核酸化学6学习.pptx

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1、（二）核酸功能的发现n1944年,Avery的肺炎球菌转化现象证明了遗传的物质基础是核酸（三）（三）DNA双螺旋结构模型结构的建立nX-射线结晶学技术的进步导致1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型。1958年提出中心法则。n19661966年年NirenbergNirenberg破译了遗传密码破译了遗传密码第1页/共116页DNA双螺旋立体结构两条两条DNA链形成双螺旋结构链形成双螺旋结构 The two strands of DNA form a double helix.第2页/共116页1958Crick提出中心法则第3页/共116页DNA？RNA蛋白质蛋白质复制复

2、制转录转录翻译翻译？第4页/共116页（四）生物技术的兴起n七十年代前期DNA重组技术的建立的基础导致现代生物技术的兴起。（五）人类基因组计划开辟了生命科学的新纪元n1990年人类基因组计划实施庞大的人类基因组计划，在经过各国科学家的多年努力，已取得巨大的成就。n人类基因组的全序列提前到2003、4、14完成。n生命科学已进入了后基因组时代，研究重心已从基因测序转移到基因的功能。n功能基因组学n蛋白质组学n结构基因组学nRNA组学第5页/共116页二 核酸的概念和重要性n(一一)概念概念n核酸是由许多核苷酸单元按一定顺序连接组成的线核酸是由许多核苷酸单元按一定顺序连接组成的线性多聚体，是核蛋白

3、的组分之一，呈酸性，最初从性多聚体，是核蛋白的组分之一，呈酸性，最初从细胞核中发现，所以称核酸。核酸是所有生物遗传细胞核中发现，所以称核酸。核酸是所有生物遗传变异的物质基础。变异的物质基础。n(二二)重要性重要性1.1.与生命活动关系密切，是重要的生命物质。生命与生命活动关系密切，是重要的生命物质。生命的起源、生长、发育、衰老、死亡与之有关。的起源、生长、发育、衰老、死亡与之有关。2.2.核酸研究是现代生命科学研究的核心核酸研究是现代生命科学研究的核心。第6页/共116页n第二节核酸的类别、分布和组成n（一）、类别：P178n核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）。n核糖核酸（RN

4、A）分成三类：1、信使RNA（mRNA）2、转移RNA（tRNA）3、核糖体RNA（rRNA）第7页/共116页n（二）、分布：P178n1、DNA的分布：原核生物集中于核区.真核生物细胞核,线粒体、叶绿体亦含有DNA.原核、真核生物的质粒病毒含有DNA或RNA.第8页/共116页n2、RNA的分布存在于细胞质和细胞核中。发现了许多新的具有特殊功能的RNA：如反义RNA，核酶等.病毒和亚病毒RNA有许多种：正链RNA病毒、负链RNA病毒、类病毒、卫星病毒等.第9页/共116页（三）、组成 P178n1.组成元素:C、H、O、N、Pn2.组成单位:核苷酸第10页/共116页核酸水解产物：核酸水解

5、产物：第11页/共116页n（1）碱基：P179a、嘌呤碱：腺嘌呤（Ade)、鸟嘌呤(Gua)b、嘧啶碱：胞嘧啶(Cyt)、尿嘧啶(Ura)、胸腺嘧啶(Thy)c、稀有碱基:稀有碱基大部分都是甲基化碱基tRNA稀有碱基约占10%第12页/共116页RNA为D-核糖，DNA为D-2-脱氧核糖，二者都是型。差别：2位羟基是否脱氧。（2）核酸中的糖 P180第13页/共116页嘌呤碱基和嘧啶碱基 P179第14页/共116页 n（3）核苷：P180n戊糖与碱基通过-糖苷键相连，CN糖苷键。n糖C1与嘧啶碱N1与嘌呤碱N9相连，碱基与糖环垂直。n根据核苷中所含戊糖的不同，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷。n

6、命名先冠以碱基名称，糖环C加，碱基不加。n核苷的顺式结构和反式结构。nRNA某些修饰化和异构化的核苷，碱基、核糖均可被修饰，主要是甲基化。ntRNA、rRNA还含有少量假尿嘧啶核苷。第15页/共116页核苷第16页/共116页n（4）核苷酸P181n戊糖羟基的磷酸化成核苷酸。n核糖核苷糖环上有3个自由羟基。n脱氧核糖核苷糖环上有2个自由羟基。n环化腺苷酸是细胞功能的调节分子和信号分子。第17页/共116页 碱基相连（核苷）酯键第18页/共116页核苷酸第19页/共116页第20页/共116页DNADNARNARNA化学化学化学化学碱基碱基碱基碱基(base)(base)AATTGCAGCAUU

