酵母基因工程课件.pptx

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1、酵母基因工程第1页，此课件共45页哦主要内容第一节酵母基因工程表达体系酵母基因表达宿主系统酵母菌表达载体酵母菌的转化系统第二节常见的酵母基因表达系统第三节影响外源基因表达的因素第四节酵母基因工程应用举例第2页，此课件共45页哦第一节酵母基因表达体系宿主系统酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知菌类，共由56个属和500多个种组成。酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。第3页，此课件共45页哦作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求安全无毒，没有致病性。遗传背景清楚，容易进行遗传操作。外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。培养条件简单，容

2、易进行高密度发酵。有较强的蛋白质分泌能力。有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。第4页，此课件共45页哦酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统酵母菌是最简单的真核模式生物第5页，此课件共45页哦常用的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酿酒酵母属如酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）克鲁维酵亚母属如乳酸克鲁维酵

3、母（Kluyveromyces lactis）假丝酵母属 如产朊假丝酵母(Candida utilis)毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母属 如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe），解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。第6页，此课件共45页哦酵母菌表达宿主系统（1）酿酒酵母优点：酿酒酵母长期广泛地应用于食品工业，不产生毒素，安全性好，已被FDA认定为安全性生物，其表达产物不需经过大量宿主安全性实验生长迅速，工艺简单，成本低是真核生

4、物，可以对蛋白进行翻译后加工表达产物可分泌表达，易于纯化遗传背景清楚，易进行操作第7页，此课件共45页哦酵母菌表达宿主系统酿酒酵母的缺点：发酵时会产生乙醇，难以进行高密度发酵，直接导致外源基因很难达到很高的水平缺乏强有力的受严格调控的启动子，分泌的蛋白质能力较差酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌表达菌株传代不稳定，表达质粒易丢失分泌效率低，大于30KD的蛋白质几乎不分泌第8页，此课件共45页哦酵母菌表达宿主系统（2）乳酸克鲁维酵母表达系统可以高密度发酵，不需要甲醇防爆装置，工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再

5、繁殖能力。乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。第9页，此课件共45页哦酵母菌表达宿主系统（3）产朊假丝酵母食品及药品工业的安全生物不具有酵解抑制有氧氧化效应，因而在严格好气的条件下不会产生乙醇发酵密度高，在高密度发酵中细胞干重可以达到92g/L在廉价的糖蜜中就能生产，成本低第10页，此课件共45页哦酵母菌表达宿主系统（4）栗酒裂殖酵母裂殖酵母是子囊菌真核单细胞生物，是一类不能出芽生殖而只能以分裂和产孢子的方式繁殖的一类酵母

6、。与其他酵母相比，它具有更多的与高等真核生物相似的特性：线粒体结构，启动子结构，转录机制，对蛋白N-端乙酰化功能均更接近于哺乳动物细胞。已有多种蛋白利用此系统进行了表达，如人蛋白凝血因子VIIIa，人白细胞介素IL-6等。第11页，此课件共45页哦酵母菌表达宿主系统（5）巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。表达系统优势：生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可诱导表达。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因的高效表达在很大程度上取决于整

7、合拷贝数的多寡。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。第12页，此课件共45页哦酵母表达载体酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（shuttlevector）。酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时增殖和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoei

8、n的基因序列)，以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。第13页，此课件共45页哦酵母表达载体1酵母载体的基本结构DNA复制起始区：通常来自于2质粒的复制起始区及酵母基因组的自主复制序列筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选整合介导区:能有效介导载体与宿主之间发生同源重组有丝分裂稳定区表达盒：启动子，分泌信号序列，终止子第14页，此课件共45页哦酵母表达载体酿酒酵母中的2环状质粒环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs反向重复序列，600bpFLP编码产物驱动IRs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与

9、2质粒类似。第15页，此课件共45页哦酵母表达载体2酵母载体的种类酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体两类酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分类。分为下列五类：酵母整合型质粒YIp酵母附加体质粒YEp酵母复制型质粒YRp酵母着丝粒质粒YCp酵母人工染色体YAC第16页，此课件共45页哦酵母表达载体（1）酵母整合型质粒YIp：缺乏酵母的复制起始位点，不能在酵母中自主复制，含有酵母的筛选标记ura3基因。具有整合介导区，所以，它只有整合到酵母染色体中才能稳定。含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为Y

