特点：

8、特点：简简便、便、便、便、处处理量大、既能除去大量理量大、既能除去大量理量大、既能除去大量理量大、既能除去大量杂质杂质（包括脱（包括脱（包括脱（包括脱盐盐），又能，又能，又能，又能浓缩浓缩蛋白蛋白蛋白蛋白质质溶液。溶液。溶液。溶液。第十张，PPT共一百页，创作于2022年6月3.细分分级分离（分离（finefine fractionation）主要方法：主要方法：主要方法：主要方法：层层析析析析：凝胶：凝胶：凝胶：凝胶过滤过滤、离子交、离子交、离子交、离子交换层换层析、吸附析、吸附析、吸附析、吸附层层析、析、析、析、亲亲和和和和层层析等析等析等析等 第十一张，PPT共一百页，创作于2022年6

9、月1.蛋白蛋白质的的层析分离析分离第十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月层析（析（chromatography）vchrome意意为“色彩色彩”，graphygraphy源自希腊文，意源自希腊文，意源自希腊文，意源自希腊文，意为为“写写写写”。“层层析析析析”就是就是就是就是“色色色色谱谱”。vv层层析最早由俄国植物学家析最早由俄国植物学家析最早由俄国植物学家析最早由俄国植物学家 于于19031903年年年年创创造，造，造，造，19411941年年英国学者英国学者Martin和和SyngeSynge提出分配提出分配提出分配提出分配层层析，此后析，此后析，此后析，此后这这种方种方种方种方

10、法得到很大的法得到很大的法得到很大的法得到很大的发发展。展。展。展。v层析是利用物析是利用物质在在固定相固定相固定相固定相与与与与流流流流动动相相相相之之间不同的分配不同的分配比例，达到分离目的的技比例，达到分离目的的技术。第十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月v固定相固定相：固定相是：固定相是：固定相是：固定相是层层析的基析的基析的基析的基质质。通常是固体（如吸附。通常是固体（如吸附。通常是固体（如吸附。通常是固体（如吸附剂剂，凝胶，离子交，凝胶，离子交，凝胶，离子交，凝胶，离子交换剂换剂等），能与待分离的化合物等），能与待分离的化合物等），能与待分离的化合物等），能与待分离的化合物

11、进进行行行行可逆的吸附，溶解，交可逆的吸附，溶解，交换等作用。等作用。v流流流流动动相相相相：在：在层析析过程中，程中，推推推推动动固定相上待分离的物固定相上待分离的物固定相上待分离的物固定相上待分离的物质质朝着一个方向移朝着一个方向移朝着一个方向移朝着一个方向移动动的液体、气体的液体、气体的液体、气体的液体、气体等，都称等，都称等，都称等，都称为为流流流流动动相。相。相。相。柱柱柱柱层层析中一般称析中一般称析中一般称析中一般称为为洗脱洗脱洗脱洗脱剂剂，薄，薄，薄，薄层层层层析析析析时时称称称称为为展展展展层剂层剂。第十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月按操作形式不同分按操作形式不同分

12、类：柱柱柱柱层层析析析析：将固定相装于柱内，使：将固定相装于柱内，使：将固定相装于柱内，使：将固定相装于柱内，使样样品沿一个方向移品沿一个方向移品沿一个方向移品沿一个方向移动动而而而而达到分离。达到分离。达到分离。达到分离。纸层析：用析：用滤纸做液体的做液体的载体，点体，点样后，用流后，用流动相展相展开，以达到分离开，以达到分离鉴定的目的。定的目的。薄薄层层析：将适当粒度的吸附析：将适当粒度的吸附剂铺成薄成薄层，以，以纸层析析类似的方法似的方法进行物行物质的分离和的分离和鉴定。定。纸层纸层析和薄析和薄析和薄析和薄层层层层析主要适用于小分子物析主要适用于小分子物析主要适用于小分子物析主要适用于小