7、GGC C成分成分成分成分糖糖糖糖(sugar)(sugar)脱氧脱氧脱氧脱氧核糖核糖核糖核糖核糖核糖核糖核糖(deoxyribose)(ribose)(deoxyribose)(ribose)磷酸磷酸磷酸磷酸(phosphoricacid)(phosphoricacid)结构结构结构结构脱氧脱氧脱氧脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸核糖核苷酸 单元单元单元单元deoxyribonucleotideribonucleotidedeoxyribonucleotideribonucleotideDNA与RNA的化学成分第21页/共116页第三节 核酸的结构

8、P186n一、核酸的一级结构P186n（一）核酸中核苷酸的连接方式nDNA、RNA中的脱氧核苷酸、核苷酸是通过3，5磷酸二酯键连接的。n表示方法：书写顺序53。n核酸的一级结构是指核酸分子中各核苷酸残基以磷酸二酯键连接、沿多核苷酸链排列的顺序。第22页/共116页第23页/共116页核苷酸的组成与连接第24页/共116页第25页/共116页1、表示方法n（1）线条式：竖线碳链、碱基、磷酸第26页/共116页n（2）文字式：n5ppppppppp3DNA5ppppppppp3RNAn此式可进一步简化为：n5 353第27页/共116页n(二）DNAn1、DNA的一级结构 P186nDNA的一级结

9、构A、T、G、C通过3，5-磷酸二酯键连接，C1碱基，C2脱氧。n碱基：A、T、G、Cn脱氧核糖n没有侧链第28页/共116页DNA的一级结构图示第29页/共116页2、一级结构特点nDNA的相对分子量非常大，能编码的信息量十分巨大。n细菌的基因是连续的,无内含子功能相关基因，组成操纵子，有共同的调控序列，较少重复序列。n真核生物的基因是断开的，有内含子功能相关基因，不组成操纵子，调控序列占比重大，有较大重复序列,又分为高度重复、中度重复、单一序列。此外还有回文结构.n越是高等的真核生物其调控序列和重复序列的比例越大。第30页/共116页内含子基因内不编码任何蛋白质和RNA的顺序，又称为插入顺

10、序（基因与基因之间非编码顺序称为间隔顺序）。操纵子DNA分子中基因表达的一个协调单位。重复顺序DNA中许多重复排列的核苷酸序列。高度重复顺序“基础顺序”短，含5-100pb,重复106-107次。中度重复顺序“基础顺序”长，含100-300pb或更长,重复几百到几万次。单一顺序单拷贝。大小不等，每一段顺序决定一个蛋白质结构，为一个蛋白基因，称为结构基因。回文结构该结构中脱氧核苷酸的排列在DNA两条链中顺读与倒读其意义是一样的。相关概念第31页/共116页回文结构及其形成的发夹结构和十字架结构回文结构及其形成的发夹结构和十字架结构第32页/共116页n附：一级结构的测定n原理:末端终止法化学法D

11、NA测序仪第33页/共116页n（1）末端终止法：第34页/共116页（2）化学法n硫酸二甲酯使G和A甲基化后，G的糖苷键更容易断裂，甲酸替代硫酸二甲酯后，都断裂；食盐存在时，肼专门断裂C，无食盐存在时，C和T都断裂。第35页/共116页n3、二级结构n（1）、模型建立的依据：P187naChargaff等科学家用纸层析及紫外分光光度技术分析了各种生物的DNA的碱基组成。结果显示：n摩尔数：A=T；G=C；A+C=G+T；A+G=C+T第36页/共116页X-raypictureofDNAX-raypictureofDNAnb、DNA钠盐纤维X-衍射分析：第37页/共116页34A3.4Aan

12、tiparallelMajor grooveMinor groove20A34AnDNA结构模型第38页/共116页DNA结构模型第39页/共116页n（2）、）、DNA双螺旋的结构特征：P187nA、两条反平行多核苷酸链绕中心轴缠绕，右手螺旋；nB、骨架：内侧碱基垂直于纵轴；n外侧磷酸与戊糖、彼此通过3、5磷酸二酯键，糖环平面与纵轴平行。n大沟宽1.2nm，深0.85nm；n小沟宽0.6nm，深0.75nm；nC、直径：2nm，二相邻碱基高度0.34nm，二核苷酸夹角36度度，旋旋转转一一周周10个个核苷酸，一周高度3.4nm；第40页/共116页第41页/共116页nD、碱基互补配对：A、

13、T形成两个氢键；GC形成三个氢键，碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制。第42页/共116页腺嘌呤腺嘌呤胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胞嘧啶碱碱基基之之间间形形成成氢氢键键模模型型第43页/共116页双螺旋平面图The double helix maintains a constant width because purines always face pyrimidines in the complementary A-T and G-C base pairs.The sequence in the figure is T-A,C-G,A-T,G-C.第44页/共116页碱基平面垂直于糖

