基因工程载体PPT课件.ppt

《基因工程载体PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程载体PPT课件.ppt（40页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于基因工程载体关于基因工程载体第一张，PPT共四十页，创作于2022年6月定义：在基因工程操作中，把能携带外源定义：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的进入受体细胞的DNA分子叫载体分子叫载体。1.载体载体（Vectors）多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点(multiple cloning site)(multiple cloning site)oriori复制起始点复制起始点复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记pUCpUCMCSMCSAmpAmpr r第二张，PPT共四十页，创作于2022年6月（1）在宿主细胞内能独立复制，在宿主细胞内能独立复制，or

2、i。（3）多克隆位点：多克隆位点：外源基因插入的外源基因插入的单一单一限制酶位点。限制酶位点。2.基因工程对载体的要求基因工程对载体的要求（7）具有较好的安全性，不能任意转移具有较好的安全性，不能任意转移。（2）有选择性标记有选择性标记Ampr、Tetr、Kanr等等。（4）分子量小，分子量小，可容纳较大的外源基因片段。可容纳较大的外源基因片段。（5）拷贝数多，拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。方便外源基因在细胞内大量扩增。（6）具有对受体细胞的可转移性具有对受体细胞的可转移性。第三张，PPT共四十页，创作于2022年6月载体的种类载体的种类 基因工程中常用的载体有基因工程中常用的载体有

3、5类：类：质粒（质粒（plasmid）单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid）动物病毒（动物病毒（virus）第四张，PPT共四十页，创作于2022年6月第一节第一节 质粒载体质粒载体 一、质粒（一、质粒（plasmid）独立于染色体以外的能独立于染色体以外的能自主复制自主复制的双链闭合环状的双链闭合环状DNA分分子子（CovalentlyClosedCircularDNA,cccDNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细胞某些抵御外界环并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力境因素不利影响的能力，如

4、抗生素抗性、对重金属离子的，如抗生素抗性、对重金属离子的抗性、分泌细菌毒素等。抗性、分泌细菌毒素等。分子量在分子量在1-500kb之间之间广泛存在于细菌。广泛存在于细菌。第五张，PPT共四十页，创作于2022年6月第六张，PPT共四十页，创作于2022年6月5 5.根据基因工程的特殊要求加装根据基因工程的特殊要求加装根据基因工程的特殊要求加装根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件特殊的基因元件三、质粒载体的构建三、质粒载体的构建1 1、质粒构建基本策略质粒构建基本策略质粒构建基本策略质粒构建基本策略1 1.加入合适的选择标记基因，加入合适的选择标记基因，加入合适的选择标记基因，加入合适的选择

5、标记基因，如两个以上，易于选择转如两个以上，易于选择转化体化体2 2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组增加或减少合适的酶切位点，便于重组增加或减少合适的酶切位点，便于重组增加或减少合适的酶切位点，便于重组3 3.缩短长度，缩短长度，缩短长度，缩短长度，提高导入效率，增加装载量提高导入效率，增加装载量提高导入效率，增加装载量提高导入效率，增加装载量4.改变复制子改变复制子改变复制子改变复制子，变严紧为松弛变严紧为松弛变严紧为松弛变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝变少拷贝为多拷贝变少拷贝为多拷贝变少拷贝为多拷贝第七张，PPT共四十页，创作于2022年6月第八张，PPT共四十页，创作于2022年6月1

6、.pBR322：p p:质粒；质粒；BRBR：质粒两位主要质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母；构建者姓氏的第一个字母；322322：实验编号实验编号人工构建载体人工构建载体三个亲本质粒：三个亲本质粒：pMB1:出发质粒出发质粒(ColE1)pSF2124:AmprpSC101:TetrpSF2124pMB1pSC101四、经典的大肠杆菌质粒载体四、经典的大肠杆菌质粒载体第九张，PPT共四十页，创作于2022年6月氨苄青霉素和四环素抗性氨苄青霉素和四环素抗性24个单一克隆位点。个单一克隆位点。9个导致个导致Tetr基因失活基因失活3个会导致个会导致Ampr基因失活基因失活第十张，PPT共四十页，