13、分子物质质的快速的快速的快速的快速检测检测分分分分析和少量分离制析和少量分离制析和少量分离制析和少量分离制备备，通常，通常，通常，通常为为一次性使用；一次性使用；一次性使用；一次性使用；柱柱柱柱层层析是常用的析是常用的析是常用的析是常用的层层析形式析形式析形式析形式，适用于，适用于，适用于，适用于样样品分析、分离。生物品分析、分离。生物品分析、分离。生物品分析、分离。生物化学中常用的凝胶化学中常用的凝胶化学中常用的凝胶化学中常用的凝胶层层析、离子交析、离子交析、离子交析、离子交换层换层析、析、析、析、亲亲和和和和层层析、高析、高析、高析、高效液相色效液相色效液相色效液相色谱谱等都通常采用柱等都

14、通常采用柱等都通常采用柱等都通常采用柱层层析形式。析形式。析形式。析形式。第十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月第十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月怎怎样纯化蛋白化蛋白质？vv生化学家根据特定蛋白生化学家根据特定蛋白生化学家根据特定蛋白生化学家根据特定蛋白质质与其他蛋白与其他蛋白与其他蛋白与其他蛋白质质的性的性的性的性质质差差差差异，来分离或异，来分离或异，来分离或异，来分离或纯纯化它。化它。化它。化它。v可溶性、等可溶性、等可溶性、等可溶性、等电电点、分子大小、生物学性点、分子大小、生物学性点、分子大小、生物学性点、分子大小、生物学性质质 可溶性：硫酸可溶性：硫酸可溶性：硫

15、酸可溶性：硫酸铵铵沉淀沉淀沉淀沉淀 等等等等电电点：离子交点：离子交点：离子交点：离子交换层换层析析析析 分子大小：凝胶分子大小：凝胶分子大小：凝胶分子大小：凝胶过滤层过滤层析析析析 生物学性生物学性生物学性生物学性质质：亲亲和和和和层层析析析析第十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月1.离子交离子交换层析析vv离子交离子交离子交离子交换层换层析利用物析利用物析利用物析利用物质质的的的的电电荷与荷与荷与荷与层层析析析析载载体（离子交体（离子交体（离子交体（离子交换剂换剂）电电荷之荷之荷之荷之间间的相互作用而达到分离的相互作用而达到分离的相互作用而达到分离的相互作用而达到分离纯纯化的目的，

16、属于吸附化的目的，属于吸附化的目的，属于吸附化的目的，属于吸附层层析。析。析。析。vv离子交离子交离子交离子交换层换层析的固定相称析的固定相称析的固定相称析的固定相称为为离子交离子交离子交离子交换剂换剂，由，由，由，由基基基基质质和和和和基基基基团团两部分两部分两部分两部分组组成。成。成。成。基基基基质质：纤维纤维素、素、素、素、琼琼脂糖、葡聚糖、苯乙脂糖、葡聚糖、苯乙脂糖、葡聚糖、苯乙脂糖、葡聚糖、苯乙烯烯-二乙二乙二乙二乙烯烯苯苯苯苯等高分子聚合物；等高分子聚合物；等高分子聚合物；等高分子聚合物；基基团：共价：共价结合在基合在基质上的上的带电基基团，可分，可分为正正电基基团和和和和负电基基

17、团。第十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月第十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月Ion-Exchange chromatographyIf pH mobile phase=7.2 Then charge of the proteins:(-)(-)(+)(+)-+-+Anion exchange column=+charged第二十张，PPT共一百页，创作于2022年6月Increased salt concentrationIon-Exchange chromatography-+-Na+Na+Na+Na+Na+Na+Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-+-Na+Na+Na+

