辣根过氧化物酶的提取纯化以及应用课件.ppt

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1、辣根过氧化物酶的提取纯化以及应用第1页，此课件共22页哦辣根过氧化物酶简介辣根，是十字花科多年生直立草本植物，在世界大部分温和地区都有种植。它的根不但可以烹调，同时还含有一种含量丰富的过氧化物酶，这些同工酶统称为“辣根过氧化物酶(HRP)”。其中含量最为丰富的是辣根过氧化物酶同工酶 C(HRP C)现在HRP C的结构与作用机制已经被阐明第2页，此课件共22页哦结构反应机理分离纯化特性分析应用第3页，此课件共22页哦HRP的结构 辣根过氧化物酶同工酶 C是一条由 308个氨基酸组成的肽链。在这条肽链中有 4个由两分子半胱氨酸组成的二硫键,它们分别是 1191、4449、97301和 17209

2、;同时还存在一个由 Asp99和 Arg123组成的盐桥。第4页，此课件共22页哦HRP的结构HRP C含有两个不同的金属中心:正铁原卟啉(即血红素)和两个钙原子。这两个金属中心对酶的整体结构和功能都是非常重要的。通过血红素中铁原子的一个轴向结合点与肽链上 His170侧链的 N原子结合,使血红素垂直连接在 His170上(下图);而卟啉铁的另一个轴向结合点在静态酶中则是空着的,当有 H2O2 存在时,该结合点就能与 CO、氰化物、氟化物或叠氮化物等小分子结合。第5页，此课件共22页哦 HRP C 的部分结构特征第6页，此课件共22页哦 HRP C 三维结构第7页，此课件共22页哦HRP的结构

3、酶的结构总体上看来大部分是螺旋,但其中也包含一些小的 折叠。在血红素平面上下两侧存在着两个空白区域,该区域可能是由钙结合位点与其他结构元素共同作用而成的,也可能是基因复制后留下的产物。第8页，此课件共22页哦HRP的结构在血红素平面的上下两侧存在着两个钙原子的结合位点,它们通过一个氢键群与血红素结合区域相连。每个钙原子都是 7供氧配合体,它们能同时与主肽链上含羰基的氨基酸,侧链上的 Asp、Ser和 Thr,以及一个末端结构水分子结合。钙离子的丢失将会导致 HRP C酶失活和热稳定性的下降,还能使血红素的构型发生改变。第9页，此课件共22页哦HRP的作用机制由 HRP催化的多数反应可由以下等式

4、表示：AH+H2O2 A+2H2O其中 AH是还原性底物,A是自由基。还原性底物包括芳香族化合物,酚类化合物,吲哚,胺类和磺酸盐。第10页，此课件共22页哦 HRP C 以阿魏酸为底物的催化循环第11页，此课件共22页哦催化循环的第一步是 H2O2 和静态酶中的 Fe()反应生成化合物(HRP),HRP是一个高氧化态的催化中间体,包含一个含氧 Fe()中心和一个带正电荷的卟啉。由一分子还原性底物的加入HRP,生成另一个含有含氧 Fe()中心的催化中间体HRP。由一分子还原性底物参加HRP,使 HRP还原成静态酶。图中生成的两个带电子的产物可能会引起更复杂的反应,包括形成二倍体、三倍体、多聚体,

5、以及启动一个以该产物为底物的反应。第12页，此课件共22页哦辣根过氧化物酶的分离纯化新鲜干净辣根匀浆尼龙纱布过滤上清40%-80%硫酸铵盐析沉淀用水溶解并在水中进行透析用-20丙酮制沉淀离心，取上清水溶解并透析第13页，此课件共22页哦辣根过氧化物酶的分离纯化梯度洗脱取第二个酶纯高峰部分在自来水中透析上样于CM-23纤维素上样于DEAE-52取酶活高峰部分浓缩，既得 纯化辣根过氧化物酶梯度洗脱第14页，此课件共22页哦pH对 HRP活力的影响在不同的酸度条件下,分别测定辣根过氧化物酶(HRP)催化 H2O2氧化 OPD的初始反应速率(dA/dt),以 dA/dt对 pH值做图 发现,在 pH值

6、 4.54.75范围内,HRP活力呈上升趋势,至 pH值为 4.75时 HRP活力达到最大.以后随着 pH值的增高,其活力呈下降的趋势.HRP催化 H2O2氧化 OPD体系的最适 pH为 4.75.第15页，此课件共22页哦pH对辣根过氧化物酶活力的影响pH对溶液中 HRP稳定性的影响第16页，此课件共22页哦pH对 HRP稳定性的影响 HRP分别在 pH2.55溶液中保纯 7天后,HRP催化反应速率为 0,说明 HRP在该条件下保纯 7天后已完全失活.在 pH6.08.0范围内,HRP催化反应的初始速率随 pH值的增加而逐渐增大.当 pH值达到 8.0以后反应速率趋于稳定,说明 HRP在偏碱

7、性缓冲液中的稳定性较高,而在酸性条件下 HRP容易失活,其原因可能是由于在碱性条件下酶的结构相对稳定,酶活性处于休眠状态第17页，此课件共22页哦辣根过氧化物酶应用酚类化合物是常见的有毒有机污染物,含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一,它的大量排放对水体、土壤造成严重的污染,进而危害人类的健康。HRP在 H2O2存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。张国平等人对用辣根过氧化物酶处理废水中的五氯酚进行了研究第18页，此课件共22页哦 pH值对去除率的影响 在pH=28 的范围内测定了五氯酚在辣根过氧化物酶和 H2O2 的作用下的去除率。实验结果见左图。由图可见,在 pH 值为

8、4 和 5 时,去除率达95%以上,为最佳 pH 范围。pH值对去除率的影响第19页，此课件共22页哦H2O2 对去除率的影响采用不同的 H2O2 用量与 0.05mmol/L 五氯酚进行实验(辣根过氧化物酶是过量的),测定五氯酚的去除率,结果见左图。当 H2O2 用量为 00.025mmol/L 时,五氯酚去除率按比例上升(也即残余五氯酚浓度按比例下降),表明 H2O2 与 PCP有着固定的反应计量比。当 H2O2 达到 0.025mmol/L 以上时,去除率已达最高,说明这时 H2O2 用量已饱和。H2O2 对去除率的影响第20页，此课件共22页哦不同条件下的去除速率总的来说,反应是相当快

9、的,所有的反应都在15 min内进行了一半以上。当 H2O2/PCP 相同时,酶用量多,则反应速度快。对于 H2O2/PCP=0.5 的 2 个反应,酶用量为0.1 U/mL 时只用 15 min 就获得了 80%以上的去除率,而酶用量为0.05 U/mL 时则用了40 min。当酶用量相同(同为 0.1 U/mL)时,H2O2/PCP=1 时的去除速度比 H2O2/PCR=0.5 时要快,前者只用 8min就获得了 80%以上的去除率,而后者则用了 15min。适度增加 H2O2 可以加快反应,太过量的 H2O2 也会对反应有抑制作用不同条件下的去除速率第21页，此课件共22页哦其他应用辣根过氧化物酶是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。HRP 作为一种标志酶以观测蛋白质和生物膜表面的探针,高质量的HRP 还应用于分子生物学如蛋白质印迹等。但是，目前HRP 尚不能用基因工程生产。第22页，此课件共22页哦