平面色谱法级药学PPT课件.ppt
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1、关于平面色谱法级药学关于平面色谱法级药学第一张,PPT共五十七页,创作于2022年6月第一节第一节 平面色谱法的分类和原理平面色谱法的分类和原理第二节第二节 薄层色谱法薄层色谱法第三节第三节 纸色谱法纸色谱法本章内容本章内容第二张,PPT共五十七页,创作于2022年6月第一节平面色谱法的分类和原理第一节平面色谱法的分类和原理一、平面色谱法的分类一、平面色谱法的分类 组分在以平面为载体的固定相和流动相之间吸附或分配平衡组分在以平面为载体的固定相和流动相之间吸附或分配平衡而进行的一种色谱方法。而进行的一种色谱方法。按操作方式 1薄层色谱法(thin layer chromatography)2 纸
2、色谱法(paper chromatography)3 薄层电泳法(thin layer electrophoresis)吸附薄层色谱法分配薄层色谱法分子排阻薄层色谱法等等按分离机制第三张,PPT共五十七页,创作于2022年6月二二 平面色谱法参数平面色谱法参数1.定性参数:反映组分的保留行为定性参数:反映组分的保留行为2.相平衡参数:描述分离过程相平衡参数:描述分离过程3.面效参数:衡量分离效能面效参数:衡量分离效能4.分离参数:衡量分离条件的优劣分离参数:衡量分离条件的优劣第四张,PPT共五十七页,创作于2022年6月(一)(一)定性参数定性参数1 比移值比移值(Retardation fa
3、ctor,Rf值值)溶质移动距离与流动相移动距离之比。溶质移动距离与流动相移动距离之比。Rf=L/L0 (适宜范围(适宜范围0.20.8,最佳,最佳0.30.5)L原点至斑点中心的距离原点至斑点中心的距离 L0原点至溶剂前沿的距离原点至溶剂前沿的距离 展开溶剂原点L0L前沿第五张,PPT共五十七页,创作于2022年6月1 比移值比移值(Retardation factor,Rf值值)Rf数值与组分及色谱条件(薄层板活性,展开剂等)和温数值与组分及色谱条件(薄层板活性,展开剂等)和温度有关度有关 实验中满足下列条件,可获得真实实验中满足下列条件,可获得真实Rf值:值:a 展开槽密闭不泄露,薄层板
4、周围空间被展开剂蒸汽所饱和,无展开槽密闭不泄露,薄层板周围空间被展开剂蒸汽所饱和,无边缘效应边缘效应;b 沿分离轨迹固定相与流动相无梯度变化沿分离轨迹固定相与流动相无梯度变化;c 展开剂的前沿位置能正确测定。展开剂的前沿位置能正确测定。第六张,PPT共五十七页,创作于2022年6月2 相对比移值相对比移值(relative Rf;Rr)Rr=Rf(i)/Rf(s)=L(i)/L(s)与组分、色谱条件、参考物质有关。与组分、色谱条件、参考物质有关。Rr值可以大于值可以大于1,也可以小于,也可以小于1。重现性和可比性均比重现性和可比性均比Rf值好,能消除系统误差(值好,能消除系统误差(参考参考物质
5、与组分在完全相同的条件下展开)物质与组分在完全相同的条件下展开)第七张,PPT共五十七页,创作于2022年6月1 分配系数分配系数 K=2 保留因子保留因子 k=3 分配系数分配系数K、保留因子、保留因子 k与与Rf值的关系:值的关系:(二二)相平衡参数相平衡参数组分在固定相中的量组分在流动相中的量CsVsCmVmCsCmCs、Cm分别表示在达到分配平衡后,某物质在固定相和流动相中的浓度。第八张,PPT共五十七页,创作于2022年6月(三)面效参数(三)面效参数1 理论塔板数(理论塔板数(n)n=16(L/W)22 塔板高度(塔板高度(H)H=L0/n(四)分离参数(四)分离参数1 分离度(分
