植物生物技术研分子克隆.pptx

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1、DNA克隆克隆r目的：目的：建立繁殖目的基因建立繁殖目的基因的细胞系的细胞系r含义：含义：建立目的建立目的DNA分子分子繁殖体系的过程繁殖体系的过程r三个要素三个要素:目的基因、载目的基因、载体、受体细胞体、受体细胞涉及DNA分子体外重组；转化受体细胞第1页/共58页分子克隆步骤分子克隆步骤-DNA分子体外重组分子体外重组-转化转化-筛选筛选将核酸分子(DNA)插入到可在原核或真核细胞中无性繁殖的载体中，携带外源DNA的载体在宿主细胞内大量复制的过程经过筛选获得单一克隆第2页/共58页2.2 克隆载体要能够独立地在要能够独立地在宿主细胞中复制宿主细胞中复制第3页/共58页载体的功能载体的功能-

2、为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力-为外源基因的表达提供条件为外源基因的表达提供条件载体的功能及其特征载体的功能及其特征第4页/共58页载体的特征（应具备的条件）载体的特征（应具备的条件）-具有对受体细胞的可转移性具有对受体细胞的可转移性-具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点-长度尽可能小，以提高其载装能力长度尽可能小，以提高其载装能力-具有多种单一的酶切位点具有多种单一的酶切位点-具有合适的选择性标记具有合适的选择性标记第5页/共58页载体类型载体类型克隆载体克隆载体表达载体表达载体质粒质粒噬菌体噬菌体粘粒粘粒

3、酵母人工染色体酵母人工染色体细菌细菌F因子；因子；P因子因子目的DNA在宿主细胞中复制目的基因在宿主细胞中复制、表达第6页/共58页质粒质粒质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链环状双链DNA分子（分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA），），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在利影响的能力。分子量在1-200kb之间。之间。一、质粒载体一、质粒载体第7页/共58页

4、质粒的基本特性质粒的基本特性q自主复制性自主复制性携带有自己的复制起始区（携带有自己的复制起始区（ori）一个控制质粒拷贝数的基因；一个控制质粒拷贝数的基因；能独立于宿主细胞的染色体能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制而自主复制拷贝数少则几个，多拷贝数少则几个，多则几百个不等，需要则几百个不等，需要使用宿主细胞复制染使用宿主细胞复制染色体色体DNA的多种酶群的多种酶群第8页/共58页质粒质粒复制子复制子拷贝数拷贝数pBR322及其衍生质粒及其衍生质粒pMB11520pUC系列质粒及其衍生质粒系列质粒及其衍生质粒突变的突变的pMB1500700pACYC及其衍生质粒及其衍生质粒p15A102

5、12pSC101及其衍生质粒及其衍生质粒pSC1015ColE1ColE11520质粒按复制方式可分为两类：质粒按复制方式可分为两类：松弛型复制松弛型复制严谨型复制严谨型复制少于少于1010个拷贝个拷贝第9页/共58页q 可扩增性可扩增性氯霉素扩增：氯霉素扩增：在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑用氯霉素抑制蛋白质合成制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或或ColEI复制复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚每个细胞可以积聚2000

6、-3000个拷贝个拷贝，这叫做氯霉素扩增。，这叫做氯霉素扩增。质粒质粒psc101和和p15A的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物）第10页/共58页q可转移性可转移性在天然条件下，有些天然质粒都可以通过在天然条件下，有些天然质粒都可以通过细菌接合作用细菌接合作用从一种宿主细从一种宿主细胞

7、内转移到另外一种宿主内胞内转移到另外一种宿主内要素：要素：移动基因移动基因mob转移基因转移基因tra转移起始位点转移起始位点bom内部的转移缺口位点内部的转移缺口位点nic顺式元件 bom 及其内部的转移缺口位点 nic，mob基因、tra基因都由质粒提供）第11页/共58页人工构建的载体质粒人工构建的载体质粒m多拷贝多拷贝复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因达到每个细胞数千，用于扩增外源基因m整合质粒整合质粒装有整合促进基因整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受装有整合促进

8、基因整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上体细胞的染色体上m穿梭质粒穿梭质粒含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制m表达载体表达载体装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达源基因在受体细胞内的高效表达第12页/共58页实验室常用质粒实验室常用质粒pBR322该质粒具有以下优点该质粒具有以下优点m分子大小分子大小4363bp，容易纯化，容易纯化;m含有含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记个抗生素抗性基因，可以作为

9、选择标记;m受体细胞内，受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以拷贝，如氯霉素。可以产生大量的重组产生大量的重组pBR322分子。分子。质粒小、转化率高质粒小、转化率高质粒大、拷贝数低质粒大、拷贝数低15kb转化率成为限制因素转化率成为限制因素第13页/共58页pBR322该质粒具有以下优点q分子大小分子大小4363bpq含有含有2个抗生素抗性基因，可以作为选个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有