18、第二十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月基本操作基本操作过程程1.样样品制品制品制品制备备，装柱与平衡，装柱与平衡，装柱与平衡，装柱与平衡2.2.上上上上样样（样样品溶解于品溶解于品溶解于品溶解于A A液中）液中）液中）液中）3.3.洗脱：穿透峰，洗脱峰洗脱：穿透峰，洗脱峰洗脱：穿透峰，洗脱峰洗脱：穿透峰，洗脱峰4.4.收集、收集、收集、收集、鉴鉴定定定定第二十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月离子交离子交换层析有两种洗脱方式析有两种洗脱方式vv分步洗脱分步洗脱分步洗脱分步洗脱：用：用：用：用间间断地断地断地断地递递增的不同离子增的不同离子增的不同离子增的不同离子强强度的流度的

19、流度的流度的流动动相分次相分次相分次相分次洗脱洗脱洗脱洗脱样样品蛋白的方法；品蛋白的方法；品蛋白的方法；品蛋白的方法；vv梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱：连续连续改改改改变变流流流流动动相离子相离子相离子相离子强强度的方法。度的方法。度的方法。度的方法。v目前随着目前随着目前随着目前随着层层析的自析的自析的自析的自动动化，梯度洗脱成化，梯度洗脱成化，梯度洗脱成化，梯度洗脱成为为大多数情况下大多数情况下大多数情况下大多数情况下的首的首的首的首选选方案。方案。方案。方案。第二十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月分步洗脱分步洗脱第二十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月梯度洗脱梯度洗

20、脱第二十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月2.凝胶凝胶过滤层析析vv利用分子量不同的蛋白利用分子量不同的蛋白利用分子量不同的蛋白利用分子量不同的蛋白质质，通，通，通，通过过凝胶分子凝胶分子凝胶分子凝胶分子筛时筛时速度不同速度不同速度不同速度不同来分离蛋白来分离蛋白来分离蛋白来分离蛋白质质的方法。的方法。的方法。的方法。v固定相：凝胶固定相：凝胶固定相：凝胶固定相：凝胶颗颗粒（粒（粒（粒（gelgel beadbead），多孔的网状），多孔的网状），多孔的网状），多孔的网状结结构，其网构，其网构，其网构，其网孔决定了凝胶的孔决定了凝胶的孔决定了凝胶的孔决定了凝胶的分分分分级级分离范分离范

21、分离范分离范围围，即能被，即能被，即能被，即能被该该凝胶分离的蛋凝胶分离的蛋凝胶分离的蛋凝胶分离的蛋白白白白质质混合物的混合物的混合物的混合物的MMr r范范范范围围，如，如，如，如Sephadex G-50Sephadex G-50的分离范的分离范的分离范的分离范围围是是是是150015003000030000。vv常用的凝胶有常用的凝胶有常用的凝胶有常用的凝胶有SephadexSephadex、Sepharose、SephacrylSephacryl、SuperdexSuperdex等。等。等。等。第二十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月Size-exclusion chromat

22、ography第二十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月Size-exclusion chromatographyAbsorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions.You can also perform an enzyme specific assay.第二十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月1.要根据待分离物要根据待分离物质的分子量，的分子量，选择特定的凝胶特定的凝胶过滤基基质；2.2.凝胶凝胶凝胶凝胶过滤层过滤层析不析不析不析不仅仅可用于可用于可用于可用于亲亲水性分子的分离，也可用水性分子的

23、分离，也可用水性分子的分离，也可用水性分子的分离，也可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分离于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分离于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分离于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分离时时，该该类层类层析往往被称析往往被称析往往被称析往往被称为为“凝胶通透凝胶通透凝胶通透凝胶通透层层析析析析”；3.凝胶凝胶凝胶凝胶过滤层过滤层析可提供析可提供析可提供析可提供样样品的分子量信息；品的分子量信息；品的分子量信息；品的分子量信息；4.4.凝胶凝胶凝胶凝胶过滤过滤的的的的上上上上样样量量量量一般在柱床体一般在柱床体一般在柱床体一般在柱床体积积的的的的1 15；5.凝胶凝