14、碱基平面垂直于糖-磷酸骨架磷酸骨架Flat base pairs lie Flat base pairs lie perpendicular to perpendicular to the sugar-the sugar-phosphate phosphate backbone.backbone.第45页/共116页n5、DNA二级结构的多态性二级结构的多态性 P190nDNA分子结构可受环境的影响而改变分子结构可受环境的影响而改变nB型DNA：在相对湿度92%下制得的纤维是B型结构，适中。nA型DNA：在相对湿度75%下制得的纤维是A型结构，宽短。nZ型DNA：碱基与中心的倾角9，细细长。长

15、。第46页/共116页 B-DNA A-DNA Z-DNAB-DNA A-DNA Z-DNA 螺旋类型：右手螺旋螺旋类型：右手螺旋 右手螺旋右手螺旋 左手螺旋左手螺旋每圈螺旋含碱基数目：每圈螺旋含碱基数目：10.4 11 1210.4 11 12碱基平面与分子中轴：垂直碱基平面与分子中轴：垂直 几乎垂直几乎垂直 不垂直不垂直 存在状态：存在状态：正常正常 高盐、脱水高盐、脱水 真核基因组真核基因组 生理生理 DNA-RNA DNA-RNA 与基因表达与基因表达 条件条件 异源双链异源双链 调控有关调控有关 (heteroduplex(heteroduplex)DNA的构型第47页/共116页n

16、三链DNA.人工合成DNA发 现，第三股嵌在大沟里。n四链DNAP191第48页/共116页三链DNA结构第49页/共116页n6、三级结构：P193n细长的分子以一种高度压缩状态存在于细胞中，双螺旋的进一步扭曲就构成了三级结构。n超螺旋，三级结构中的一种。nDNA压缩总原则：多级螺旋，4级压缩。第50页/共116页DNA超螺旋结构第51页/共116页叶绿体中含有环状DNA细菌等原核生物细菌等原核生物质粒质粒质粒质粒染色染色染色染色体体体体线粒体中含有环状DNA原核、真核生物环状DNA超螺旋三级结构第52页/共116页n（三）（三）RNAn1、RNA结构的特点结构的特点 P195 RNA与与D

17、NA结构十分相似，二者相比有几点不同：结构十分相似，二者相比有几点不同：（1）核糖核糖;（2）碱基：碱基：A、G、C、U（3）二二者者在在三三维维结结构构上上的的区区别别RNA不不具具有有规规则则的的氢氢键键结结构构，单单链链形形式式存存在在，只只是是回回折折，局局部部配配对，不配对形成突环。对，不配对形成突环。第53页/共116页n2、tRNAP197n由70-90个核苷酸组成，但修饰成分多。在蛋白质合成过程中具有转运氨基酸、识别密码子的作用，在DNA反转录合成及基因表达调控中起着重要的作用。第54页/共116页tRNA有有“接头接头”(adaptor)功能，功能，具备双重特性具备双重特性:

18、识别氨基酸识别氨基酸其其 3末端的腺苷酸可末端的腺苷酸可与一氨基酸共价连与一氨基酸共价连接接识别密码子识别密码子反反密码子与密码子与mRNA中中的密码子碱基配对。的密码子碱基配对。第55页/共116页（1）、结构特点：）、结构特点：A、有有较较多多的的稀稀有有碱碱基基，多多为为转转录后加工而来。录后加工而来。B、3末末端端为为氨氨基基酸酸接接受受臂臂CCA。C、5末端作为末端作为G or C。第56页/共116页n2、二级结构、二级结构三叶草形：三叶草形：n叶柄是双螺旋氨基酸臂；突环三大一小。叶柄是双螺旋氨基酸臂；突环三大一小。nA、接受臂：、接受臂：接受活化接受活化AA，末端为，末端为CCA

19、。nB、TC环：环：假鸟嘧啶，有假鸟嘧啶，有TC顺序。顺序。nC、额额外外环环(可可变变环环）：变变化化最最大大区区域域，不不同同tRNA不同大小额外环。不同大小额外环。nD、反反密密码码环环：7个个核核苷苷酸酸组组成成，环环中中部部反反密码子。三对碱基组成。密码子。三对碱基组成。nE、二二氢氢尿尿嘧嘧啶啶环环：8-12核核苷苷酸酸，两两个个二二氢尿嘧啶。氢尿嘧啶。第57页/共116页接受臂：3端有一游离的CCA顺序，氨基酸通过共价键与A上的2-OH或3-OH相连；TC臂：是假尿嘧啶。该臂上有TC的顺序。反密码子臂：在反密码子环的中间是三联的反密码子。二氢尿嘧啶臂（D臂）：环中含有二氢尿嘧啶。

