酶工程制药技术讲稿.ppt

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1、关于酶工程制药技术第一页，讲稿共一百三十三页哦第一节第一节 酶工程概论酶工程概论一、酶的特性一、酶的特性二、酶工程的研究内容二、酶工程的研究内容三、酶工程的研究进展及应用三、酶工程的研究进展及应用第二页，讲稿共一百三十三页哦酶的定义和分类酶的定义和分类酶的定义-酶是生物体内具有生物催化功能的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。酶的分类-分为6大类1、氧化-还原酶2、转移酶3、水解酶4、裂合酶5、异构酶6、连接酶（合成酶）第三页，讲稿共一百三十三页哦酶的特性酶的特性1、专一性强2、催化效率高3、反应条件温和4、酶活性的调控机制复杂醛糖还原酶的活性中心第四页，讲稿共一百三十三页哦酶的来源酶的来源（一）

2、来源类别（一）来源类别（二）利用微生物生产酶制剂的优点（二）利用微生物生产酶制剂的优点（三）各种能够生产酶的微生物（三）各种能够生产酶的微生物蚯蚓含蚓激酶，对心血管疾病有较好的治疗效果 第五页，讲稿共一百三十三页哦（一）来源类别（一）来源类别1、酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生物中，可以直接从生物体中分离提纯而获得，早期酶的生产多是以动植物为主要原料提取而得。2、人工合成酶的方法，目前还受到试剂、设备条件的限制。3、利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶，由于周期较长、成本较高，也存在一定难度。4、利用微生物生产酶制剂。第六页，讲稿共一百三十三页哦（二）利用微生物生产酶制剂的优点（

3、二）利用微生物生产酶制剂的优点（1）能够生产酶的微生物种类繁多，有较大的选择余地。（2）微生物繁殖快、培养周期短、培养方法简便，培养过程容易控制，（3）微生物具有较强的适应性，能够培育出新的高产菌株。第七页，讲稿共一百三十三页哦（三）各种能够生产酶的微生物（三）各种能够生产酶的微生物1、氧化-还原酶（1）葡萄糖氧化酶（来源于霉菌）（2）D氨基酸氧化酶（来源于霉菌、肾脏）（3）尿激酶（来源于酵母菌、肾脏）（4）过氧化氢酶（来源于细菌、霉菌、红血球）（5）近氧化物酶（来源于植物）2、转移酶（1）转氨基酶（来源于细菌、动物肝脏）（2）核苷磷酸转移酶（来源于细菌）3、水解酶4、裂合酶5、异构酶第八页，

4、讲稿共一百三十三页哦3、水解酶、水解酶脂肪酶（来源于细菌、霉菌、胰脏）5-磷酸二酯酶（来源于霉菌）淀粉酶（来源于细菌、霉菌、胰脏、麦芽）果胶酶（来源于细菌、霉菌）纤维素酶（来源于霉菌、蘑菇）半纤维素酶（来源于霉菌）溶菌酶（来源于细菌、鸡卵白）蜜二糖酶（来源于霉菌）乳糖酶（来源于细菌、霉菌）转化酶（来源于细菌、酵母）透明质酸酶（来源于细菌、动物睾丸）凝乳酶（来源于霉菌、小牛胃、羊胃）天冬酰胺酶（来源于细菌）脲酶（来源于豆科植物）青霉素酰化酶（来源于细菌、霉菌）氨基酰化酶（来源于细菌、霉菌、牛肾脏）橙皮苷酶（来源于霉菌）蛋白酶（来源于霉菌、放线菌、动物内脏、植物瓜果）第九页，讲稿共一百三十三页哦裂

5、合酶和异构酶裂合酶和异构酶4、裂合酶、裂合酶天冬氨酸-脱羧酶（来源于细菌）-酪氨酸酶（来源于细菌）延胡索酸酶（来源于细菌）谷氨酸脱羧酶（来源于细菌）5、异构酶、异构酶氨基酸消旋酶（来源于细菌、霉菌、酵母）葡萄糖异构酶（来源于细菌、放线菌第十页，讲稿共一百三十三页哦酶的生产菌种酶的生产菌种1、对生产菌种的要求、对生产菌种的要求2、目前常用的产酶微生物、目前常用的产酶微生物第十一页，讲稿共一百三十三页哦1、对生产菌种的要求、对生产菌种的要求（1）产酶量高（2）不是致病菌（3）性能稳定，不容易变异、退化、不易感染噬菌体。（4）能够利用廉价的原料，发酵周期短、易于培养。第十二页，讲稿共一百三十三页哦2

6、、目前常用的产酶微生物、目前常用的产酶微生物大肠杆菌-用来生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶。曲霉（黑曲霉、黄曲霉）-用来生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶、脂肪酶。枯草杆菌-用于生产a-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶。啤酒酵母-用来生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶。青霉菌-用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5-磷酸二酯酶、脂肪酶。木霉菌-用于生产纤维素酶。根霉菌-用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。链霉菌-用来生产葡萄糖异构酶。第十三页，讲稿共一百三十三页哦产酶菌株的制备和优化产酶菌株的制备和优化1、产酶菌株的培养条件、产酶菌株的培