24、胶凝胶凝胶过滤过滤的的的的样样品品品品浓浓度度度度越大越好，但一般不要超越大越好，但一般不要超过100mg/ml100mg/ml。凝胶凝胶过滤的注意事的注意事项第二十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月第三十张，PPT共一百页，创作于2022年6月3.亲和和层析析vv以以以以样样品的生物活性品的生物活性品的生物活性品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的特依据的分离方法。生物分子的特点是有点是有专一的活性，如一的活性，如酶与底物的与底物的结合，抗原与抗体，合，抗原与抗体，激素与受体，糖与凝集素激素与受体，糖与凝集素等。等。等。等。v将上述作用体系的一方将上述作用体系的一方将上述作用体系的

25、一方将上述作用体系的一方连连接到接到接到接到层层析基析基析基析基质质上，使之上，使之上，使之上，使之固定化固定化固定化固定化，就有可能分离就有可能分离纯化化专一作用的另一方。一作用的另一方。第三十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月Affinity chromatographyMakes use of specific binding interactions between molecules 1-Incubate crude sample with the immobilized ligand 2-Wash away non bound sample components from

26、solid support 3-Elute 第三十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月vCommonly used affinity columns:Commonly used affinity columns:Ni2+Ni2+binds to poly Histines(example 6xHis)binds to poly Histines(example 6xHis)Specific antibodies(anti-Flag tag)Specific antibodies(anti-Flag tag)glutathione glutathione binds to GST bind

27、s to GST Protein A or G Protein A or G binds antibodies binds antibodiesAffinity chromatography第三十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月vPossible elution strategies:pHpH Ion strenghIon strengh DenatureDenature Competitor ligand or analogCompetitor ligand or analogAffinity chromatography第三十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月Ni-NTA

28、 columnsThe high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged The high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged proteins or peptides is due to:proteins or peptides is due to:1-the strength with which these ions are held to the NTA resin1-the strength with which these ions are held to the NTA

29、 resinNTA has a tetradentate chelating group that occupies four of six sites in the nickel coordination sphere第三十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月2-the specificity of the interaction between histidine residues and immobilized nickel ions第三十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月第三十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月vv在各种表达在各种表达在各种表达在各种表达载载体上都

30、体上都体上都体上都带带有各种有各种有各种有各种标签标签蛋白蛋白蛋白蛋白，如，如GST-tagGST-tag、His-tagHis-tag、V5-tagV5-tag等，它等，它等，它等，它们们不不不不仅仅可用于可用于可用于可用于鉴鉴定蛋白表达与定蛋白表达与定蛋白表达与定蛋白表达与否，更可用于与之相否，更可用于与之相否，更可用于与之相否，更可用于与之相连连的目的目的目的目标标蛋白的蛋白的蛋白的蛋白的纯纯化；化；化；化；vv通通通通过过免疫免疫免疫免疫亲亲和和和和层层析技析技析技析技术术，只需一步，即可，只需一步，即可，只需一步，即可，只需一步，即可纯纯化化化化带带有有有有标标签签的目的目的目的目标

31、标蛋白。蛋白。蛋白。蛋白。亲和和层析是析是基因工程基因工程中中最常用最常用的的纯化技化技术第三十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月1.1.高效与高效与高效与高效与简简便便便便：一旦固定化配体制：一旦固定化配体制备好后，操作使用好后，操作使用非常方便；非常方便；2.2.亲亲和和和和层层析是高度析是高度析是高度析是高度浓缩浓缩的的的的过过程；程；程；程；3.可从可从样品中品中去除大量去除大量去除大量去除大量杂质杂质；4.可在活性物可在活性物质中去除理化性中去除理化性质几乎完全相同的但几乎完全相同的但已失活的那些已失活的那些“杂质”。亲和和层析的析的优点点第三十九张，PPT共一百页，创作于2