10、择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被基因内可被PstI,PvuI,SacI切切开，而四环素抗性基因可被开，而四环素抗性基因可被BamHI,HindIII切开，通过插入失活筛选重切开，通过插入失活筛选重组子。组子。q受体细胞内，受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到一般一个细胞内可达到15个，而在蛋个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下如氯霉素，白质合成抑制剂存在条件下如氯霉素，可达到可达到1000-3000拷贝。拷贝。实验室常用质粒实验室常用质粒第14页/共58页 pUC系列载体系列载体 puc系

11、列载体包括系列载体包括4个组成部分：个组成部分：来自质粒来自质粒pBR322的复制起点的复制起点氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(1acz)的启的启动子及编码动子及编码-肽链的肽链的DNA序列（序列（1acZ基基因）因）1acz基因基因5端带有一段端带有一段MCS，但它并，但它并不破坏不破坏lacZ基因的功能基因的功能。在特定的受体细胞中可表现-互补作用，可通过-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反第15页/共58页Figure 4.10.Map of plasmid vect

12、or pUC19.The origin of replication(ori)was derived originally from a ColE1-like plasmid,pMB1.The ampicillin resistance gene(ApR)was derived originally from the plasmid RSF 2124 and permits selection for cells containing the vector molecule.A portion of the lacZ gene is included and is expressed to g

13、ive an amino-terminal fragment of-galactosidase.This is complemented by a mutant lacZ gene in the host cell:the products of the vector and host cell lacZ sequences,although individually inactive,can associate to form a functional product.The 54 bp polylinker multiple cloning site(capital letters)is

14、inserted into the vector lacZ(lower case letters)component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression.However,cloning of an insert into the multiple cloning site(MCS)will cause insertional inactivation,and absence of-galactosidase activity.第16页/共58页在特定的受体细胞中可表现在特定的受体细胞中

15、可表现-互补作用，可通过互补作用，可通过-互补作用形成的蓝色互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。和白色菌落筛选重组质粒。第17页/共58页pGEM-3Z/4ZpGEM-3Z,2743bppGEM-4Z,2746bp在多克隆位点的两在多克隆位点的两端添加了噬菌体的端添加了噬菌体的转录启动子，如转录启动子，如 Sp6 和和 T7 噬菌体的噬菌体的启动子启动子pGEM-3Z 和和 pGEM-4Z 的差别在于二者的差别在于二者互换了两个启动子互换了两个启动子的位置的位置。作用：体外转录作用：体外转录第18页/共58页质粒的制备质粒的制备实验室常采用碱法制备质粒实验室常采用碱法制备质粒碱裂解法碱裂

16、解法F将菌体悬浮在含有将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁F加加NaOH与与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物的混合溶液，去膜、释放内含物F加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分及大部分蛋白质蛋白质F离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶及核酸酶F乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒F无无DNase的的RNase处理残余处理残余RNA第19页/共58页二二 DNA载体载体噬菌体是大肠杆菌的噬菌体

17、噬菌体是大肠杆菌的噬菌体裂解途径裂解途径溶原途径溶原途径第20页/共58页q噬菌体由外壳蛋白和噬菌体由外壳蛋白和-DNA组成；组成；q-DNA为线状双链为线状双链DNA分子，两端各有一个分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘核苷酸的互补单链（粘性末端），称为性末端），称为cos区，全长区，全长48.5kb。5GGGCGGCGACCTNNNN33NN NNCCCGCCGCTGGA5cos48502bpcos第21页/共58页q DNA进入宿主细胞后，粘性末端连接，形成环型分子进入宿主细胞后，粘性末端连接，形成环型分子;q噬菌体含基因噬菌体含基因50个以上，功能相近的聚集成簇个以上，功能相近的

18、聚集成簇Figure 4.12.Map of the genome,showing positions of genes(vertical bars).In replacement vectors,the nonessential region is removed by restriction endonuclease digestion,leaving a left arm and a right arm.A foreign DNA fragment can be ligated to the two arms in place of the original stuffer fragme

19、nt,providing maximal insert sizes of over 20 kb.Genesrequiredforlysogenicfunctionarelocatedinacentralsegmentofthegenome.第22页/共58页噬菌体通过特殊的生物学方式将其噬菌体通过特殊的生物学方式将其DNA导入宿主细胞导入宿主细胞吸附：吸附：注入注入DNA：吸附于大肠杆菌外膜上的LamB受体（正常功能是运转麦芽糖进入细胞内），麦芽糖可诱导这些受体的合成，故它也可促进噬菌体的吸附与感染（尾部吸附）噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子第2