7、养条件2、菌种的分离筛选、菌种的分离筛选3、菌种的变异诱导技术、菌种的变异诱导技术4、原生质体诱导实际生产例子、原生质体诱导实际生产例子第十四页，讲稿共一百三十三页哦1、产酶菌株的培养条件、产酶菌株的培养条件（1）产酶促进剂）产酶促进剂（2）影响酶产量的各种因素）影响酶产量的各种因素（3）诱导剂和抑制剂）诱导剂和抑制剂第十五页，讲稿共一百三十三页哦（1）产酶促进剂）产酶促进剂在酶制剂的生产过程中，如果添加少量的某种物质就能增加酶的产量，则这类物质就称为产酶促进剂。产酶促进剂多数是酶的诱导物、或者是表面活性剂，常用的产酶促进剂有：（A）吐温）吐温-80（B）脂肪酰胺磺酸钠）脂肪酰胺磺酸钠（C）聚

8、乙烯醇）聚乙烯醇（D）糖脂）糖脂（E）乙二胺四乙酸（）乙二胺四乙酸（EDTA）第十六页，讲稿共一百三十三页哦（2）影响酶产量的各种因素）影响酶产量的各种因素A、温度、温度-各种产酶微生物对于温度的要求是各不相同的。细菌：35-37度霉菌：30度酵母菌：30-35度B、PH值值-通过掌握原料的配比保持一定的C/N水平、或者通过添加缓冲剂、能够控制发酵液的PH值。C、通气量（供氧量）、通气量（供氧量）讫今为止，产酶和微生物都是需氧性的微生物。在液体深层发酵中，微生物利用的氧必须是溶解于培养基中和溶解氧。空气中的氧气-培养基溶解氧-透过细胞膜进入原生质。精确测定时采用溶氧仪。D、搅拌、搅拌-搅拌可将

9、泡沫打碎、增加氧气的溶解速度、加强了液体的湍流作用，有利于营养物质与菌体细胞的接触，促进细胞新陈代谢。E、泡沫、泡沫第十七页，讲稿共一百三十三页哦E、泡沫、泡沫酶制剂发酵过程中泡沫较多。泡沫的存在会阻止CO2的排除、同时直接影响O2的溶解。排除常常采用：机械力消泡沫法、化学消泡剂消泡沫法。常用的消泡剂有：天然油类、矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺天然油类、矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、磷酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷类、酰胺类、醚类、磷酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷等等物质。国内酶制剂工业常用的消泡剂为：甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚）泡

10、敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚）第十八页，讲稿共一百三十三页哦（3）诱导剂和抑制剂）诱导剂和抑制剂某些酶反应，当培养基中不存在诱导物质时，其酶的合成就受到抑制，而当添加诱导物质时，酶的合成就能顺利进行，这类物质称作诱导剂。使用某些酶的抑制剂常常能够促进酶的合成，如在多粘芽孢杆菌的培养基中添加淀粉酶抑制剂S-AI，能增加淀粉酶的产量。在酶的生产中，加入适量表面活性剂，也能提高酶制剂产量，如用爪哇真青霉生产纤维素酶时，如果添加0.1%的吐温-80，则纤维素酶的产量可提高4倍。第十九页，讲稿共一百三十三页哦2、菌种的分离筛选、菌种的分离筛选（1）含菌样品质采集（2）富集培养（3）菌种纯化第二十页，讲稿

11、共一百三十三页哦3、菌种的变异诱导技术、菌种的变异诱导技术（1）采用物理、化学方法进行诱导）采用物理、化学方法进行诱导物理方法-紫外线、X射线、-射线、高能电子、快速中子。化学方法-亚硝基胍、亚硝酸。（2）采用基因工程技术进行诱导）采用基因工程技术进行诱导德国的生物技术人员，提取出大肠杆菌的青霉素酰化酶基因，通过质粒pBR233，克隆到宿主大肠杆菌中，新构建的工程菌，其产酶能力提高了50倍。在国内，有人将产生葡萄糖异构酶的放线菌基因，通过质粒pBR233，克隆到宿主大肠杆菌中，新构建的工程菌，其表观活力提高了5倍。有人在研究霉菌的淀粉酶基因、或者纤维素基因克隆到酵母菌中，一旦获得成功，就能够利

12、用淀粉、纤维素为原料，以酵母菌作为载体，通过发酵来生产酒精。（3）采用原生质体融合技术进行诱导）采用原生质体融合技术进行诱导原生质体融合育种的频率要高于普通杂交的方法。不同种属之间也可进行融合。在曲霉与曲霉、青霉与青霉、链霉菌与链霉菌、芽孢杆菌与芽孢杆菌之间的融合应用较多。第二十一页，讲稿共一百三十三页哦4、原生质体诱导实际生产例子、原生质体诱导实际生产例子蛋白酶产生菌种之间的原生质体融合共分为7步：A、使用的亲本菌株、使用的亲本菌株B、菌株标记的获得、菌株标记的获得C、原生质体的制备、原生质体的制备D、细胞的再生、细胞的再生E、原生质的融合、原生质的融合F、融合子的继代培养、检验和生产性能、