6、离度(R)R12 分离数(分离数(SN)R=1.177时,时,SN=L0/(b 0+b 1)-1,dW1W2Rf=0Rf=1前沿原点SN:7 10(一般TLC板)10 20(高效TLC板)第九张,PPT共五十七页,创作于2022年6月第二节薄层色谱法第二节薄层色谱法(thin layer chromatography;TLC)一一 定义、特点、主要类型定义、特点、主要类型二二 吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂三三 薄层色谱操作方法薄层色谱操作方法四四 定性和定量分析定性和定量分析五五 高效薄层色谱法高效薄层色谱法六六 薄层扫描法简介薄层扫描法简介七七 在药物研究中的应用
7、在药物研究中的应用第十张,PPT共五十七页,创作于2022年6月薄层色谱法特点:薄层色谱法特点:1 分析速度快,需十至几十分钟,同时展开多个试样。分析速度快,需十至几十分钟,同时展开多个试样。2 试样预处理简单,对试样限制少。试样预处理简单,对试样限制少。3 载样量比较大,适用于制备。载样量比较大,适用于制备。4 仪器简单,操作方便。仪器简单,操作方便。5 分离能力较强,分析结果直观。分离能力较强,分析结果直观。一一 薄层色谱法定义、特点及主要类型薄层色谱法定义、特点及主要类型定义:定义:将吸附剂或载体涂布成一均匀薄层,点样,(密闭的容将吸附剂或载体涂布成一均匀薄层,点样,(密闭的容器中)展开
8、,斑点显色,(与对照物质比较)进行定性定量。器中)展开,斑点显色,(与对照物质比较)进行定性定量。第十一张,PPT共五十七页,创作于2022年6月薄层色谱法的主要类型薄层色谱法的主要类型1 吸附薄层色谱法吸附薄层色谱法原理原理:组分在薄层板上吸附、解吸组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。附、再吸附、再解吸附的过程。吸附系数吸附系数 Ka 大小不同实现分离大小不同实现分离 极性强的组分极性强的组分 Ka 大,大,Rf值小;值小;极性弱的组分极性弱的组分 Ka 小,小,Rf值大。值大。第十二张,PPT共五十七页,创作于2022年6月2 分配薄层色谱法分配薄层色谱法原理:多次分配的过
9、程,分配系数(溶解度)原理:多次分配的过程,分配系数(溶解度)大小不同实现分离大小不同实现分离分类:按流动相与固定相极性大小分类:按流动相与固定相极性大小(1)正相色谱 固定相:含水硅胶 流动相:有机溶剂。极性强的组分K大,Rf 值小。(2)反相色谱:固定相:烷基化学键合相 流动相:水有机溶剂。极性强的组分K小,Rf 值大。第十三张,PPT共五十七页,创作于2022年6月3 凝胶薄层色谱法:凝胶薄层色谱法:用葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等铺成薄层板进行大分用葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等铺成薄层板进行大分子化合物的分离。凝胶是具有一定孔径的网状结构物质,是子化合物的分离。凝胶是具有一定孔径的网状结
10、构物质,是利用其网孔大小把分子大小和形状不同的大分子化合物分开利用其网孔大小把分子大小和形状不同的大分子化合物分开(一般是分开成组,而不能分开为单一化合物),又称为排(一般是分开成组,而不能分开为单一化合物),又称为排阻或分子筛层析法。阻或分子筛层析法。4 胶束薄层色谱法胶束薄层色谱法(micellar TLC):用低浓度表面活性剂的水溶液为流动相,当所用的表面用低浓度表面活性剂的水溶液为流动相,当所用的表面活性剂水溶液需超过某一浓度(临界胶束浓度活性剂水溶液需超过某一浓度(临界胶束浓度CMC)时多余)时多余的表面活性剂不再溶解,而聚集成胶束(胶粒),因流动相为的表面活性剂不再溶解,而聚集成胶
