血红蛋白提取和分离含PPT课件.ppt
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1、关于血红蛋白的提取和分离含第一张,PPT共三十二页,创作于2022年6月 本课题学习目标本课题学习目标 简述蛋白质提取和分离的基本原理,并了解凝胶色简述蛋白质提取和分离的基本原理,并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1 1、主要概念:、主要概念:、主要概念:、主要概念:凝胶色谱法凝胶色谱法 电泳法电泳法 缓冲溶液缓冲溶液 它它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.2.2.2.主要原理:主要原理:凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离电泳法分离样品的原理样品的原理 缓冲溶液
2、的组成和作用机理缓冲溶液的组成和作用机理3 3 3 3、课题重点:、课题重点:、课题重点:、课题重点:凝胶色谱法的原理和方法凝胶色谱法的原理和方法 4 4 4 4、课题难点:、课题难点:、课题难点:、课题难点:样品的预处理样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。的装填。第二张,PPT共三十二页,创作于2022年6月1.1.分离生物大分子的基本思路:分离生物大分子的基本思路:选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物理的方法分离具有不同物理或化学性质的或化学性质的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理:蛋白质分离和提取的原理:根据蛋白
3、质根据蛋白质各种特性各种特性的差异,如的差异,如分子的形状和大小、分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力分子的亲和力等等,可以用来分离等等,可以用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。基础知识基础知识第三张,PPT共三十二页,创作于2022年6月基础知识(一)基础知识(一)凝胶色谱法(凝胶色谱法(分配色谱法分配色谱法)2.凝胶:大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物(如(如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖)构成的)构成的多孔多孔小球体,小球体,内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。根据被分离的
4、蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小,利用具有的大小,利用具有网网状结构状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用,来进行分离。作用,来进行分离。1.概念:3.凝胶色谱法的原理 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子量较小当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;而相对而相对分子量较大分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在能在凝胶外部凝胶外部移动,路程移动,路程较短较短,移动速度,移动速度较快较快。相对分子质相对分
5、子质量不同量不同的蛋白质分子因此得以分离。的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是:依据的特性是:依据的特性是:依据的特性是:蛋白质分蛋白质分蛋白质分蛋白质分子量的大小。子量的大小。子量的大小。子量的大小。第四张,PPT共三十二页,创作于2022年6月4.4.凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质的原理和具体过程具体过程第五张,PPT共三十二页,创作于2022年6月凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示第六张,PPT共三十二页,创作于2022年6月 (二)缓冲溶液(二)缓冲溶液 1.1.概念概念:在一定的范围内,凡是能够抵制在一定的范围内,凡是能够抵制外加少量强外加少量强酸
6、或强碱酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响,值的影响,维持维持PHPH基本不变基本不变。2.2.作用作用:3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范范围内围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。4.4.提问:在本课题中使用的缓冲液是提问:在本课题中使用的缓冲液是:_:_:_:_,其目的是其目的是其目的是其目的是:利
7、用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境,保证环境,保证 血红蛋白的血红蛋白的正常结构和功能正常结构和功能,便于观察,便于观察(红色红色)和科和科 学研究学研究(活性活性活性活性)磷酸缓冲液磷酸缓冲液第七张,PPT共三十二页,创作于2022年6月 (三)(三)电泳:电泳:1.1.概念:概念:带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理:原理:许多重要的生物大分子,如多肽、许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的核酸等都具有可解离的基团,在一定的PHPH下,这些下,这些基团会带上正电或负电。基团会带上正电或负电。在电场
8、的作用下,这些在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质带电性质的差异的差异以及以及分子本身的大小,形状分子本身的大小,形状的不同,使带电分子产的不同,使带电分子产生不同的生不同的迁移速度迁移速度,从而实现样品中各种分子的分,从而实现样品中各种分子的分离离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。第八张,PPT共三十二页,创作于2022年6月 在电场的作用下,这些带电分子会向着在电场的作用下,这些带电分子会向着在电场
9、的作用下,这些带电分子会向着在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动与其所带电荷相反的电极移动与其所带电荷相反的电极移动与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图第九张,PPT共三十二页,创作于2022年6月聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 1 1、在测定蛋白质分子量时常用、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDSSDS)聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在甲叉双丙烯酰胺在引引