32、022年6月1.免疫免疫亲和和层析析：将蛋白：将蛋白：将蛋白：将蛋白质质抗体偶抗体偶抗体偶抗体偶联联到免疫到免疫到免疫到免疫亲亲和柱可用和柱可用和柱可用和柱可用于抗原蛋白的于抗原蛋白的于抗原蛋白的于抗原蛋白的纯纯化；化；化；化；2.2.凝集素凝集素凝集素凝集素亲亲和和和和层层析析析析：凝集素是一大：凝集素是一大：凝集素是一大：凝集素是一大类类能能能能专专一性和糖一性和糖一性和糖一性和糖类类和糖和糖和糖和糖复合物复合物复合物复合物结结合的蛋白合的蛋白合的蛋白合的蛋白质质，固定化凝集素可用于糖蛋白，固定化凝集素可用于糖蛋白，固定化凝集素可用于糖蛋白，固定化凝集素可用于糖蛋白纯纯化；化；化；化；3.

33、3.染料染料染料染料亲亲和和和和层层析析析析：有多种染料可与各种：有多种染料可与各种类型的型的酶结合，合，又不受又不受酶的作用，可用于多种蛋白的分离。的作用，可用于多种蛋白的分离。亲和和层析中的三大通用技析中的三大通用技术第四十张，PPT共一百页，创作于2022年6月4.疏水疏水层析与反向析与反向层析析vv蛋白蛋白蛋白蛋白质质具有具有具有具有亲亲水与疏水两重性，如果在水与疏水两重性，如果在水与疏水两重性，如果在水与疏水两重性，如果在层层析基析基析基析基质质上接上上接上上接上上接上疏水的基疏水的基疏水的基疏水的基团团，就能在一定条件下与某些蛋白，就能在一定条件下与某些蛋白质的疏的疏水基水基团相互

34、作用，使之吸附，而达到分离相互作用，使之吸附，而达到分离纯化的目化的目的。的。v一般情况下，是一般情况下，是一般情况下，是一般情况下，是高高盐吸附吸附（1 12M 硫酸硫酸硫酸硫酸铵铵），降低流），降低流），降低流），降低流动动相的相的相的相的盐浓盐浓度，使度，使度，使度，使样样品洗脱。品洗脱。品洗脱。品洗脱。vv疏水疏水疏水疏水层层析的机制与离子交析的机制与离子交析的机制与离子交析的机制与离子交换层换层析正好相反，因此两者是互析正好相反，因此两者是互析正好相反，因此两者是互析正好相反，因此两者是互补补的。的。的。的。第四十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月vv反向反向反向反向层层析，

35、或称析，或称析，或称析，或称反相色反相色谱，reverse phasephase chromatographychromatography，是液相色，是液相色谱分析中最常用的技分析中最常用的技术。v当反相色当反相色当反相色当反相色谱谱用于蛋白用于蛋白用于蛋白用于蛋白质质分离分离分离分离时时，其原理与疏水，其原理与疏水，其原理与疏水，其原理与疏水层层析析析析基本相同，区基本相同，区基本相同，区基本相同，区别别在于：在于：在于：在于：疏水疏水疏水疏水层层析的配基疏水性析的配基疏水性析的配基疏水性析的配基疏水性较较弱（苯基等），所以高弱（苯基等），所以高弱（苯基等），所以高弱（苯基等），所以高盐盐吸

36、附，低吸附，低吸附，低吸附，低盐盐洗脱；洗脱；洗脱；洗脱；反相色反相色反相色反相色谱谱配基疏水性配基疏水性配基疏水性配基疏水性强强（C18C18等），所以需要使用有等），所以需要使用有等），所以需要使用有等），所以需要使用有机溶机溶机溶机溶剂剂洗脱。洗脱。洗脱。洗脱。反向反向层析与疏水析与疏水层析原理相同析原理相同第四十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月反相色反相色谱分离蛋白分离蛋白质的原理的原理第四十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月反相色反相色谱是是最高效最高效的蛋白的蛋白质层析技析技术之一之一第四十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月第四十五张，PPT共一百页，创作