7、创作于2022年6月氯霉素氯霉素扩增之后，每个细胞可达扩增之后，每个细胞可达10003000copies 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过）。不能通过接合转移。接合转移。高拷贝数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大长度长度4363bp，易于纯化，可以携带，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源的外源DNA片段。片段。具有较多的单一酶切位点（具有较多的单一酶切位点（24种）种）第十一张，PPT共四十页，创作于2022年6月4、pUC质粒载体质粒载体1987年，年，J.Messing和和J.Vieria采采用用MCS技术在技术在pBR3

8、22基础上构基础上构建的建的结构：结构：（1）来自于）来自于pBR322的的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。但核苷酸序列发生了变化但核苷酸序列发生了变化（3）LacZ基因基因 编码编码半乳糖酶的半乳糖酶的肽链肽链（4）MCS区段区段（MCS）区段位于）区段位于lacZ基因中的靠近基因中的靠近5-端的一段多克隆位点。但它并端的一段多克隆位点。但它并不破坏该基因的功能不破坏该基因的功能。第十二张，PPT共四十页，创作于2022年6月与与pBR322相比，相比，pUC质粒载体优点：质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数）具有更小的分子量和更高的拷贝数

9、如如pUC8为为2 750bp，pUCl8为为2 686bp，控制质粒复制控制质粒复制rop基因的缺失，基因的缺失，平均每个细胞即可达平均每个细胞即可达500700个拷贝个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体）适用于组织化学法检测重组体 通过通过-互补互补作用，利用作用，利用菌落颜色菌落颜色筛选重组子筛选重组子。而而pBR322pBR322质粒的重组子要进行质粒的重组子要进行两步的选择。两步的选择。（3）具有多克隆位点区段（）具有多克隆位点区段（MCS）适合不同粘性末端的适合不同粘性末端的DNA片段插入，不必连接接头片段插入，不必连接接头 第十三张，PPT共四十页，创作于2022年6月 释释放

10、放出出的的蓝蓝色色物物质质可可以以将将整整个个菌菌落落染染成成蓝蓝色色，非非常常容容易易辨辨别别，如如果果 LacZ插插入入外外源源基基因因被被破破坏坏，菌菌落落则则是是白白色色的的。组织化学法检测重组体X-Gal-半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG诱导物诱导物异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-氯氯-靛蓝靛蓝第十四张，PPT共四十页，创作于2022年6月第十五张，PPT共四十页，创作于2022年6月第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体组成组成组成组成：蛋白质、蛋白质、核酸核酸核酸核酸.结构：结构：结构：结构：蛋白质外壳蛋白质外壳蛋白质外壳蛋白质外壳、尾巴尾巴尾尾巴

11、巴上上的的微微微微丝丝丝丝可可可可以以以以把把把把噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的DNADNADNADNA注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。是比细菌还小得多的微生物，是比细菌还小得多的微生物，噬菌体侵犯细菌，可以认为它噬菌体侵犯细菌，可以认为它是细菌里的是细菌里的“寄生虫寄生虫寄生虫寄生虫”。Bacteriophage(phage)第十六张，PPT共四十页，创作于2022年6月一、大肠杆菌的一、大肠杆菌的-噬菌体噬菌体DNA（1）线线状双状双链链DNA，两端各有一个，两端各有一个12bp的互的互补单链补单链（粘性末端，粘性末端，cohesive-end site），称），称cos

12、 site，粘性粘性末端粘连接变成末端粘连接变成环状环状DNA。（一）（一）-噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性1、由、由外壳包装蛋白外壳包装蛋白和和-DNA组成组成lcos位点是噬菌体包装必需序列。位点是噬菌体包装必需序列。2、-DNA的物理图谱的物理图谱48.5kb第十七张，PPT共四十页，创作于2022年6月（2 2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因目前已经被确定的基因至少至少6161种种，一半为必需基因一半为必需基因第十八张，PPT共四十页，创作于2022年6月（二）（二）噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建1.选用选用噬菌体作

13、为构建克隆载体材料的依据噬菌体作为构建克隆载体材料的依据是一种温和噬菌体。是一种温和噬菌体。能承载比较大的外源能承载比较大的外源DNA片段片段DNA分子上有多种限制酶的识别位点分子上有多种限制酶的识别位点2.构建构建噬菌体克隆载体的技术路线噬菌体克隆载体的技术路线用限制酶切去用限制酶切去DNA上的非必需区上的非必需区在在DNA上非必需区内插入选择标记基因上非必需区内插入选择标记基因建立建立DNA分子体外包装系统分子体外包装系统第十九张，PPT共四十页，创作于2022年6月第二十张，PPT共四十页，创作于2022年6月 （1 1）插入式载体）插入式载体只具有一个可供外源只具有一个可供外源DNAD