20、3页/共58页此时，此时，噬菌体可选择进入：噬菌体可选择进入：-裂解生长状态裂解生长状态（lyticgrowth）-溶源状态溶源状态（lysogenicstate）将噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞。大量复制并组装成子代噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞）；第24页/共58页包装：包装：包装蛋白在宿主细胞内合成，包包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在装蛋白首先结合在cos区的附近，区的附近，形成包装启动复合物，因此形成包装启动复合物，因此cos区

21、对包装是至关重要的。区对包装是至关重要的。包装时由一个蛋白因子将包装时由一个蛋白因子将cos区区切开，从而保证只有一个切开，从而保证只有一个DNA线状分子被包装，每个宿主细胞线状分子被包装，每个宿主细胞可包装多达可包装多达100个成熟的个成熟的-DNA分子。分子。第25页/共58页包装与包装与DNA本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装包装-DNA分子的分子的75%-105%，也就是说，也就是说可以包装可以包装36.4kb-50.9kb范围内的范围内的DNA，包装好了的，包装好了的-DNA便形成成熟的噬菌体颗粒。便形成成熟的噬菌体颗粒。

22、第26页/共58页裂解裂解每个细胞内容纳了多达每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。第27页/共58页Figure 4.13.In vitro DNA packaging in a phage protein coat can be performed using a mixed lysate of two mutated

23、 lysogens.Normal in vivo packaging of DNA involves first making pre-heads,structures composed of the major capsid protein encoded by gene E.A unit length of DNA is inserted in the pre-head,the unit length being prepared by cleavage at neighboring cos sites.A minor capsid protein D is then inserted i

24、n the pre-heads to complete head maturation,and the products of other genes serve as assembly proteins,ensuring joining of the completed tails to the completed heads.A defect in producing protein E,resulting from an amber mutation introduced into gene E(Eam),prevents pre-heads being formed by BHB268

25、8.An amber mutation in gene D(Dam)prevents maturation of the pre-heads,with enclosed DNA,into complete heads.The components of the BHB2688/BHB2690 mixed lysate,however,complement each others deficiency and provide all the products for correct packaging.Some of the gene products lyse the host cell,al

26、lowing the virions to escape and infect new cells.第28页/共58页噬菌体生活周期的决定噬菌体生活周期的决定噬菌体噬菌体:溶原周期溶原周期；裂解周期裂解周期prophagestateLyticstatecI激活自身的表达；激活自身的表达；关闭关闭cro基因的表达；基因的表达；多数基不因表达多数基不因表达Cro激活自身的表达激活自身的表达;关闭关闭cI基因；基因；多数基因表达多数基因表达Innormallygrowinghostcells,thelysogenicstateisfavoredandthegenomereplicatesalongw

27、iththehostchromosomalDNA.cellsfavorsDamagetohostatransitiontothelyticcycle,enablingthevirustoescapethedamagedcellandinfectnewcells第29页/共58页Thedecisiontoenterthelyticcycleorthelysogenicstateiscontrolledbytworegulatorygenes,cIandcro.第30页/共58页DNA载体载体载体的应用得益于体外包装系统载体的应用得益于体外包装系统J基因到N基因之间的DNA序列对噬菌体的生长不是绝

28、对必需的，可以缺失或被外源基因取代，P基因与Q基因之间的序列缺失也仍然可以作为噬菌体使用。第31页/共58页插入型载体插入型载体经改造后的长度为经改造后的长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为允许的插入片段最大为13.9kb（50.9-37kb）由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。带标记基因。Insertion vectorsLambda vectors used for making cDNA libraries do not

29、 require a large insert capacity(most cDNAs are 300 kb).The resulting recombinants can be transferred with considerable efficiency into bacterial cells using electroporation(a method of exposing cells to high voltages in order to relax the selective permeability of their plasma membranes).However,be

30、cause the resulting bacterial artificial chromosomes(BACs)contain a low copy number replicon,only very low yields of recombinant DNA can be recovered from the host cells(Shizuya et al.,1992).第55页/共58页Bacteriophage P1 vectors and PACsCertain bacteriophages have relatively large genomes,thereby afford

31、ing the potential for developing vectors that can accommodate large foreign DNA fragments.One such is bacteriophage P1 which,like phage ,packages its genome in a protein coat,and 110115 kb of linear DNA is packaged in the P1 protein coat.第56页/共58页P1 cloning vectors have therefore been designed in wh

32、ich components of P1 are included in a circular plasmid.The P1 plasmid vector can be cleaved to generate two vector arms to which up to 100 kb of foreign DNA can be ligated and packaged into a P1 protein coat in vitro.The recombinant P1 phage can be allowed to adsorb to a suitable host,following which the recombinant P1 DNA is injected into the cell,circularizes and can be amplified(Sternberg,1992).第57页/共58页感谢您的观看。第58页/共58页