37、于2022年6月2.蛋白蛋白质的的电泳分离泳分离第四十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月电泳（泳（electrophoresis）vv带电带电粒子在粒子在粒子在粒子在电场电场中向与自身中向与自身中向与自身中向与自身电电荷相反的荷相反的荷相反的荷相反的电电极移极移极移极移动动的的的的现现象象象象称称称称为电为电泳。泳。泳。泳。vv蛋白蛋白蛋白蛋白质质是两性是两性是两性是两性电电解解解解质质，在不同，在不同，在不同，在不同pHpH溶液中溶液中带不同不同电荷，荷，在直流在直流电场中能中能够泳泳动。第四十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月电泳基本原理泳基本原理vv蛋白蛋白蛋白蛋白质质在

38、在在在电场电场中泳中泳中泳中泳动时动时，受到两种方向相反的力的作用：，受到两种方向相反的力的作用：，受到两种方向相反的力的作用：，受到两种方向相反的力的作用：v电场力力 FqEqE，q q为带电为带电量，量，量，量，E E为电场强为电场强度度度度v摩擦力摩擦力摩擦力摩擦力 F Fffvfv，f f为摩擦系数，摩擦系数，v v为为迁移速度迁移速度迁移速度迁移速度vv当蛋白当蛋白当蛋白当蛋白质质以恒速运以恒速运以恒速运以恒速运动时动时，F FF Ff f0，即，即，即，即qEqEfvfv，此，此时：v/Ev/Eq/fq/fq q/6 r r 第四十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月vv在一

39、定介在一定介在一定介在一定介质质中，蛋白中，蛋白中，蛋白中，蛋白质质的的的的q/fq/f是一个定是一个定是一个定是一个定值值，因此，因此，因此，因此v/Ev/E也是也是定定值，它被称，它被称为电电泳迁移率泳迁移率泳迁移率泳迁移率，即：，即：vv v/Ev/Evv 可通可通可通可通过实验测过实验测定，蛋白定，蛋白定，蛋白定，蛋白质质的的的的 值为值为0.1100.110-4-4 1.0101.010-4-4 cmcm2 2V-1s s-1，它是蛋白，它是蛋白，它是蛋白，它是蛋白质质的特性之一。的特性之一。的特性之一。的特性之一。第四十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月电泳的分泳的分类vv

40、自由自由自由自由电电泳（移泳（移泳（移泳（移动动界面界面界面界面电电泳）泳）泳）泳）v区区带电泳泳：在支持物上，蛋白：在支持物上，蛋白：在支持物上，蛋白：在支持物上，蛋白质质混合物被分离成若干区混合物被分离成若干区混合物被分离成若干区混合物被分离成若干区带带。vv稳态电稳态电泳泳泳泳：蛋白：蛋白质迁移一段迁移一段时间后达到后达到稳态，带的的宽度不再随度不再随时间而改而改变。第五十张，PPT共一百页，创作于2022年6月1.聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳v凝胶由丙凝胶由丙凝胶由丙凝胶由丙烯酰烯酰胺（胺（胺（胺（AcrAcr）和甲叉双丙）和甲叉双丙）和甲叉双丙）和甲叉双丙烯酰烯酰胺（胺（胺（胺（b

41、is）经经共共共共聚合而成，此聚合而成，此聚合而成，此聚合而成，此过过程在程在程在程在TEMEDTEMED和和和和过过硫酸硫酸硫酸硫酸铵铵催化下催化下催化下催化下进进行。行。行。行。vvAcrAcr在在在在APAP和和和和TEMED的作用下形成的作用下形成的作用下形成的作用下形成单链单链，随后通，随后通，随后通，随后通过过bisbis的作的作的作的作用交叉互用交叉互用交叉互用交叉互联联形成网状形成网状形成网状形成网状结结构，聚合成凝胶。构，聚合成凝胶。构，聚合成凝胶。构，聚合成凝胶。v凝胶的孔径可在凝胶的孔径可在凝胶的孔径可在凝胶的孔径可在较宽较宽范范范范围围内内内内变变化，以迎合不同的分离化