14、NA插入的限制酶位点的插入的限制酶位点的噬菌体。噬菌体。常用：常用：gt10、NM1149等载体等载体.（2 2）置换型载体（取代型载体）置换型载体（取代型载体）具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的DNADNA区段可以区段可以被外源插入的被外源插入的DNADNA片段所取代。片段所取代。常用：常用：EMBL3EMBL3、EMBL4 EMBL4二二.噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型第二十一张，PPT共四十页，创作于2022年6月三三三三、-DNA-DNA作为载体的优点作为载体的优点作为载体的优点作为载体的优点可在可在体外包装体外包装成噬菌体颗粒，

15、成噬菌体颗粒，高效转染高效转染大肠杆菌大肠杆菌-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒，远远大于质粒的装载量重组的装载量重组。-DNA分子的筛选较为方便分子的筛选较为方便。-DNA载体适合载体适合克隆和扩增外源克隆和扩增外源DNA片段片段，常用于，常用于构建基因文库构建基因文库缺点：缺点：缺点：缺点：(1)(1)需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用又高；又高；又高；又高；(2)(2)没有质粒的用途广泛

16、。没有质粒的用途广泛。没有质粒的用途广泛。没有质粒的用途广泛。第二十二张，PPT共四十页，创作于2022年6月第三节第三节、人工染色体克隆载体、人工染色体克隆载体 基本元件：基本元件：含有质粒克隆载体所必需的含有质粒克隆载体所必需的第一受体第一受体（大肠杆菌）（大肠杆菌）的的质粒复制起始点质粒复制起始点；第二受体第二受体（如酵母菌）（如酵母菌）染色体染色体DNA着丝点、端粒和复着丝点、端粒和复制起始点的序列制起始点的序列.合适的合适的选择标记基因。选择标记基因。利用利用染色体的复制元件染色体的复制元件来驱动外源来驱动外源DNA片段复制的片段复制的载体。载体。酵母人工染色体（酵母人工染色体（YA

17、C）细菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC）第二十三张，PPT共四十页，创作于2022年6月（一）酵母人工染色体（一）酵母人工染色体（YAC）把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母在质粒上，令质粒行使酵母chr的转录功能和复制功能。的转录功能和复制功能。装载量为装载量为350-400kb含有的元件：含有的元件：酵母酵母自主复制序列自主复制序列(ARS)着丝粒序列着丝粒序列(cen)四膜虫四膜虫端粒端粒（tel）质粒选择标记质粒选择标记酵母系统的选择标记酵母系统的选择标记质粒复制起点质粒复制起点第二十四张，PPT共

18、四十页，创作于2022年6月一、一、YAC的基本序列元件的基本序列元件酵母染色体酵母染色体DNA自主复制序列（自主复制序列（自主复制序列（自主复制序列（ARSARS）酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的着丝粒序列（着丝粒序列（着丝粒序列（着丝粒序列（CENCEN）酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的酵母染色体的端粒序列（端粒序列（端粒序列（端粒序列（TELTEL）酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC）vvYAC YAC 载载载载体体体体主主主主要要要要是是是是用用用用来来来来构构构构建建建建大大大大片片片片段段段段 DNA DNA 文文库库，特特别别用用来来构构构构建高等真核生物

19、的基因组文库建高等真核生物的基因组文库建高等真核生物的基因组文库建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。，并不用作常规的基因克隆。，并不用作常规的基因克隆。，并不用作常规的基因克隆。第二十五张，PPT共四十页，创作于2022年6月酵母自主复制序列（酵母自主复制序列（ARS)一一段段特特殊殊的的序序列列，含含有有酵酵母母菌菌中中 DNA 进进行双向复制所必需的信号。行双向复制所必需的信号。第二十六张，PPT共四十页，创作于2022年6月酵母着丝点酵母着丝点(CEN)(CEN)在在 YAC YAC 中中中中起起起起到到到到保保保保证证证证一一一一个个个个细细细细胞胞胞胞内内内内只只只只