10、发剂发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。结构的凝胶。第十张,PPT共三十二页,创作于2022年6月 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响,净电荷对迁移率的影响,可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDSSDS。2.2.原理:原理:聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 SDSSDSSDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的。由几条肽链组成的蛋白质复合体蛋白
11、质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链,因此,因此测定的结果只是测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋能与各种蛋白质形成白质形成蛋白质蛋白质SDSSDSSDSSDS复合物复合物复合物复合物,SDSSDS所带负电荷的量大所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子大超过了蛋白质分子原有电荷量原有电荷量。因而掩盖了。因而掩盖了不同种蛋白不同种蛋白质间的电荷差别质间的电荷差别,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3.SDS3.SDS作用机理作用机理:第十一张,PPT共三十二页,创作于2022年6月用用SDSSD
12、S测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白测定蛋白质的分子量时,可选用一组质的分子量时,可选用一组已知分子量的标准已知分子量的标准蛋白蛋白同时进行电泳,根据已知分子量的标准蛋同时进行电泳,根据已知分子量的标准蛋白的白的电泳区带位置电泳区带位置,用,用电泳迁移率和分子量电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线的对数作标准曲线,可以测定,可以测定未知蛋白质未知蛋白质的的分子量。分子量。市场上有高分子量、次高分子量及市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。低分子量的标准蛋白试剂出售。第十二张,PPT共三十二页,创作于2
13、022年6月血血液液血浆血浆水水 分分其他物质:其他物质:血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细 胞胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞(最多)(最多)(最多)(最多)血红蛋白血红蛋白(90909090)两个两个 肽链肽链两个两个 一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团2.2.血液有哪些成分?血液有哪些成分?血液有哪些成分?血液有哪些成分?1.1.用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNADNADNA,用哺乳动物的红细胞提取血,用哺乳动物的红细胞提取血,用哺乳动物的红细胞提取血,用哺乳动
14、物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?红蛋白的原因是什么?红蛋白的原因是什么?红蛋白的原因是什么?鸡的红细胞具有细胞核,含有鸡的红细胞具有细胞核,含有鸡的红细胞具有细胞核,含有鸡的红细胞具有细胞核,含有DNADNADNADNA,便于进行,便于进行DNADNA的的的的提取;人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富,提取;人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富,提取;人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富,提取;人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富,便于提取血红蛋白。便于提取血红蛋白。便于提取血红蛋白。便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白第十三张,PPT
15、共三十二页,创作于2022年6月血红蛋白血红蛋白两个两个 肽链肽链两个两个 一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团,亚铁血红素基团,此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳,氧化碳,血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。血红蛋白的特点:血红蛋白的特点:第十四张,PPT共三十二页,创作于2022年6月 二、实验操作二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1.1.样品处理:样品处理:样品处理:样品处理:(一)蛋白质提取和分离步骤(一)蛋白质提取和分离步骤(二)操作过程(二)操
16、作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的动物的血液来分离血红蛋白。血液来分离血红蛋白。(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤:洗涤目的洗涤目的:去除杂蛋白,以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白,以利于后续血红蛋白的分离纯化,分离纯化,洗涤次数不可过少洗涤次数不可过少。洗涤操作:洗涤操作:洗涤操作:洗涤操作:1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间低速短时间离心(速度越高和离心(速度越高和时间越长,会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀,达不到分时间越长,会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀,达不到分离的效果)离的效果)3 3、吸取血浆:上层透明的黄色血浆。、吸取血浆:
17、上层透明的黄色血浆。4 4、盐水、盐水洗涤:用五倍体积的质量分数为洗涤:用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯化钠的氯化钠溶液洗涤。溶液洗涤。5 5、低速离心(低速短时间)、低速离心(低速短时间)6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次,直步骤三次,直至上清液中已至上清液中已没有黄色没有黄色,表明洗涤干净。,表明洗涤干净。第十五张,PPT共三十二页,创作于2022年6月初次离心后的结果第十六张,PPT共三十二页,创作于2022年6月3次洗涤后的结果第十七张,PPT共三十二页,创作于2022年6月(2)(2)(2)(2)血红蛋白的释放:血红蛋白的释放:血红蛋白的释放:血红蛋白的释放:加蒸馏水到加
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