10、Ip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。第17页，此课件共45页哦酵母表达载体（2）酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2质粒DNA复制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数可达60-100。转化效率高。（3）酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制起始区(ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数可以达上百个。ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。以ARS为复制子的质粒称为YRp，以2质粒上的复制元件为复制子的质

11、粒称为YEp上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。第18页，此课件共45页哦酵母表达载体（4）酵母着丝粒质粒YCp：含有酵母染色体着丝粒的DNA片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性(d)。CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CENDNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp.YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。第19页，此课件共45页哦酵母表达载体（5）酵母人工染色体YAC：酵母人工染色体(yeastartificia

12、lchromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列（ARS）、着丝粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。YAC载体在宿主细胞中以线性双链DNA存在，具有高度的遗传稳定性。YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可接受100-1000kb的外源DNA片段。第20页，此课件共45页哦酵母表达载体YAC主要结构：两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4)；一个自主复制序列(ARS1)；两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymennathermophilp)的末

13、端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增；Ampr抗性及细菌质粒复制原点；一个EcoR克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4tRNA基因内。第21页，此课件共45页哦酵母菌转化方法原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允许DNA进入，然后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可达原生质体总数的1-2%。Li+盐转化方法：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母

14、有效，对毕赤酵母无效，毕赤酵母转化一般用氯化锂有效优点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA（相差80倍）第22页，此课件共45页哦酵母菌转化方法电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子和水进入细胞，也有利于外源DNA等大分子进入优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围广；转化率高（达105/gDNA）。PEG转化法：PEG1000聚乙二醇英文名polyethylene glycol化学结构：第23页，此课件共45页哦酵母菌转化方法用于转化子筛选的标记基因(1)营养缺陷型的互补基因营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和

15、核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA等但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难(2)显性标记基因其编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白第24页，此课件共45页哦酵母菌转化方法:显性标记基因标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型aph氨基糖苷转移酶抗G418cat氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1铜离子螯合物耐受铜离子suc2蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂第25页，此课件共45页哦第二节常见的酵母基因表达系统一、酿酒酵母表达系统1启动子组成型表达的启动子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）启动子、

16、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH或GAPl）启动子可控性启动子：半乳糖启动子（GAL）、酸性磷酸酶启动子（PHO）、乙醇脱氢酶（ADH2）启动子、Cu2+螯合蛋白启动子（CUPI）以及交配a型阻遏系统（MATa/a）第26页，此课件共45页哦第27页，此课件共45页哦酿酒酵母表达载体目前已建立的酿酒酵母表达载体有（1）酵母附加体质粒(YEp)（见右图）；（2）酵母复制型质粒(YRp)；（3）酵母着丝粒质粒(YCp)；（4）酵母整合型质粒(YIp)；（5）酵母人工染色体(YAC)。前三类统称为游离自主复制型质粒载体。含有来自酵母基因组的复制起始区ARS或者酵母天然质粒2复制起点序列，能够自主复制，通

17、常为多拷贝数第28页，此课件共45页哦酿酒酵母宿主突变株有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。如pep4-3突变株中蛋白酶的活性显著降低，对外源基因表达产物的降解作用较小。为了减少目的蛋白的过度糖基化，目前已从野生型的酿酒酵母中分离出许多类型的糖基化途径突变株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突变株、天门冬酰胺侧链糖基化缺陷的alg突变株以及外侧糖链缺陷型的och突变株等。在这些突变株中，具有重要实用价值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因为它们不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链。第29页，此课件共45页哦提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌突变类型生物效应作

18、用位点ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Yssc2提高重组蛋白表达转录后加工rgr1提高重组蛋白表达转录水平ose1提高重组蛋白表达转录水平rho-提高重组蛋白表达转录水平第30页，此课件共45页哦抑制超糖基化作用的突变宿主菌许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。能抑制超糖基化的突变类型突变类型生物效应mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天冬酰胺