20、有有有有一一一一个个个个人人人人工工工工染染染染色色色色体体体体的的的的作用。作用。作用。作用。pYAC4 pYAC4：酵酵母母第第四四条条染色体的着丝粒。染色体的着丝粒。第二十七张，PPT共四十页，创作于2022年6月正常酵母人工染色体含有：正常酵母人工染色体含有：正常酵母人工染色体含有：正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（四膜虫端粒（四膜虫端粒（四膜虫端粒（teltel）定定定定位位位位于于于于染染染染色色色色体体体体末末末末端端端端一一一一段段段段序序序序列列列列，用用用用于于于于保保保保护护护护线线线线状状状状的的的的 DNA 不不不不被被被被胞胞胞胞内内内内的的的的核核核核酸酸酸酸

21、酶酶酶酶降降降降解解解解，形成稳定的结构。形成稳定的结构。形成稳定的结构。形成稳定的结构。第二十八张，PPT共四十页，创作于2022年6月二二、YAC 载体的选择标记载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因主要采用营养缺陷型基因主要采用营养缺陷型基因主要采用营养缺陷型基因 TRP 1：色氨酸生物合成基因缺陷型：色氨酸生物合成基因缺陷型URA 3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型：尿嘧啶生物合成基因缺陷型LEU 2：亮氨酸合成基因缺陷型：亮氨酸合成基因缺陷型 SUPSUP 4 4：赭石突变抑制基因：赭石突变抑制基因：赭石突变抑制基因：赭石突变抑制基因 第二十九张，PPT共四十页，创作于2022年6月克隆位点

22、：位于克隆位点：位于sup4基因内基因内SuP4是一个是一个赭石突变（赭石突变（UAA）抑制抑制基因。基因。宿主酵母菌的宿主酵母菌的胸腺嘧啶胸腺嘧啶合成基因带有一个合成基因带有一个赭石突变赭石突变 ade2。在在赭石突变宿主赭石突变宿主中，没有外源基因插入时，中，没有外源基因插入时，sup4基因基因抑抑制赭石突变，则形成制赭石突变，则形成正常正常白色菌落白色菌落；有有外源基因插入时外源基因插入时，sup4基因遭破坏，则形成基因遭破坏，则形成红色红色菌落菌落，十分容易挑选出有，十分容易挑选出有DNA插入片段的插入片段的红色菌落，红色菌落，建成建成YAC文库。文库。第三十张，PPT共四十页，创作于

23、2022年6月YAC克隆克隆DNA片段的过程是：片段的过程是：目目的的基基因因在在限限制制性性内内切切酶酶酶酶解解后后变变成成大大片片段段DNA，克克隆隆进进酵酵母母载载体体DNA，转转染染酵酵母母缩缩主主细细胞胞，扩扩增增后后，根根据据标标记记性性状状筛筛选选出出重重组组的的人人工染色体。工染色体。三、克隆策略三、克隆策略第三十一张，PPT共四十页，创作于2022年6月酵母人工染色体的使用酵母人工染色体的使用第三十二张，PPT共四十页，创作于2022年6月四四、酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC）缺点）缺点 首先，在首先，在首先，在首先，在YACYAC载体的插入片段会出现缺失和基因重排的

24、载体的插入片段会出现缺失和基因重排的载体的插入片段会出现缺失和基因重排的载体的插入片段会出现缺失和基因重排的现象。现象。现象。现象。其次，容易形成嵌合体。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个嵌合就是在单个YACYAC中的插入片段由中的插入片段由中的插入片段由中的插入片段由2 2个或多个的独立个或多个的独立个或多个的独立个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%50%。第三，第三，第三，第三，YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，染色体与宿主细胞的染色体大小

25、相近，染色体与宿主细胞的染色体大小相近，染色体与宿主细胞的染色体大小相近，就就很难从中分离出来很难从中分离出来，影响了影响了影响了影响了YACYAC载体的广泛应用。载体的广泛应用。载体的广泛应用。载体的广泛应用。第三十三张，PPT共四十页，创作于2022年6月（二）细菌人工染色体（二）细菌人工染色体（BAC）1992年年Shizuya利用利用F因子的复制起点和氯霉素抗因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，在性标记基因，在F质粒质粒（pMBO131）基础上构建基础上构建了第一代了第一代BAC人工染色体。能够克隆和保持大于人工染色体。能够克隆和保持大于100kb的的DNA。用于：克隆大型基因簇结构用