42、，以迎合不同的分离化，以迎合不同的分离化，以迎合不同的分离需要。需要。需要。需要。第五十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月第五十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月vv根据凝胶的均匀性（孔径、根据凝胶的均匀性（孔径、根据凝胶的均匀性（孔径、根据凝胶的均匀性（孔径、pH）可分）可分）可分）可分为连续为连续与不与不与不与不连续连续两两两两类类；vv根据是否加蛋白根据是否加蛋白根据是否加蛋白根据是否加蛋白质变质变性性性性剂剂，可分，可分，可分，可分为变为变性与非性与非性与非性与非变变性两性两性两性两类类；vv根据是否加根据是否加根据是否加根据是否加还还原原原原剂剂2-2-巯基乙醇或基乙

43、醇或DTTDTT，可分，可分，可分，可分为还为还原与原与原与原与非非非非还还原两原两原两原两类类；v还可根据可根据电泳装置的不同，分泳装置的不同，分为圆盘电泳和平板泳和平板电泳。泳。PAGE的分的分类第五十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月平板平板PAGE第五十四张，PPT共一百页，创作于2022年6月vv不不不不连续连续平板平板平板平板PAGEPAGE，是使用，是使用 最广泛的蛋白最广泛的蛋白质电泳技泳技术，它由，它由浓缩胶与分离胶两部分胶与分离胶两部分组成。成。v不不不不连续连续PAGEPAGE有很高的分辨力，因有很高的分辨力，因有很高的分辨力，因有很高的分辨力，因为为它有以下三种

44、效它有以下三种效它有以下三种效它有以下三种效应应：浓缩效效应电荷效荷效应分子分子筛效效应不不连续PAGE第五十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月制制备凝胶凝胶样样品品品品电电泳泳泳泳目的蛋白目的蛋白目的蛋白目的蛋白检测检测基本操作基本操作第五十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月染色法：考染色法：考马斯亮斯亮蓝染色法（多种染色法（多种类型可型可选）、）、银染法；染法；活性活性活性活性检测检测法：适用于法：适用于法：适用于法：适用于Native PAGENative PAGE，其中蛋白，其中蛋白，其中蛋白，其中蛋白质质保持天保持天保持天保持天然活性，可用然活性，可用然活性，可用然活

45、性，可用酶酶学方法学方法学方法学方法检测检测；免疫印迹法：用特异性抗体免疫印迹法：用特异性抗体免疫印迹法：用特异性抗体免疫印迹法：用特异性抗体检测检测蛋白蛋白蛋白蛋白质质的技的技的技的技术术。PAGE的的检测方法多种多方法多种多样第五十七张，PPT共一百页，创作于2022年6月2.等等电聚焦聚焦电泳泳vv根据蛋白根据蛋白根据蛋白根据蛋白质质的等的等的等的等电电点点点点进进行分离的一种技行分离的一种技行分离的一种技行分离的一种技术术。v基本原理：利用基本原理：利用两性两性两性两性电电解解解解质载质载体体体体形成一个形成一个形成一个形成一个连续连续而而而而稳稳定的定的定的定的线线性性性性pHpH梯