19、侧链糖基化缺陷型och外侧糖链添加缺陷型第31页，此课件共45页哦二、毕赤酵母表达系统1.启动子（1）AOX1和AOX2启动子（2）三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldeyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）启动子（3）甲醛脱氢酶（formaldehydedehydrogenase,FLD）启动子第32页，此课件共45页哦2.毕赤酵母表达载体类型胞内表达载体pPICZA,B,C分泌型表达载体pPICZA,B,C第33页，此课件共45页哦3.载体的整合方式毕赤酵母表达载体上无酵母复制起点，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重组整合入酵母染色体DNA中，并随酵母

20、的生长传代稳定地存在。整合的方式可以是单交换插入，亦可双交换插入，一般来说前一种方式更容易发生。第34页，此课件共45页哦4宿主常用的毕赤酵母受体菌株有：组氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16，其中SMD1168为蛋白酶缺陷型，以其作为宿主表达蛋白可以降低表达产物的降解。这些表达宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生来的。最常用的受体菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一个组氨醇脱氢酶缺陷型基因His4，可接受含His4的载体而具有His+表型来筛选转化子。根据对甲醇利用的情况，毕赤酵母可划分为三种表型。菌株含有AOX1和AOX2基因

21、，在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似，称为甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；当AOX1被其他基因取代，则需依赖AOX2，但其甲醛代谢速度慢，称为甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。当AOX基因全部缺失，则不能利用甲醇，称为甲醇利用负表型（Mut-），如MC100-3。后两者胞内表达外源蛋白质有时优于野生株，且需甲醇较少。此外为增加分泌蛋白质稳定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4,prb1)。第35页，此课件共45页哦第三节影响外源基因表达的因素一、转录水平控制外源基因稳态mRNA的浓度二、表达载体的拷贝数和稳定性三、其他因素1.优化翻译

22、起始区前后mRNA的二级结构，提高外源基因mRNA的翻译活性2.酵母菌对密码子的偏爱性:在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码3.避免表达产物在细胞内的降解，选择或改造宿主，如：采用二倍体宿主、采用酿酒酵母以外的酵母菌作为宿主4.优化工程菌发酵工艺第36页，此课件共45页哦第四节酵母基因工程应用实例利用重组酵母生产乙肝疫苗急慢性乙型肝炎诱因乙型肝炎病毒（HBV）每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效

23、的治疗药物第37页，此课件共45页哦乙型肝炎病毒的结构与性质乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，病毒颗粒呈乙型肝炎病毒的结构球面状，直径为42nm，基因组仅为3.2kb。病毒颗粒的主要结构蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。此外，被乙肝病毒感染的人肝脏还能合成并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是各种未装配的包装蛋白的1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。第38页，此课件共45页哦乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因第39页，此课件共45页哦产乙肝表面抗原

24、的重组酿酒酵母乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的传统乙肝疫苗的制备乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞膜上提取出来的。这种来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效

25、作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S抗原缺乏响应的人群的免疫反应。第40页，此课件共45页哦产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母第41页，此课件共45页哦由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%。在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。第42页，此课件共45页哦转基因酵母合成青蒿

26、素第43页，此课件共45页哦小结酵母基因工程，是根据酵母密码子偏好从头设计后化学合成或者PCR扩增获得目的基因片段与载体DNA，经过体外酶切、连接和重组，然后采取适当的转化方法，将重组后的带有外源基因的载体DNA导入酵母细胞，并使其在酵母细胞内进行复制和表达，以达到预期的改变受体酵母细胞遗传特性或者获得基因工程表达产物的目的。主要研究内容包括目的基因克隆，确定合适的酵母基因工程受体菌与载体系统，采用相应转化方法以及转化子的筛选与表型鉴定，重组基因工程酵母中目标蛋白的诱导和表达。第44页，此课件共45页哦利用酵母表达外源蛋白既可以在胞内，也可以分泌到胞外。酿酒酵母和毕赤酵母已成为高等真核生物基因的优良宿主系统。针对不同的表达宿主菌开发了相应的表达载体。酿酒酵母表达载体有基于酵母基因组的复制起始区ARS或者酵母天然质粒2m复制起点序构建的游离自主复制型质粒载体，也有整合型载体。但是由于毕赤酵母表达载体上无酵母复制起点，它是靠同源重组将外源基因表达序列整合入受体细胞的染色体DNA上，构建稳定的毕赤酵母工程菌。第45页，此课件共45页哦