高效液相色谱基础知识课件.ppt

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1、高效液相色谱基础知识1第1页，此课件共46页哦 目的目的:规范范岛津津LC-10AT型高效液相色型高效液相色谱仪的使用。的使用。范范围:适用于适用于岛津津LC-10AT型高效液相色型高效液相色谱仪的使用。的使用。职责:质检员对本本规程的程的实施施负责。2第2页，此课件共46页哦一、一、系系统组成成 本系本系统由由2个个LC-10ATvp溶溶剂输送送泵（分主（分主/A泵和副和副/B泵）、）、Rheodyne 7725i手手动进样阀、SPD-10Avp紫外紫外-可可见检测器器、N2000色色谱数据数据工作站工作站和和电脑等等组成，另外成，另外还包括打印机、不包括打印机、不间断断电源等源等辅助助设备

2、。3第3页，此课件共46页哦二、二、准准备1、准准备所需的流所需的流动相，用合适的相，用合适的0.45m滤膜膜过滤，超声脱气，超声脱气20min。2、根据待根据待检样品的需要更品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。3、配制配制样品和品和标准溶液（也可在平衡系准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的配制），用合适的0.45m滤膜膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）4、检查仪器各部件的器各部件的电源源线、数据、数据线和和输液管道是否液管道是否连接正常。接正常。4第4页，此课件共46页哦 接通接通电源，依次开启不源，依次开启不间断

3、断电源源、B泵、A 泵、检测器器，待待泵和和检测器自器自检结束后，打开打印机、束后，打开打印机、电脑显示器、主机，示器、主机，最后打开色最后打开色谱工作站工作站。三、三、开机开机5第5页，此课件共46页哦四、四、参数参数设定定1、波波长设定定：在在检测器器显示初始屏幕示初始屏幕时，按，按func键，用数字，用数字键输入所需波入所需波长值，按按Enter键确确认。按。按CE键退出到初始屏幕。退出到初始屏幕。2、流速流速设定：定：在在A泵显示初始屏幕示初始屏幕时，按，按func键，用数字，用数字键输入所需的流速入所需的流速（柱在（柱在线时流速一般不超流速一般不超过1ml/min），按），按Ente

4、r键确确认。按。按CE键退出。退出。3、流流动相比例相比例设定：定：在在A泵显示初始屏幕示初始屏幕时，按，按conc键，用数字，用数字键输入流入流动相相B的的浓度百分数，按度百分数，按Enter键确确认。按。按CE键退出。退出。6第6页，此课件共46页哦四、四、参数参数设定定4、梯度梯度设定定：4.1：在在A泵显示初始屏幕示初始屏幕时，按，按edit键，Enter键；4.2：用数字用数字键输入入时间，按，按Enter键，重复按，重复按func键选择所需功能（所需功能（FLOW设定流速，定流速，BCNC设定流定流动相相B的的浓度），按度），按Enter键，用数字，用数字键输入入设定定值，按，按E

5、nter键；4.3：重复上一步重复上一步设定其它定其它时间步步骤；4.4：用数字用数字键输入停止入停止时间，重复按，重复按func键直至屏幕直至屏幕显示示STOP，按，按Enter键。按按CE键退出。退出。7第7页，此课件共46页哦五、五、更更换流流动相并排气泡相并排气泡1：将将A/B管路的吸管路的吸滤器放入装有准器放入装有准备好的流好的流动相的相的储液瓶中；液瓶中；2：逆逆时针转动A/B泵的排液的排液阀180，打开排液，打开排液阀；3：按按A/B泵的的purge键，pump指示灯亮，指示灯亮，泵大大约以以9.9ml/min的流速冲洗，的流速冲洗，3min（可（可设定）后自定）后自动停止；停止

6、；4：将排液将排液阀顺时针旋旋转到底，关到底，关闭排液排液阀。5：如管路中仍有气泡，如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。重复以上操作直至气泡排尽。6：如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下拆下连接管，放入接管，放入废液瓶中，液瓶中，设流速流速为5ml/min，按，按pump键，冲洗，冲洗3min后再按后再按pump键停停泵，重新接上柱并将流速重，重新接上柱并将流速重设为规定定值。8第8页，此课件共46页哦六、六、平衡系平衡系统1、查看基看基线：1.1：按按N2000色色谱数据工作站操作数据工作站操作规程程打开打开“在在线色色谱工作站工作站”软件，件

7、，1.2：输入入实验信息并信息并设定各定各项方法参数后，方法参数后，1.3：按下按下“数据收集数据收集”页的的 按按钮。9第9页，此课件共46页哦六、六、平衡系平衡系统2、等度洗脱方式等度洗脱方式 2.1：按按A泵的的pump键，A、B泵将同将同时启启动，pump指示灯亮。用指示灯亮。用检验方法方法规定定的流的流动相冲洗系相冲洗系统，一般最少需，一般最少需6倍柱体倍柱体积的流的流动相。相。2.2：检查各管路各管路连接接处是否漏液，如漏液是否漏液，如漏液应予以排除。予以排除。2.3：观察察泵控制屏幕上的控制屏幕上的压力力值，压力波力波动应不超不超过1MPa。如超。如超过则可初可初步判断步判断为柱