20、额外臂：变化最大的区域，可分为两类，一类仅含3-5个核苷酸，另一类含有一条较大的臂。第58页/共116页Ala的tRNA结构示意图第59页/共116页Aspace-fillingmodelshowsthatyeasttRNAPhetertiarystructureiscompact.ThetwoviewsoftRNAarerotatedby90.n（3）三三级级结结构构：倒倒L型型：靠靠氢氢键键维持。维持。第60页/共116页靠氢键维持，靠氢键维持，tRNA 三级结三级结构呈构呈L形；形；受体臂顶端的碱基位于受体臂顶端的碱基位于“L”的一个端点，而反密的一个端点，而反密码子臂的套索状结构生成了

21、码子臂的套索状结构生成了“L”的另一端点，分子中的另一端点，分子中两个不同的功能基团是最大两个不同的功能基团是最大限度分离的。这个结构形式限度分离的。这个结构形式与与AA-tRNA合成酶对合成酶对tRNA的识别有关，满足了蛋白质的识别有关，满足了蛋白质合成过程中对合成过程中对tRNA的各种的各种要求。要求。tRNA L形三级结构形三级结构第61页/共116页反密码子环3氨基酸臂第62页/共116页n3、rRNA P199nrRNA占RNA总量的80%以上，核糖体由大小两个亚基组成，大小亚基分别几种rRNA和数十种蛋白质组成。nrRNA与几十种蛋白质组成的细胞颗粒核糖体是细胞内合成蛋白质的工厂。

22、核糖体上催化肽键合成的是rRNA，蛋白质只是维持rRNA的构象，起辅助作用。第63页/共116页MgMg2+2+Mg+Mg2+2+Urea+Urea16srRNA16srRNAProtein:S1,S2,S21Protein:S1,S2,S215srRNA23srRNA5srRNA23srRNAProtein:L1,L2,L34Protein:L1,L2,L3430S30S50S50S70S70S核糖体和核糖体和rRNA的结构和功能的结构和功能第64页/共116页rRNA的二级结构图示的二级结构图示第65页/共116页n4、mRNA P201n（1）原核生物）原核生物mRNA结构特征结构特征

23、P201n原原核核生生物物的的mRNA链链上上有有多多个个编编码码区区（多多个个基基因因），为为多多顺顺反反子子，5和和3端端各各有一段非翻译区。有一段非翻译区。n多多顺顺反反子子：一一个个转转录录本本加加工工而而成成的的mRNA序列中包含多个基团。序列中包含多个基团。n编编码码区区：mRNA中中以以AUG为为起起点点，以以终终止止密密码码子子为为终终点点，编编码码AA的的一一系系列列密密码码子序列。子序列。第66页/共116页n前导区：前导区：mRNA5端编码区前面的非翻译端编码区前面的非翻译序列。序列。n尾区：尾区：mRNA3端终止密码子后非翻译序端终止密码子后非翻译序列。列。原核生物原核

24、生物mRNA结构结构第67页/共116页n（2）真核生物）真核生物mRNA结构特征结构特征 P201n真核生物的真核生物的mRNA都是单顺反子。都是单顺反子。n单单顺顺反反子子：一一个个转转录录本本加加工工而而成成的的mRNA序列只代表一个基因。序列只代表一个基因。nmRNA 5端都有帽子结构。端都有帽子结构。n绝大多数真核生物绝大多数真核生物mRNA具有具有poly(A)尾尾。第68页/共116页真核生物真核生物mRNA的结构模式的结构模式Eukaryotic mRNA is modified by addition of a cap to the 5 end and poly(A)to t

25、he 3 end第69页/共116页真核生物转录常从真核生物转录常从嘌呤核苷酸嘌呤核苷酸开始，第开始，第1个核苷酸保个核苷酸保留留5三磷酸基团，以三磷酸基团，以3位与下一核苷酸位与下一核苷酸5位形成磷酸二位形成磷酸二酯键。转录的起始序列可表示为酯键。转录的起始序列可表示为5PPPAPNPNPNP；在鸟苷酰转移酶催化下在其在鸟苷酰转移酶催化下在其5加入加入G，且连接形式是，且连接形式是5 5三磷酸键。表示为：三磷酸键。表示为：5GPPPAPNPNP+PP+P。“帽帽子子”结结构构第70页/共116页帽子帽子0 0：第第1 1个甲基个甲基在末端鸟嘌呤在末端鸟嘌呤7 7位上，位上，所有真核生物均存所