13、融合子的继代培养、检验和生产性能第二十二页，讲稿共一百三十三页哦A、使用的亲本菌株、使用的亲本菌株二亲本为：（1）枯草杆菌AS1.398（2）地衣芽孢杆菌AS1.807二者都是野生型，对利福平和链霉素敏感。第二十三页，讲稿共一百三十三页哦B、菌株标记的获得、菌株标记的获得采用紫外线进行诱变，筛选营养缺陷型菌株、和抗药性菌株，经过十代以上传代，形成稳定的突变菌株。第二十四页，讲稿共一百三十三页哦C、原原生生质质体体的的制制备备二亲本接种入完全培养基，37摇瓶培养20小时离心收集菌体，悬浮于0。55mol的NaCl溶液中经4000r/min离心15分钟，洗涤2-3次，离心，弃去上清液菌体细胞悬浮于

14、SMM缓冲液中加入采用SMM液配制的溶菌酶1000单位/ml，置恒温水浴溶解细胞壁，定时取样镜检，并用计数板计数。待原生质球形成之后，以4000-6000r/min离心2次，每次15分钟，洗涤2-3次、离心放于无菌蒸馏水中，使原生质体膨胀适当稀释，涂布于完全培养基上32下、培养20小时得原生质体第二十五页，讲稿共一百三十三页哦D、细胞的再生、细胞的再生取原生质体，放入0.55mol的NaCl溶液之中适当稀释，涂布于完全培养基上32下、培养24小时得原生质体再生的细胞第二十六页，讲稿共一百三十三页哦E、原生质的融合、原生质的融合取等量的二亲本原生质体、加入SMM溶液混匀经4000r/min离心2

15、5分钟，弃上清液加入由SMM配制的、含30%的、分子量为6000的PEG2-4ml在40下搅匀、保温2-3分钟。加入3-10倍量的SMM缓冲液取适量（0.1-0.25ml/皿）涂布到含有二种抗生素的高渗完全培养基上，链霉素含量为2000单位/ml，利福平含量为10单位/ml，32下、培养20-36小时得初步的原生质体融合子第二十七页，讲稿共一百三十三页哦F、融合子的继代培养和检验和生产性能、融合子的继代培养和检验和生产性能将初步的原生质体融合子在含有链霉素+利福平的平板培养基上连续传代，可以检测出稳定的原生质体融合子。融合菌株的生产性能比亲株高出30%。第二十八页，讲稿共一百三十三页哦第二节第

16、二节 药用酶的生产药用酶的生产一、激肽释放酶一、激肽释放酶二、双链酶二、双链酶三、超氧化物歧化酶三、超氧化物歧化酶四、链激酶四、链激酶五、链道酶五、链道酶六、弹性酶六、弹性酶七、胰酶七、胰酶八、含糖蛋白酶八、含糖蛋白酶九、糜胰蛋白酶九、糜胰蛋白酶十、淀粉酶十、淀粉酶十一、菠萝蛋白酶十一、菠萝蛋白酶十二、十二、-半乳糖苷酶半乳糖苷酶十三、天门冬酰胺酶十三、天门冬酰胺酶十四、尿激酶十四、尿激酶第二十九页，讲稿共一百三十三页哦一、激肽释放酶一、激肽释放酶1、药理功能-具有扩张血管的功能，并能提高血管通透性，起到改善血液循环的作用。2、临床应用-治疗动脉硬化、血管炎、四肢皮肤溃疡。3、生产方法（1）提

17、取法生产-以猪的颔下腺为原料进行提取。（2）提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。第三十页，讲稿共一百三十三页哦二、双链酶二、双链酶1、药理作用-内含二种酶，二者合用可清除炎症物、脓块、瘀血，促进外伤伤愈合。（1）为链激酶（SK）、又称为溶栓酶。能溶解血栓和渗出物的纤维部分。（2）为链道酶（SD）、又称为脱氧核糖核酸酶。能够液化死细胞2、临床应用-治疗血肿、脓肿、骨髓炎、创伤性感染、溃疡。3、生产方法-细菌发酵法生产。第三十一页，讲稿共一百三十三页哦三、超氧化物歧化酶三、超氧化物歧化酶1、药理作用-能专一性地清除人体内的超氧阴离子自由基。2、临床应用-治疗类风湿关节炎，自身免疫疾病、心肌缺血、

18、抗衰老、断肢再植、整形美容。3、生产方法（1）提取法-从新鲜猪血中提取（2）提取法-从玉米中提取第三十二页，讲稿共一百三十三页哦链激酶和链道酶链激酶和链道酶四：链激酶四：链激酶链激酶（SK）称为溶栓酶。能溶解血栓和渗出物的纤维部分。生产方法-由-溶血性链球菌发酵生产五：链道酶五：链道酶链道酶（SD）又称为脱氧核糖核酸酶。能够液化死细胞。发酵法生产-由-溶血性链球菌发酵生产。第三十三页，讲稿共一百三十三页哦六、弹性酶六、弹性酶1、药理作用-能够水解弹性蛋白、血纤维蛋白、血红蛋白。2、临床应用-用于治疗高血脂、慢性支气管炎、动脉硬化、高血压、脂肪肝。3、生产方法提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取