11、束(胶粒),因流动相为胶体分散体系,故称为胶束液相色谱。胶体分散体系,故称为胶束液相色谱。薄层色谱法的主要类型薄层色谱法的主要类型第十四张,PPT共五十七页,创作于2022年6月二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂(一)吸附剂(一)吸附剂 1 硅胶硅胶:多孔性无定形粉末,表面带有硅醇基多孔性无定形粉末,表面带有硅醇基 (Si-OHSi-OH),呈弱酸性),呈弱酸性,表面表面pHpH5 5。原理:原理:硅醇基硅醇基(吸附中心吸附中心)与极性基团形成氢键与极性基团形成氢键 (吸附性)。组分与硅醇基形成氢键(吸附性)。组分与硅醇基形成氢键 (被吸附)的能力不同而分离。(被
12、吸附)的能力不同而分离。应用:应用:酸性和中性物质的分离,如有机酸酚类、酸性和中性物质的分离,如有机酸酚类、醛类等。醛类等。碱性物质与硅胶作用,展开时被吸附、碱性物质与硅胶作用,展开时被吸附、拖尾、甚至展不开。拖尾、甚至展不开。第十五张,PPT共五十七页,创作于2022年6月硅胶硅胶活度活度与含水量的关系:含水量高,活性级高,活度低。与含水量的关系:含水量高,活性级高,活度低。活化:活化:加热至加热至100左右,除去吸附水提高度。左右,除去吸附水提高度。(注意温度不可过高,硅醇基(注意温度不可过高,硅醇基硅氧基硅氧基)分离效率:分离效率:与其与其粒度粒度、孔径孔径及及表面积表面积等有关。等有关
13、。一般地一般地 (10-40(10-40m)(100nm)(400-600mm)(100nm)(400-600m2 2/g)/g)常用硅胶:常用硅胶:硅胶硅胶H H 不含黏合剂不含黏合剂硅胶硅胶G(Gypsum,G(Gypsum,石膏石膏):含煅石膏(:含煅石膏(CaSOCaSO4 41/2H1/2H2 2O O)硅胶硅胶GFGF254254:含煅石膏和一种无机荧光剂,即锰激活的硅酸锌,:含煅石膏和一种无机荧光剂,即锰激活的硅酸锌,在在254nm254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。第十六张,PPT共五十七页,创作于2022年6月2 2 氧化铝(氧化铝(活度也与
14、含水量有关)活度也与含水量有关)碱性氧化铝碱性氧化铝(pH9.0)分离中性或碱性化合物,如生物碱、脂溶性分离中性或碱性化合物,如生物碱、脂溶性维生素等;维生素等;中性氧化铝中性氧化铝(pH7.5)分离酸性及对碱不稳定的化合物;分离酸性及对碱不稳定的化合物;酸性氧化铝酸性氧化铝(pH4.0)酸性化合物的分离。酸性化合物的分离。第十七张,PPT共五十七页,创作于2022年6月3 3 聚酰胺聚酰胺聚己内酰胺:白色多孔性非晶型粉末聚己内酰胺:白色多孔性非晶型粉末酰胺基与化合物质子给体形成氢键而对化合物产生吸附。酰胺基与化合物质子给体形成氢键而对化合物产生吸附。应用:酚、酸、硝基、醌类等分离应用:酚、酸
15、、硝基、醌类等分离第十八张,PPT共五十七页,创作于2022年6月(二)展开剂(二)展开剂(流动相流动相)选择原则:选择原则:同吸附柱色谱,根据同吸附柱色谱,根据被分离物质的极性被分离物质的极性、吸附剂吸附剂活度活度、展开剂极性展开剂极性Stahl简图:例:极性物质 活度低(活性级大)的吸附剂 极性展开剂 第十九张,PPT共五十七页,创作于2022年6月 常用溶剂的极性强弱顺序常用溶剂的极性强弱顺序 水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳苯苯三氯乙烷四氯化碳 环己烷环己烷 石油醚石油醚极性强的溶剂,洗脱能力强