26、有真核生物均存在此结构。在此结构。帽子帽子1 1：第第2 2个甲基个甲基加到次末端核苷酸加到次末端核苷酸上，具有两个甲基。上，具有两个甲基。在高等真核生物中，在高等真核生物中，如果转录的第如果转录的第1 1个核个核苷酸是苷酸是A A的话，则在的话，则在A A的的N N6 6位上还有一个位上还有一个甲基。甲基。帽子帽子2 2：以帽子以帽子1 1为为底物，在第三个核底物，在第三个核苷酸再加上一个甲苷酸再加上一个甲基。基。“帽子”结构的甲基化第71页/共116页n 帽子结构功能：帽子结构功能：na、增增加加mRNA稳稳定定性性，保保护护mRNA免遭免遭5外切酶的攻击。外切酶的攻击。nb、有有助助于于

27、核核糖糖体体对对mRNA的的识识别别和和结合，使翻译得以正确起始。结合，使翻译得以正确起始。第72页/共116页nmRNA poly(A)尾功能：尾功能：A、防止防止mRNA降解，大大提高了降解，大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。在细胞质中的稳定性。B、是是mRNA穿越核膜由细胞核进入细胞穿越核膜由细胞核进入细胞质的必需形式。质的必需形式。C、与翻译有关；切除与翻译有关；切除poly(A)尾会影响翻尾会影响翻译起始。译起始。第73页/共116页第四节 核酸的性质 P205n一、一般性质一、一般性质n1、外观：、外观：DNA白色纤维状，白色纤维状，RNA白色粉末；白色粉末；n2、溶解性：、溶

28、解性：极性化合物，微溶于水但不溶于乙醇、极性化合物，微溶于水但不溶于乙醇、乙醚、氯仿、三氯醋酸等有机溶剂，常以乙醇进行沉乙醚、氯仿、三氯醋酸等有机溶剂，常以乙醇进行沉淀，其钠盐易溶于水，溶解度与淀，其钠盐易溶于水，溶解度与pH有关；有关；n3、黏度：、黏度：DNA溶液的黏度极高，溶液的黏度极高，RNA溶液的黏度小溶液的黏度小n4 4、颜色反应：、颜色反应：RNARNA与浓与浓HCLHCL和苔黑酚（甲基间苯二酚）和苔黑酚（甲基间苯二酚）共热产生绿色，原因：共热产生绿色，原因：D-D-核糖与酸作用产生糠醛，糠核糖与酸作用产生糠醛，糠醛与甲基间苯二酚作用呈绿色；醛与甲基间苯二酚作用呈绿色；DNADN

29、A与强酸和二苯胺与强酸和二苯胺一同加热呈蓝色，原因：一同加热呈蓝色，原因：D-2-D-2-脱氧核糖与酸作用产生脱氧核糖与酸作用产生-羟基羟基-酮戊醛，后者与二苯胺作用呈蓝色。酮戊醛，后者与二苯胺作用呈蓝色。第74页/共116页二、核酸的水解：n1 1、酸水解：、酸水解：n磷酸酯键与糖苷键对酸的敏感程度不同。磷酸酯键与糖苷键对酸的敏感程度不同。n磷酸酯键比糖苷键稳定；磷酸酯键比糖苷键稳定；n嘌呤的糖苷键比嘧啶糖苷键更不稳定；嘌呤的糖苷键比嘧啶糖苷键更不稳定；n嘌呤与脱氧核糖的糖苷键最不稳定嘌呤与脱氧核糖的糖苷键最不稳定 。n2 2、碱水解、碱水解nRNARNA的磷酸酯键易被碱水解；的磷酸酯键易被

30、碱水解；DNADNA的磷酸酯键对碱稳定。的磷酸酯键对碱稳定。原因：原因：na a、RNARNA核糖上核糖上2 2-OH-OH基，在碱性条件下形成磷酸三酯，基，在碱性条件下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生2 2，3 3环磷酸酯，环磷酸酯，进而分解成进而分解成2 2或或3 3核苷酸，溶液成为混合液。核苷酸，溶液成为混合液。nb b、DNADNA核糖上无核糖上无2 2-OH-OH基，不能形成磷酸三酯中间物，基，不能形成磷酸三酯中间物，因此可以抵抗碱水解。因此可以抵抗碱水解。第75页/共116页RNA链水解链水解RNA水解后生成一个水解后生成一个2,3环式

31、单核苷酸中间体；环式单核苷酸中间体；中间体不稳定，很快转变为中间体不稳定，很快转变为2单核苷酸和单核苷酸和3单核苷酸单核苷酸第76页/共116页3、酶水解：n核糖核酸酶核糖核酸酶nA、牛胰核糖核酸酶：、牛胰核糖核酸酶：n专专一一性性切切割割位位点点：嘧嘧啶啶核核苷苷-3-磷磷酸酸与与其其它核苷酸之间的连键。它核苷酸之间的连键。n产产物物：3-嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸；或或以以3-嘧嘧啶啶核核苷苷酸结尾的寡核苷酸。酸结尾的寡核苷酸。n水解机制：同碱相似。水解机制：同碱相似。第77页/共116页nB、核糖核酸酶、核糖核酸酶T1n 专专一一性性切切割割位位点点：3-鸟鸟苷苷酸酸与与其其相相邻邻的的5-核