19、。第三十四页，讲稿共一百三十三页哦七、胰酶七、胰酶1、药理作用-其成份为胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。能够消化淀粉、蛋白质、脂肪。2、临床应用-助消化，增加食欲。3、生产方法提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。第三十五页，讲稿共一百三十三页哦八、含糖蛋白酶八、含糖蛋白酶1、药理作用-是一种蛋白质消化酶2、临床应用-助消化，增加食欲3、生产方法提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。第三十六页，讲稿共一百三十三页哦九、糜胰蛋白酶九、糜胰蛋白酶1、药理作用-是一种蛋白质消化酶2、临床应用-助消化，增加食欲3、生产方法提取法生产-以牛羊的肠粘膜为原料进行提取。第三十七页，讲稿共一百三十三页哦十、淀粉

20、酶十、淀粉酶1、药理作用-是一种消化酶2、临床应用-助消化，增加食欲3、生产方法发酵法生产-以黄曲霉发酵生产。第三十八页，讲稿共一百三十三页哦十一、菠萝蛋白酶十一、菠萝蛋白酶1、药理作用-具有消炎、抗水肿的作用。2、临床应用-治疗炎症、水肿、血肿、支气管炎、肺之、乳腺炎、静脉炎。3、生产方法提取法生产-以菠萝的皮为原料进行提取。第三十九页，讲稿共一百三十三页哦十二、十二、-半乳糖苷酶半乳糖苷酶1：药理作用-消化酶，能够消化乳糖2：临床应用-适用于婴儿乳糖消化不良。3：生产方法发酵法生产-以毛霉（米曲酶）发酵生产。第四十页，讲稿共一百三十三页哦十三、天门冬酰胺酶十三、天门冬酰胺酶（一）药理作用和

21、临床应用（一）药理作用和临床应用1、药理作用-对肿瘤细胞具有抑制作用。2、临床应用-抗肿瘤制剂（二）生产方法（二）生产方法第四十一页，讲稿共一百三十三页哦（二）（二）生产生产方法方法发酵法生产-以大肠杆菌发酵生产。大肠杆菌种子级菌种加入玉米浆，发酵罐、37下培养7小时取发酵液，加入丙酮后压滤滤饼风干，得干菌体加入硼酸缓冲液，PH=8、37下提取得提取液，加醋酸调节PH=4。3，得沉淀物，即为干粗酶加入甘氨酸，60热处理30分钟得酶溶液，加入聚乙二醇，在不同的PH值下进行精制得无热源酶液冻干、无菌分装得天门冬酰胺酶冻干制剂第四十二页，讲稿共一百三十三页哦十四、尿激酶十四、尿激酶1、药理作用-是一

22、种蛋白质水解酶，具有溶血作用和降血压作用2、临床应用-抗血栓3、生产方法提取法生产-以男性新鲜尿液为原料进行提取。第四十三页，讲稿共一百三十三页哦第三节第三节 固定化酶工程固定化酶工程一、酶和细胞的固定化一、酶和细胞的固定化二、固定化酶的制备技术二、固定化酶的制备技术三、固定化细胞的制备技术三、固定化细胞的制备技术四、固定化生物反应器四、固定化生物反应器第四十四页，讲稿共一百三十三页哦一、酶和细胞的固定化一、酶和细胞的固定化（一）固定化酶的定义（一）固定化酶的定义（二）固定化生物催化剂的特点（二）固定化生物催化剂的特点（三）酶固定化的方法分类（三）酶固定化的方法分类（四）细胞固定化的方法分类（

23、四）细胞固定化的方法分类（五）固定化技术所用载体（五）固定化技术所用载体第四十五页，讲稿共一百三十三页哦（一）固定化酶的定义（一）固定化酶的定义固定化酶是指限制或者固定于特定空间位置的酶，具体来说，就是指经过物理、化学方法处理，使酶变成不易随水流失的固定化催化剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。酶可以采用经过分离后高纯度的提纯酶、也可以是菌体细胞碎片上的酶系，甚至可以是死细胞上的酶。第四十六页，讲稿共一百三十三页哦（二）固定化生物催化剂的特点（二）固定化生物催化剂的特点（1）固定化酶属于修饰酶，这种酶可以通过化学、生物、分子工程手段加以改良。（2）固定化酶的稳定性很高，可以多次连续使用。（3

24、）反应以后，产物中不含酶，易于纯化。（4）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。（5）酶的利用率高，酶的实际使用量较少。（6）固定化酶比水溶性酶更适合进行多酶反应。第四十七页，讲稿共一百三十三页哦（三）酶固定化的方法分类（三）酶固定化的方法分类1、载体结合法、载体结合法2、交联法、交联法3、包埋法、包埋法第四十八页，讲稿共一百三十三页哦1、载体结合法、载体结合法（1）物理吸附法）物理吸附法（2）离子结合法）离子结合法（3）共价键结合法）共价键结合法第四十九页，讲稿共一百三十三页哦（1）物理吸附法物理吸附法A、物理吸附法的优点：、物理吸附法的优点：（1）操作简单（2）可选用不同的吸附剂（3）