8、前管路仍有气泡，按柱前管路仍有气泡，按检查管路后再检查管路后再操作。操作。2.4：观察基察基线变化。如果冲洗至基化。如果冲洗至基线漂移漂移0.01mV/min，噪声，噪声为25mmol/L的的缓冲液冲液4.每天冲洗柱每天冲洗柱5.稳定定进样条件条件,调节流流动相相6.采用保采用保护柱柱40第40页，此课件共46页哦二、二、保留时间缩短保留时间缩短 1.流速增加流速增加2.样品超载样品超载3.键合相流失键合相流失4.流动相组成变化流动相组成变化5.温度增加温度增加1.检查泵,重新重新设定流速定流速2.降低降低样品量品量3.流流动相相PH值保保持持在在37.5检查柱的方向柱的方向4.防止流防止流动

9、相蒸相蒸发或沉淀或沉淀5.柱恒温柱恒温41第41页，此课件共46页哦三、三、保留时间延长保留时间延长 1.流速下降流速下降2.硅胶柱上活性点变化硅胶柱上活性点变化3.键合相流失键合相流失4.流动相组成变化流动相组成变化5.温度降低温度降低1.管管路路泄泄漏漏,更更换泵密密封封圈圈,排排除除泵内气泡内气泡2.用用流流动相相改改性性剂,如如加加三三乙乙胺胺,或采用碱至或采用碱至钝化柱化柱3.流流动相相PH值保保持持在在37.5检查柱的方向柱的方向4.防止流防止流动相蒸相蒸发或沉淀或沉淀5.柱恒温柱恒温42第42页，此课件共46页哦四四、出现肩峰或分叉出现肩峰或分叉 1.样品体积过大样品体积过大2.

10、样品溶剂过强样品溶剂过强3.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道4.柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效5.进样器损坏进样器损坏1.用流动相配样用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的总的样品体积小于第一峰的15%2.采用较弱的样品溶剂采用较弱的样品溶剂3.更换色谱柱更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件采用较弱腐蚀性条件4.更换烧结不锈钢更换烧结不锈钢,加在线过滤器加在线过滤器,过滤样品过滤样品5.更换进样器转子更换进样器转子43第43页，此课件共46页哦五、五、鬼峰鬼峰 1.进样阀残余峰进样阀残余峰2.样品中未知物样品中未知物3.柱未平衡柱未平衡4.三氟乙酸三氟乙酸(TFA)氧化氧化(肽谱肽谱)

11、5.水污染水污染(反相反相)1.每每次次用用后后用用强溶溶剂清清洗洗阀,改改进阀和和样品品的的清清洗洗2.处理理样品品3.重重新新平平衡衡柱柱,用用流流动相相作作样品品溶溶剂(尤尤其其是是离离子子对色色谱)4.每天新配每天新配,用抗氧化用抗氧化剂5.通通过变化平衡化平衡时间检查水水质量，用量，用HPLC级的水的水44第44页，此课件共46页哦六、六、基线噪声基线噪声 1.气泡气泡(尖锐峰尖锐峰)2.污染污染(随机噪声随机噪声)3.检测器灯连续噪声检测器灯连续噪声4.电干扰电干扰(偶然噪声偶然噪声)5.检测器中有气泡检测器中有气泡1.流流动相脱气相脱气,加柱后背加柱后背压2.清清洗洗柱柱,净化化

12、样品品,用用HPLC级试剂3.更更换氘灯灯4.采采用用稳压电源源,检查干干扰的的来来源源(如水浴等如水浴等)5.流流动相脱气相脱气,加柱后背加柱后背压45第45页，此课件共46页哦七、七、峰拖尾峰拖尾 1.柱超载柱超载2.峰干扰峰干扰3.硅羟基作用硅羟基作用4.柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效5.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道6.死体积或柱外体积过大死体积或柱外体积过大7.柱效下降柱效下降1.降低降低样品量品量,增加柱直径采用增加柱直径采用较高容量的固定相高容量的固定相2.清清洁样品品,调整流整流动相相3.加加三三乙乙胺胺,用用碱碱致致钝化化柱柱增增加加缓冲冲液液或或盐的的浓度度降降低低流流动相相PH值,钝化化样品品4.更更换烧结不不锈钢,加在加在线过滤器器,过滤样品品5.更更换色色谱柱柱,采用采用较弱腐弱腐蚀性条件性条件6.连接接点点降降至至最最低低,对所所有有连接接点点作作合合适适调整整,尽尽可可能能采采用用细内内径的径的连接管接管7.用用较低腐低腐蚀条件条件,更更换柱柱,采用保采用保护柱柱46第46页，此课件共46页哦