16、第二十张,PPT共五十七页,创作于2022年6月单一溶剂展开 分离效果Rf?Rf值太小:加极性强的溶剂,如乙醇、丙酮等;Rf值太大,加极性弱的溶剂,如环己烷、石油醚等;可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。展开剂展开剂混合溶剂混合溶剂第二十一张,PPT共五十七页,创作于2022年6月三、薄层色谱操作方法三、薄层色谱操作方法1 制板均匀制板均匀2 点样集中点样集中3 展开展开(多种方式多种方式)预饱和预饱和4 斑点定位斑点定位第二十二张,PPT共五十七页,创作于2022年6月1 薄层板的制备薄层板的制备(1 1)薄层板的选择)薄层板的选择表面光滑、平整、洁净,厚度一致表面光滑、平整、洁净,厚度一致
17、玻璃板、塑料板或铝箔玻璃板、塑料板或铝箔大小按实验需要选规格:大小按实验需要选规格:10 cm10 cm 10 cml5 cm 20 cm10 cm 20 cm20 cm 第二十三张,PPT共五十七页,创作于2022年6月(2 2)薄层板的涂布:)薄层板的涂布:将固定相、粘合剂和水,按比例混合均匀、无气泡的固定相匀浆均匀玻璃板(厚度为0.250.5mm)玻板置室温下水平台上晾干在反射光及透射光下检视薄层板表面应均匀,干整,无麻点、无气泡、无破损及污染。研磨涂布(使用涂布器、倾倒涂层、浸涂、喷涂)第二十四张,PPT共五十七页,创作于2022年6月(3)薄层板的活化)薄层板的活化一般活化:硅胶一般
18、活化:硅胶110烘烘30分钟,分钟,氧化铝氧化铝110烘烘45分钟分钟 强活化:强活化:硅胶硅胶150烘烘4h,氧化铝氧化铝180烘烘4h冷却后立即使用或置干燥箱中备用,或用商品预制板。冷却后立即使用或置干燥箱中备用,或用商品预制板。第二十五张,PPT共五十七页,创作于2022年6月2 点样点样样品溶液:浓度样品溶液:浓度0.010.010.10.1,溶剂:有机溶剂,如乙醇或溶剂:有机溶剂,如乙醇或甲醇等,避免用水;甲醇等,避免用水;点样工具:点样毛细管或微量注射器点样工具:点样毛细管或微量注射器点样基线距底边点样基线距底边1.0-1.5cm1.0-1.5cm样点一般为圆点,直径一般样点一般为
19、圆点,直径一般2-4mm2-4mm采用分量多次点,每次点样需自然干燥或电吹风吹干后,采用分量多次点,每次点样需自然干燥或电吹风吹干后,才能二次点样。才能二次点样。点样量点样量:几微升,薄层定量或薄层制备时,可几百微升几微升,薄层定量或薄层制备时,可几百微升点样时必须注意勿损伤薄层表面。点样时必须注意勿损伤薄层表面。第二十六张,PPT共五十七页,创作于2022年6月3 展开展开将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中,浸入展开将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中,浸入展开剂的深度为距原点剂的深度为距原点5mm5mm为宜,密闭,待展开至规定距离,除为宜,密闭,待展开至规定距离,除另有规定外,一般为
20、另有规定外,一般为8 815cm15cm,取出薄层板,标记溶剂前沿,取出薄层板,标记溶剂前沿,晾干,按具体试验的规定检测。晾干,按具体试验的规定检测。展开缸如需预先用展开剂预平衡,可在缸中加入适量的展开剂,展开缸如需预先用展开剂预平衡,可在缸中加入适量的展开剂,必要时并在壁上贴二条与缸一样高、宽的滤纸条,一端浸入展必要时并在壁上贴二条与缸一样高、宽的滤纸条,一端浸入展开剂中,盖严,使展开缸平衡。开剂中,盖严,使展开缸平衡。避免边缘效应。避免边缘效应。第二十七张,PPT共五十七页,创作于2022年6月边缘效应:边缘效应:同一组分在同一板上处同一组分在同一板上处于边缘斑点的于边缘斑点的Rf比处于中
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