32、苷酸之间的连键。核苷酸之间的连键。n产产物物：3-鸟鸟苷苷酸酸；或或以以3-鸟鸟苷苷酸酸结结尾尾的寡核苷酸。的寡核苷酸。nC、核糖核酸酶、核糖核酸酶T2n专专一一性性切切割割位位点点：3-腺腺苷苷酸酸与与其其相相邻邻的的5-核苷酸之间的连键。核苷酸之间的连键。n产物：产物：3-腺苷酸结尾的寡核苷酸。腺苷酸结尾的寡核苷酸。第78页/共116页n脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶nA、牛胰脱氧核糖核酸酶：、牛胰脱氧核糖核酸酶：切断双链或单链切断双链或单链DNA成为成为5-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度4个核苷酸。个核苷酸。nB、牛脾脱氧核糖核酸酶：、牛脾脱氧核糖核酸酶：切断

33、双链或单链切断双链或单链DNA成为成为3-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度6个核苷酸。个核苷酸。nC、链球菌脱氧核糖核酸酶：、链球菌脱氧核糖核酸酶：产物为产物为5-磷酸为磷酸为末端的寡核苷酸，长短不一。末端的寡核苷酸，长短不一。nD、限制性内切酶：、限制性内切酶：在细菌中发现这类酶，主在细菌中发现这类酶，主要降解外源要降解外源DNA，对自身，对自身DNA无作用。无作用。第79页/共116页n限限制制性性内内切切酶酶特特点点：切切割割位位点点往往往往是是回回文文结结构构；具具有有高高度度专专一一性性，识识别别双双链链特特定定的的位位点点，将将两两条条链链切切开开成成粘

34、粘性性、平平头头末末端端；用用于于染染色色体体结结构构分分析析、基基因因测测序序的分析、基因的体外重组。的分析、基因的体外重组。第80页/共116页第81页/共116页三、核酸的酸碱解离性质(参见P182)n1、碱基的解离、碱基的解离n嘧嘧啶啶和和嘌嘌呤呤化化合合物物杂杂环环中中的的氮氮和和取取代代基基具具有有结结合合和和释释放放质质子子的的能能力力，因因此此是是兼兼性性离离子子，即即是是两两性性电解质。电解质。n胞嘧啶的解离；胸腺嘧啶的解离；胞嘧啶的解离；胸腺嘧啶的解离；n腺嘌呤的解离；鸟嘌呤和次黄嘌呤的解离；腺嘌呤的解离；鸟嘌呤和次黄嘌呤的解离；n2、核苷的解离：、核苷的解离：糖的存在增加

35、了酸性解离糖的存在增加了酸性解离n3、核苷酸的解离：、核苷酸的解离：n磷酸基的存在，使核苷酸具有较强的酸性。磷酸基的存在，使核苷酸具有较强的酸性。第82页/共116页n四、核酸的紫外吸收：四、核酸的紫外吸收：参见参见P182n核核酸酸中中碱碱基基环环的的共共轭轭双双键键对对240290nm波波段段紫紫外外光光有有强强烈烈吸吸收收。最最大大光光吸吸收收值值在在260nm，是是核核酸酸定定量量以以及及定定性性的的基基础础。由由于于蛋蛋白白质质在在此此光光区区仅仅有有弱弱吸吸收收，故故可可以以此此特性来测定核酸在细胞和组织中的分布。特性来测定核酸在细胞和组织中的分布。n用用A260/A280的比值可

36、以判断样品的纯度：的比值可以判断样品的纯度：n纯纯DNA的的A260/A280比值应为比值应为1.8,n纯纯RNA应为应为2.0；n摩尔吸光系数摩尔吸光系数(P)值；值；(P)=A/CL。第83页/共116页n（一）变性：（一）变性：（P208）n1、概概念念：许许多多因因素素可可以以破破坏坏氢氢键键，氢氢键键破破坏坏后后的的核核酸酸的的双双螺螺旋旋结结构构变变成成单单链链的的，成成为为“无无规规线线团团”，此此作作用用称称为为核核酸酸的的变变性性。变变性性是是双双螺螺旋旋氢氢键键的的断断裂裂，不不涉涉及及共共价价键键（磷磷酸酸二二酯酯键键）断断裂裂。（如如果果磷磷酸酸二二酯酯键键断裂则叫降解