25、酶失活之后，载体可以再生B、物理吸附法的缺点：、物理吸附法的缺点：（1）酶的最适吸附量无规律可寻（2）酶与载体之间的吸附力不强，酶容易脱落。C、常用的吸附剂、常用的吸附剂第五十页，讲稿共一百三十三页哦C、常用常用的吸的吸附剂附剂活性炭碳酸钙-每克载体能吸附1mg酶蛋白。纤维素多孔玻璃酸性白土漂白土高岭石氧化铝硅胶膨润土羟基磷灰石磷酸钙金属氧化物-二氧化钛覆盖后的不锈钢颗粒，直径为100-200um，每克载体能吸附17mg酶蛋白。淀粉谷蛋白陶瓷丁基葡聚糖凝胶已基葡聚糖凝胶单宁纤维素衍生物第五十一页，讲稿共一百三十三页哦（2）离子结合法）离子结合法A、离子结合法的优点、离子结合法的优点-操作简单、

26、处理条件温和，酶的活性中心不容易被破坏。B、离子结合法的缺点、离子结合法的缺点-载体和酶的结合力较弱、常常发生酶脱落的现象C、常用的离子结合剂、常用的离子结合剂树脂-阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、多糖类离子交换剂、合成高分子类离子交换剂。每克载体能吸附50-150mg酶蛋白。DEAE-纤维素Amberlite-CG-50Amberlite-XE-97 Amberlite-IR-45Dowex-50第五十二页，讲稿共一百三十三页哦（3）共价键结合法共价键结合法酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基与载体表面的反应基团形成共价键，因而将酶固定在载体上的方法。A、共价键结合法的优点、共价键结合法

27、的优点-酶与载体结合牢固，酶不会发生脱落。B、共价键结合法的缺点、共价键结合法的缺点-操作复杂、反应条件苛刻，酶的活性中心会遭到部分性的破坏。C、共价键结合法的类别、共价键结合法的类别重氮化迭氮化酸酐活化法酰氯法异硫氰酸酯法缩合剂法溴化氰活化法烷基化法纪硅烷基化法第五十三页，讲稿共一百三十三页哦2、交联法、交联法（1）交联的优缺点）交联的优缺点（2）交联法的类别和内容）交联法的类别和内容（3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂第五十四页，讲稿共一百三十三页哦（1）交联的优缺点）交联的优缺点交联法是采用双功能、或者多功能试剂，使得酶与酶之间发生交联的固定化

28、方法。基团之间的交联通过共价键结合。交联法的优点-交联后的酶活性较高交联法的缺点-反应条件剧烈、酶的回收率低。第五十五页，讲稿共一百三十三页哦（2）交联法的）交联法的类别和内容类别和内容类别类别酶与酶交联法酶与辅助蛋白交联法吸附交联法载体交联法内容分子内交联分子间交联酶与辅助蛋白分子之间交联酶与载体之间交联第五十六页，讲稿共一百三十三页哦（3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂参与交联的酶蛋白功能团参与交联的酶蛋白功能团N-末端的-氨基赖氨酸的-氨基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基常用的交联剂常用的交联剂戊二醛双重氮联苯胺-2、2-二磺酸1、5-

29、二氟-2、4-二硝基苯已二酰亚胺二甲酯第五十七页，讲稿共一百三十三页哦3、包埋法、包埋法包埋法的优点-不需要改变酶的高级结构，酶的回收率较高。包埋法的缺点-包埋酶容易导致酶的失活，包埋法只适用于小分子底物的反应过程，大分子底物由于无法进入凝胶，故不适用。包埋法分为三类（1）凝胶包埋法）凝胶包埋法（2）微囊化包埋法）微囊化包埋法（3）纤维包埋法）纤维包埋法第五十八页，讲稿共一百三十三页哦（1）凝胶包埋法）凝胶包埋法凝胶包埋法也称网格法，是指将酶包埋在高分子凝胶的细策网格之中。凝胶包埋法是目前因定化技术中用得最多的方法。所用的凝胶有：聚丙烯酰胺聚乙烯醇光敏树脂淀粉明胶胶原海藻胶（卡拉胶）角叉菜胶第

30、五十九页，讲稿共一百三十三页哦（2）微囊化包埋法）微囊化包埋法将酶包埋在高分子半透膜中的方法，称为微囊化包埋法。微囊化固定化酶的优点-微囊化固定化酶的直径为几微米到几百微米之间的球状体，其颗粒较小，有利于大分子底物进行反应。微囊化固定化酶的缺点-反应条件要求高，制备成本也较高。第六十页，讲稿共一百三十三页哦（3）纤维包埋法）纤维包埋法此法适用于大规模生产。纤维包埋法所形成的聚合物，每克能够包埋1500mg的转化酶，并且具有良好的稳定性。制备时，先把含酶水溶液在高聚物（醋酸纤维素、聚氯乙烯）的有机溶剂（二氯甲烷）中进行乳化，然后将乳化液通过一多孔喷丝头挤压进凝结浴池中，形成纤维酶溶液便被包裹在纤