26、于：克隆大型基因簇结构 构建动植物基因文库构建动植物基因文库第三十四张，PPT共四十页，创作于2022年6月F因子的特点因子的特点 又又又又称称称称致致致致育育育育因因因因子子子子，是是是是一一一一个个个个100100kbkb的的的的质质质质粒粒粒粒，能能能能整整整整合合合合到到到到宿宿宿宿主主主主染染染染色色色色体体体体中中中中。并并并并能高频率的转移遗传标记。能高频率的转移遗传标记。能高频率的转移遗传标记。能高频率的转移遗传标记。F F因因因因子子子子在在在在大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌中中中中的的的的复复复复制制制制受受受受到到到到严严严严格格格格控控控控制制制制而而而而保保保保持持

27、持持低低低低拷拷拷拷贝贝贝贝，一一一一般般般般为为为为每每每每细细细细胞胞胞胞1 12 2个个个个拷拷拷拷贝贝贝贝，其其其其parBparB基基基基因因因因能能能能够够够够排排排排斥斥斥斥细细细细胞胞胞胞中中中中的的的的外外外外源源源源性性性性F F质质质质粒粒粒粒，限限限限制制制制了了了了细细细细胞胞胞胞内内内内质质质质粒粒粒粒分分分分子子子子间间间间的的的的重重重重排排排排，降降降降低低低低了了了了BACBAC中中中中外外外外源源源源基基基基因因因因的的的的重重重重组组组组和嵌合度和嵌合度和嵌合度和嵌合度第三十五张，PPT共四十页，创作于2022年6月新新一一代代BAC载载体体为为7.4k

28、b的的环状质粒：环状质粒：F因因 子子 的的parA，parB，parC基基因因以以保保证证低低拷拷贝贝的的BAC质质粒粒在在大大肠肠杆杆菌菌分分裂裂时时均均匀分配到子代细胞匀分配到子代细胞oriS基基因因：来来源源于于大大肠肠杆杆菌菌F因因子子（致致育育因因子子）的的严严谨谨型型控制的复制子控制的复制子第三十六张，PPT共四十页，创作于2022年6月BAC优点：优点：BAC载体容载能力一般为100-350kb,虽然容量没YAC大，但BAC具更多优点：1)以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建BAC文库比YAC文库更容易；2)BAC载体以环型超螺旋状态存在,从大肠杆菌中提取质粒较方便,而从酵母中分离

29、DNA较难；3)BAC复制子源于F因子,可稳定遗传,嵌合及重组现象少；4)可通过菌落原位杂交筛选目的基因，方便快捷；5)BAC载体在多克隆位点两侧具T7和Sp6聚合酶启动子，可用于转录获得RNA探针或直接用于插入片段的末端测序第三十七张，PPT共四十页，创作于2022年6月（三）人工染色体克隆载体的应用（三）人工染色体克隆载体的应用1、构建基因组文库、构建基因组文库2、基因治疗、基因治疗3、基因功能鉴定、基因功能鉴定第三十八张，PPT共四十页，创作于2022年6月质粒质粒受体细胞受体细胞结构结构插入片断插入片断举例举例 E.coliE.coli环状环状 8kb 8kbp pUCUC18/19,

30、T-18/19,T-载体，载体，pGEMpGEM等等 噬菌体噬菌体E.coliE.coli线状线状9-24kb9-24kbEMBLEMBL系列，系列，gtgt系列系列BAC(Bacterial BAC(Bacterial Artificial Artificial ChroChromomosome)some)E.coliE.coli环状环状300 kb300 kbPel oBACPel oBAC系列系列YAC(Yeast YAC(Yeast Artificial Artificial chromosome)chromosome)酵母细胞酵母细胞线性染色体线性染色体100-1000 kb100-1000 kb载体的种类和特征载体的种类和特征第三十九张，PPT共四十页，创作于2022年6月作业：1 简述质粒载体必须具备的基本条件简述质粒载体必须具备的基本条件2 蓝白斑筛选重组子原理蓝白斑筛选重组子原理3 YAC基本序列元件及其作用基本序列元件及其作用4 BAC优点优点第四十张，PPT共四十页，创作于2022年6月