46、度，使梯度，使梯度，使梯度，使pHpH从正极到从正极到从正极到从正极到负负极逐极逐极逐极逐渐渐增加。蛋白增加。蛋白增加。蛋白增加。蛋白质质分子分子分子分子在偏离其等在偏离其等在偏离其等在偏离其等电电点的点的点的点的pHpH位置位置位置位置带电带电，因此在，因此在，因此在，因此在电场电场中可以移中可以移中可以移中可以移动动；当蛋白当蛋白当蛋白当蛋白质质移移移移动动到到到到pHpH等于等于等于等于pI位点，其静位点，其静位点，其静位点，其静电电荷荷荷荷为为0 0，在，在，在，在电场电场中不再移中不再移中不再移中不再移动动，据此可将不同，据此可将不同，据此可将不同，据此可将不同pI的蛋白的蛋白的蛋白

47、的蛋白质质分离。分离。分离。分离。第五十八张，PPT共一百页，创作于2022年6月第五十九张，PPT共一百页，创作于2022年6月1.优点点样样品加品加品加品加样样位置和体位置和体位置和体位置和体积积不受限制；不受限制；不受限制；不受限制；分辨率高于其它分辨率高于其它分辨率高于其它分辨率高于其它类类型型型型电电泳泳泳泳；可可可可测测定定定定pIpI值值；2.缺点缺点缺点缺点样样品在品在品在品在pIpI区域易沉淀，区域易沉淀，为增加增加样品溶解度，可品溶解度，可以在胶中加入尿素，但以在胶中加入尿素，但导致蛋白致蛋白质失活；失活；样样品前品前品前品前处处理麻理麻理麻理麻烦烦。等等电聚焦的聚焦的优缺

48、点缺点第六十张，PPT共一百页，创作于2022年6月3.双向双向电泳泳v将等将等将等将等电电聚焦技聚焦技聚焦技聚焦技术术与与与与SDS-PAGESDS-PAGE技技技技术组术组合起来的新技合起来的新技合起来的新技合起来的新技术术，是目前分离蛋白是目前分离蛋白是目前分离蛋白是目前分离蛋白质质混合物最混合物最混合物最混合物最强强大的技大的技大的技大的技术术，也是蛋白，也是蛋白，也是蛋白，也是蛋白质组质组学研究的重要技学研究的重要技学研究的重要技学研究的重要技术术。v基本步基本步基本步基本步骤骤：第一相等：第一相等：第一相等：第一相等电电聚焦后，在等聚焦后，在等聚焦后，在等聚焦后，在等电电聚焦的垂直

49、的聚焦的垂直的聚焦的垂直的聚焦的垂直的方向方向方向方向进进行第二相行第二相行第二相行第二相SDS-PAGESDS-PAGE。第六十一张，PPT共一百页，创作于2022年6月pH 3 pH 3 -10 10（1 1）IEFIEF等电聚焦电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳（2 2）SDS-PAGESDS-PAGE（3 3）染色脱色染色脱色染色脱色染色脱色第六十二张，PPT共一百页，创作于2022年6月考考考考马马斯亮斯亮斯亮斯亮蓝蓝银银银银 染染染染第六十三张，PPT共一百页，创作于2022年6月可可综合利用合利用层析和析和电泳分离泳分离纯化蛋白化蛋白质第六十四张，PPT共一百页，创作于20

50、22年6月第六十五张，PPT共一百页，创作于2022年6月蛋白蛋白质的的浓缩1.1.超超超超滤滤法法法法使用特制薄膜使用特制薄膜使用特制薄膜使用特制薄膜对对溶液中的溶溶液中的溶溶液中的溶溶液中的溶质质分子分子分子分子进进行行行行选择选择性性性性过滤过滤的的的的技技技技术术。常用离心力使蛋白常用离心力使蛋白常用离心力使蛋白常用离心力使蛋白质质透透透透过滤过滤膜，而使蛋白膜，而使蛋白膜，而使蛋白膜，而使蛋白质质截留在膜截留在膜截留在膜截留在膜内。内。内。内。第六十六张，PPT共一百页，创作于2022年6月2.2.冷冷冷冷冻冻干燥法干燥法干燥法干燥法在冷在冷在冷在冷冻冻状状状状态态下使下使下使下使样