31、维内将纤维编织成各种酶布，以适合反应器的要求。第六十一页，讲稿共一百三十三页哦（四）细胞固定化的方法分类（四）细胞固定化的方法分类（1）交联法（2）包埋法（3）选择性热变性法-此法专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理，使其细胞膜蛋白质变性，但不使其酶变性，从而使酶固定于细胞内的方法。第六十二页，讲稿共一百三十三页哦（五）固定化技术所用载体（五）固定化技术所用载体1、固定化载体必须符合的条件、固定化载体必须符合的条件（1）固定化过程不传统引起酶变性。（2）对酸碱具有一定的耐受性。（3）具有一定的机械强度。（4）具有一定的亲水性，并且具有良好的稳定性。（5）具有一定的疏松网状结构，颗粒均匀。

32、（6）进行共价键结合时，具有可活化基团。（7）有耐受酶和微生物细胞的能力。（8）廉价易得。2、常用的固定化载体、常用的固定化载体（1）物理吸附载体）物理吸附载体（2）离子吸附载体）离子吸附载体（3）包埋法吸附载体）包埋法吸附载体（4）共价键结合载体）共价键结合载体第六十三页，讲稿共一百三十三页哦（1）物理吸附载体）物理吸附载体活性炭碳酸钙纤维素漂白土高岭石石英砂氧化铝硅胶矾土膨润土胶棉羟基磷灰石磷酸钙凝胶淀粉谷蛋白陶瓷二氧化硅皂土煤渣多孔玻璃酸性白土金属氧化物（二氧化钛覆盖后的不锈钢颗粒）丁基葡聚糖凝胶单宁纤维素衍生物已基葡聚糖凝胶第六十四页，讲稿共一百三十三页哦（2）离子吸附载体）离子吸附载

33、体阳离子交换树脂阴离子交换树脂DEAE-纤维素TEAT-纤维素羧甲基纤维素DEAE-SephadexA50Amberlite-CG-50Amberlite-XE-97Amberlite-IR-45Dowex-50第六十五页，讲稿共一百三十三页哦（3）包埋法吸附载体）包埋法吸附载体聚丙烯酰胺凝胶三醋酸纤维素二醋酸纤维素甲壳素硅胶聚乙烯醇丙烯酸高取物琼脂琼脂糖光敏树脂淀粉明胶胶原海藻胶卡拉胶角叉菜胶第六十六页，讲稿共一百三十三页哦（4）共价键结合载体）共价键结合载体纤维素SephadexA200琼脂琼脂糖苯胺多孔玻璃 对氨基苯纤维素聚丙烯酰胺胶原尼龙多聚氨基酸多孔玻璃珠金属氧化物第六十七页，讲稿共

34、一百三十三页哦二、固定化酶的制备技术二、固定化酶的制备技术（一）固定化酶的制备（一）固定化酶的制备（二）固定化酶的形状和性质（二）固定化酶的形状和性质（三）固定化酶的活力测定方法（三）固定化酶的活力测定方法第六十八页，讲稿共一百三十三页哦（一）固定化酶的制备（一）固定化酶的制备1、固定化方法的选择、固定化方法的选择（1）固定化酶应用的安全性，应该附合药用和食用标准。（2）固定化酶的稳定性，能够长期反复使用。（3）固定化酶的成本、水、电、气、设备、劳务等费用。2、固定化酶的选择、固定化酶的选择-目前在工业化大生产经常应用的有：（1）聚乙烯醇（2）卡拉胶（3）海藻胶。3、固定化酶制备技术、固定化酶

35、制备技术第六十九页，讲稿共一百三十三页哦3、固固定定化化酶酶制制备备技技术术（1）物理吸附法）物理吸附法-将酶的水溶液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶，即得固定化酶。（2）离子吸附法）离子吸附法-将解离状态的酶溶液与离子交换基混合后，洗去杂质和未吸附的酶，即得固定化酶。（3）凝胶包埋法）凝胶包埋法-将凝胶材料（卡拉胶、海藻胶、琼脂及明胶）与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点温度，然后加入预保温的酶溶液、混合均匀，最后冷却凝固成型、即成固定化酶。（4）凝胶包埋联合法）凝胶包埋联合法-在进行聚丙烯酰胺包埋时，将酶、混合单体、交联缓冲剂一起混合，再加入催化剂，在单体产生聚合反

36、应形成凝胶的同时，将酶限制在网格之中，经过破碎后就成为固定化酶。（5）脂质体包埋法）脂质体包埋法-这是一种采用表面活性剂和磷脂酰胆碱等物质，形成液膜来包埋酶的方法。（6）纤维包埋法）纤维包埋法-即前面已经讲述的酶布包埋方法。（7）共价键结合法）共价键结合法-实质上是一种酶 与包埋剂之间的化学反应过程（8）界面沉降微囊包埋法）界面沉降微囊包埋法（9）界面聚合微囊包埋法）界面聚合微囊包埋法（10）交联法）交联法第七十页，讲稿共一百三十三页哦（8）界面沉降微囊包埋法）界面沉降微囊包埋法采用与水不相溶的、沸点比水低的有机相A。将酶液在有机相A中乳化、形成油包水的微滴。再在乳化液中加入溶于有机溶剂的高聚