37、，此时分子量降低）断裂则叫降解，此时分子量降低）n2、引起变性的因素：、引起变性的因素：n1）温度的升高；温度的升高；n2）碱酸度改变；碱酸度改变；n3）某些变性剂：尿素、甲醛等。某些变性剂：尿素、甲醛等。五、核酸的变性、复性及杂交五、核酸的变性、复性及杂交 P208第84页/共116页3、变性的特点：n1）结构变成无规则线团；结构变成无规则线团；n2）260nm紫紫外外吸吸光光度度急急剧剧升升高高；粘粘度度下下降；生物活性丧失降；生物活性丧失n3）爆爆发发式式，变变性性发发生生在在很很窄窄的的温温度度范范围围，有一个相变的过程。有一个相变的过程。n熔熔解解温温度度（Tm值值）：双双螺螺旋旋失

38、失去去一一半半时时的温度。的温度。也叫熔点、解链温度。也叫熔点、解链温度。第85页/共116页DNA变性曲线变性曲线第86页/共116页4、影响DNA的Tm的因素：n（1）DNA均一性：均一性：n均质均质DNA熔解过程在一个较窄的温度范围内；熔解过程在一个较窄的温度范围内；异质异质DNA熔解过程在一个较宽的温度范围内。熔解过程在一个较宽的温度范围内。n（2）G-C含量：含量：nG-C含量越高含量越高Tm值愈高；值愈高；n原因：原因：GC ATn测定测定Tm可以推算出可以推算出DNA碱基的百分组成。碱基的百分组成。n经验公式：经验公式：XG-C=（Tm-69.3)X2.44；第87页/共116页

39、（3）介质离子强度）介质离子强度n离子强度较低的介质中离子强度较低的介质中,Tm值较低值较低,熔解熔解温度范围较宽；温度范围较宽；n离子强度较高的介质中离子强度较高的介质中,Tm值较高值较高,熔解熔解温度范围较窄。温度范围较窄。nRNA的变性：的变性：n螺旋区较少螺旋区较少,变性变性Tm值较低；值较低；tRNA螺旋螺旋区较多区较多,变性变性Tm值较高，类似于值较高，类似于DNA。第88页/共116页（二）复性（二）复性（P209）n变变性性后后DNA两两条条分分开开的的链链重重新新特特异异的的组组合合而而恢恢复复双双螺螺旋旋结结构构和和性性质质，这这种种作作用用称称复复性性。复复性性可可部部分

40、分恢恢复复理理化化性性质质，变变性性DNA骤骤然然降降温温不不能能复复性性，据据此此可可制制备备单链核酸探针。单链核酸探针。n缓缓慢慢冷冷却却复复性性称称退退火火。片片段段越越大大复复性性越越慢；浓度越大复性越快。慢；浓度越大复性越快。第89页/共116页n单核苷酸单核苷酸(P)值大于单链多核苷酸；值大于单链多核苷酸；n单链核苷酸单链核苷酸(P)值大于双链核苷酸，值大于双链核苷酸，n因因此此核核酸酸变变性性时时,(P)值值增增高高，称称增增色色效效应应；核核酸酸复复性性时时,(P)值值降降低低，称称减减色色效效应。应。n常常用用核核酸酸溶溶液液紫紫外外吸吸收收值值的的变变化化作作为为变变性或复

41、性的指标。性或复性的指标。第90页/共116页 双螺旋呼吸：双螺旋呼吸：双链双链DNADNA配对碱基的氢键不断处于断裂和再配对碱基的氢键不断处于断裂和再生状态中，特别是在稳定性较低的富含生状态中，特别是在稳定性较低的富含A-TA-T的区段。在微观上，常常出现瞬间的单链的区段。在微观上，常常出现瞬间的单链泡状结构，这种现象称为双螺旋的泡状结构，这种现象称为双螺旋的呼吸作呼吸作用用。一些蛋白质可识别这种结构，并在单。一些蛋白质可识别这种结构，并在单链结构下阅读和识别链结构下阅读和识别DNADNA内部所含信息。内部所含信息。第91页/共116页（三）杂交（三）杂交（P210）nDNA的变性在一定条件

42、下是可逆的，的变性在一定条件下是可逆的，而相同来源的而相同来源的DNA分子容易通过这种分子容易通过这种方式进行杂交，甚至不同来源的方式进行杂交，甚至不同来源的DNA以及多核糖核苷酸与多脱氧核糖核苷以及多核糖核苷酸与多脱氧核糖核苷酸之间也可以进行杂交。酸之间也可以进行杂交。n1、概念：、概念：不同来源的分子，经热变不同来源的分子，经热变性后冷却复性，如异源间某些区域有性后冷却复性，如异源间某些区域有相同的序列，则会形成杂交分子。相同的序列，则会形成杂交分子。第92页/共116页核酸杂交核酸杂交Filter hybridization establishes whether a solution