37、物B。再加入不能溶解高聚物B的另一种有机溶剂C。结果使得高聚物在油水界面上沉淀、析出，形成微囊型固定化酶。第七十一页，讲稿共一百三十三页哦（9）界面聚合微囊包埋法）界面聚合微囊包埋法含酶的、10%的血红蛋白溶液+已甲叉二胺水溶液-充分混合加入1%的Span-85的氯仿-环已烷进行分散乳化，再加入溶于有机相的癸二酰氯，酶和载体在油-水界面上发生聚合反应，弃去上清液，加入Tween-20去乳化，洗去有机溶剂用未聚合的单体，将聚合物转移到水相之中，就成微囊。所制得的微囊直径在1-300um之间，每1ml酶溶液可以制得2500cm2总表面积的微囊。第七十二页，讲稿共一百三十三页哦（10）交联法）交联法

38、是指向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶在分子内、或者在分子间形成网络结构，最终形成固定化酶的技术。交联法可以分为：（1）酶与辅助蛋白交联法（2）吸附交联法（3）载体交联法。如0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛、在PH=5.2-5.7、温度为0的条件下，24小时即完成酶的固定化。第七十三页，讲稿共一百三十三页哦（二）固定化酶的形状和性质（二）固定化酶的形状和性质1、固定化酶的形状、固定化酶的形状2、固定化酶的性质、固定化酶的性质3、酶稳定性的变化、酶稳定性的变化第七十四页，讲稿共一百三十三页哦1、固定化酶的形状、固定化酶的形状固定化酶的形状-酶膜、酶管、酶纤维、微囊、颗粒状的固定化酶

39、。（1）颗粒状的固定化酶-又可分为酶珠、酶块、酶片和酶粉。其制备方法简单、颗粒比表面积大，转化效率高，适用于各类反应器。（2）纤维状的固定化酶-只适用于填充床式反应器。（3）膜状的固定化酶-也称为酶膜，其表面积大、渗透阻力小，可用于酶电极、破碎之后也可用于填充床反应器，目前已经用于生产木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、氨基酰化酶、脲酶等。（4）管状的固定化酶-其机械强度大，切短之后可用于填充床式反应器，也可组装成列管式反应器。第七十五页，讲稿共一百三十三页哦2、固定化酶的性质、固定化酶的性质（1）酶活力的变化-经过固定化之后，酶的活力大都发生下降。（2）酶反应特性的变化-底物专一性，酶经过固定

40、化之后，由于位阻效应，其活性会下降。（3）最适PH值-酶经过固定化之后，其最适PH值会发生变化。（4）最适温度-酶经过固定化之后，其空间结构更加稳定，因此，其最适温度也会提高。（5）米氏常数-改变不显著。（6）最大反应速度-会产生一定的差异。第七十六页，讲稿共一百三十三页哦3、酶稳定性的变化、酶稳定性的变化（1）操作稳定性-当固定化酶的稳定半衰期达到1个月以上时，就具有工业应用价值。（2）贮藏稳定性-固定化的胰蛋白酶在20保存数月，其活性不变。（3）对热稳定性-由于加热提高了反应速度，从而提高反应效率。（4）对蛋白酶的稳定性-大多数天然酶在经过固定化之后，它们对于蛋白酶的耐受力均有大幅度提高。

41、这在工业生产中是极为有利的。第七十七页，讲稿共一百三十三页哦（三）固定化酶的活力测定方法（三）固定化酶的活力测定方法在酶促反应中，其底物或者产物具有光吸收、旋光、电位差、荧光等变化，可以使用分光光度计进行直接测定。（1）分批测定法固定化酶在搅拌、振荡的情况下，每间隔一定时间取样，过滤之后按常规方法测定。（2）连续测定法从反应器中引出反应液到流动比色杯中，在分光光度计中进行连续测定。或者通过测定反应过程中氧气、NH4、电导率、消化系数来确定酶的活力。第七十八页，讲稿共一百三十三页哦酶活力测定仪器第七十九页，讲稿共一百三十三页哦三、固定化细胞的制备技术三、固定化细胞的制备技术1、固定化细胞的制备2

42、、固定化细胞的形状和性质讫今为止技术上还没有过关的原因：（1）细胞培养技术存在着难题。（2）固定化之后，细胞的生物学活性存在着障碍。（3）细胞固定方法上在套用酶固定化技术，但是细胞不同于酶的单分子蛋白质，技术共用难度很大。在此只能作为标题介绍，不宜展开。第八十页，讲稿共一百三十三页哦四、固定化生物反应器四、固定化生物反应器1、酶反应器、酶反应器2、固定化反应器、固定化反应器的类型和特点的类型和特点3、固定化反应器、固定化反应器的选择依据的选择依据第八十一页，讲稿共一百三十三页哦1、酶反应器、酶反应器用于酶催化反应的装置称为酶反应器，它可用于溶液酶、也可用于固定化酶。第八十二页，讲稿共一百三十三

43、页哦2、固定化反应器的类型和特点、固定化反应器的类型和特点（1）间歇式搅拌反应罐（）间歇式搅拌反应罐（BSTR）（2）连续流动搅拌反应罐（）连续流动搅拌反应罐（CSTR）（3）填充式反应罐（）填充式反应罐（PBR）（4）流化床反应器（）流化床反应器（FBR）（5）循环反应器（）循环反应器（RCR）（6）连续流动搅拌）连续流动搅拌超滤膜反应器（超滤膜反应器（CSTR/UF）（7）其它反应器）其它反应器第八十三页，讲稿共一百三十三页哦（1）间歇式搅拌反应罐（）间歇式搅拌反应罐（BSTR）也称为分批搅拌反应器。其特点是结构简单、操作方便。其缺点是，经过单一批次的反应之后，酶就随着反应产物流失。主要用

44、于游离酶反应。当前食品和饮料工业中常用这类反应器。其方法是将酶和底物一起加入到反应器中，控制反应温度，当达到预期的转化率时，随即放料。第八十四页，讲稿共一百三十三页哦（2）连续流动搅拌反应罐（）连续流动搅拌反应罐（CSTR）这是一种连续进料、连续出料的反应器。结构上与间歇式搅拌反应器基本相同。第八十五页，讲稿共一百三十三页哦（3）填充式反应罐（）填充式反应罐（PBR）属于使用最普遍的反应器。主要用于固定化酶生产的反应器。固定化酶通常以各种形状如球形、碎片、薄片、丸粒填充于反应层内。固定化酶所使用的载体有多也玻璃珠、珠状离子交换树脂、聚丙烯酰胺凝胶、二乙胺乙基葡聚糖凝胶，胶原蛋白薄膜片。填充式反

45、应罐系统运转时，底物按照向上流动的方向以恒定的速度通过反应床。第八十六页，讲稿共一百三十三页哦（4）流化床反应器（）流化床反应器（FBR）在流化床反应器，底物溶液以足够大的流速向上通过反应床。使得固体颗粒处于流化状态，从而来增加反应效率。由于流化床反应器具有混合程度高，传热性能良好等特点，因此可以用来处理粘性较强的底物、或者用来处理含有固体颗粒的底物。第八十七页，讲稿共一百三十三页哦（5）循环反应器（）循环反应器（RCR）这种反应器是让部分反应产物流出，流出物再与原始底物混合之后重新流入反应系统的方法。循环反应器能够提高液体的流速，并能减少底物在固定化酶表面沉积，从而达到较高的转化效率。当反应

46、底物是不溶性物质时，可以采用循环反应器生产。第八十八页，讲稿共一百三十三页哦(6)鼓泡式反应器鼓泡式反应器鼓泡式反应器(bubble column reactor,BCR)是利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。也是一种无搅拌装置的反应器。鼓泡式反应器可以用于游离酶和固定化酶的催化反应。在使用鼓泡式反应器进行固定化酶的催化反应时，反应系统中存在固、液、气三相，又称为三相流化床式反应器。鼓泡式反应器的结构简单，操作容易,剪切力小，物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。例如氧化酶催化反应需要供给氧气，羧化酶的

47、催化反应需要供给二氧化碳等。第八十九页，讲稿共一百三十三页哦(6)膜反应器膜反应器膜反应器（membrane reactor,MRMR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。第九十页，讲稿共一百三十三页哦（7）连续流动搅拌）连续流动搅拌-超滤膜反应器（超滤膜反应器（CSTR/UF）连续流动搅拌-超滤膜反应器=连续流动搅拌反应器+超滤膜装置。

48、超滤膜被安装在连续流动搅拌反应器的出口处，这种膜只允许反应产物、或者是未曾反应的底物通过，而分子量较大的酶就被截留在反应器中，从而实现酶的反复利用。第九十一页，讲稿共一百三十三页哦在CSTR（连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤器。可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。游离酶在膜反应器中进行催化反应时，底物溶液连续地进入反应器，酶在反应容器的溶液中与底物反应，反应后，酶与反应产物一起，进入膜分离器进行分离，小分子的产物透过超滤膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循环使用。回本章目录第九十二页，讲稿共一百三十

49、三页哦（8）其它反应器）其它反应器淤浆式反应器滴流床反应器气栓式流动反应器转盘式反应器筛板反应器复合类反应器第九十三页，讲稿共一百三十三页哦各种酶反应器的特点反应器类型适用的操作方式适用的酶特点搅拌罐式反应器分批式,流加分批式连续式,游离酶固定化酶反应比较完全，反应条件容易调节控制。填充床式反应器连续式固定化酶密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。流化床反应器分批式流加分批式连续式固定化酶流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。第九十四页，讲稿共一百三十三页哦反应器类型适用的操作方式适用的酶 特点

50、鼓泡式反应器分批式流加分批式连续式游离酶固定化酶鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合于有气体参与的反应。膜反应器连续式游离酶固定化酶清洗比较困难 喷射式反应器连续式游离酶通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的反应第九十五页，讲稿共一百三十三页哦3、固定化反应器的选择依据、固定化反应器的选择依据（1）根据固定化酶的形状来选择。（2）根据底物的物理性质来选择。（3）根据外界环境条件对于酶的稳定性来选择。（4）根据操作要求和固定化酶反应器的投资费用来选择。第九十六页，讲稿共一百三十三页哦通常颗粒状、片状、膜状或纤维状