43、of denatured DNA(or RNA)contains sequences complementary to the strands immobilized on the filter.第93页/共116页n 样品酶解琼脂糖电泳分离变性、转移硝酸纤维薄膜只吸收单链与放射性探针杂交十小时，洗涤烘干放射自显影，可探知或分离互补系列DNA2、southern（Edwen Southern）杂交：（印记技术、固相杂交）（P428）第94页/共116页样品酶解琼脂糖电泳分析变性转移硝酸纤维薄膜只吸收单链与放射性探针杂交十小时洗涤烘干放射自显影第95页/共116页第96页/共116页3、DNA聚

44、合酶链反应（PCR）（P423）原理：1）变性：通过加热使双链DNA变成单链DNA。2）退火：温度突然降低，引物与模板链局部形成杂交链。3）延伸：在DNA聚合酶的作用下，进行DNA链延伸反应。以上三步为一个循环。第97页/共116页基本步骤：a、设计一对引物：应尽量减少非特异产物。b、优化反应体系：适量模板，引物，4种dNTP,TaqDNA聚合酶,Mg2+。c、选择热循环温度：变性温度，退火温度，延伸温度。d、鉴定扩增产物：一般用凝胶电泳。第98页/共116页5.核酸的分离和纯化n一、分离的一般原则一、分离的一般原则n要保持天然性，因此要求在提取过程中要保持天然性，因此要求在提取过程中掌握下列

45、原则：掌握下列原则：n1、防止核酸酶的降解；、防止核酸酶的降解；n2、防止化学因素的降解；、防止化学因素的降解；n3、防止物理因素的降解。、防止物理因素的降解。第99页/共116页二、DNA的分离纯化n预处理：将细胞提取物用1Mol/LNaCl溶解，然后稀释至0.14Mol/L，离心，沉淀为DNP，（溶液中含RNP）。DNP的蛋白质部分可用下列方法除去：n1、苯酚法n2、辛醇氯仿法n3、SDS法n将不同构象的DNA进行分离：n蔗糖密度梯度超离心大小不等的线性DNA分开，也可将分子量相同而构象不同的DNA分开；n氯化铯密度梯度平衡超离心双股DNA和单股DNA分开；n氯化铯-溴化乙锭梯度离心双链D

46、NA的环状DNA和线状DNA分开。n羟基磷灰石（HA）或白蛋白硅藻土（MAK）柱层析分离变性DNA和天然DNA。第100页/共116页三、RNA的分离纯化n预处理：细胞均浆进行差速离心，制得细胞核、叶绿体、线粒体、核糖体等细胞器和细胞溶质，然后再从这些细胞器中分离某一类RNA。RNP除蛋白的方法与DNP除蛋白的方法相似。nRNA的提取多采用酚提取法n进一步纯化多种方式：密度梯度离心、DEAE纤维素、DEAESephadex、甲基化白蛋白硅藻土等各种特异柱层析、特异亲和层析（分离mRNA)、免疫法（分离mRNA)等。聚丙烯酰胺凝胶电泳、羟基磷灰石柱层析、凝胶过滤法也常用于分离纯化RNA。第101

47、页/共116页n6.核酸的分析测定n1、紫外吸收法：测碱基n2、定糖法：RNA戊糖糠醛苔黑酚三氯化铁绿色nDNA脱氧戊糖羟基酮醛+二苯胺蓝色n3、定磷法：样品灰化：浓硫酸或过氯酸处理生成无机磷钼酸胺磷钼酸+还原剂钼蓝。第102页/共116页7.核酸的生物学功能n一、核酸与遗传信息的传递n1、DNA是基本的遗传物质n在遗传过程中，DNA的具体作用有2方面：nA、在细胞分裂是按照自己的结构精确复制传给子孙；nB、作为模板将所储遗传信息传给mRNA。第103页/共116页nA、RNA参与蛋白质的生物合成rRNA占细胞总RNA的80%，它是装配者并起催化作用.tRNA占细胞总RNA的15%，它是转换器

48、，携带氨基酸并起解译作用.mRNA占细胞总RNA的35%，它是信使，携带DNA的遗传信息,并起蛋白质合成的模板作用.2、RNA在传递遗传信息上的作用第104页/共116页rRNAmRNAtRNA第105页/共116页nB、RNA功能的多样性控制蛋白质合成.作用于RNA转录后加工与修饰.基因表达与细胞功能的调节.生物催化与其他细胞持家功能.遗传信息的加工与进化.第106页/共116页蛋白质外壳蛋白质外壳蛋白质外壳蛋白质外壳RNARNA无感染力无感染力无感染力无感染力有感染力有感染力有感染力有感染力可产生新可产生新可产生新可产生新TMVTMV病毒病毒病毒病毒水和苯酚水和苯酚水和苯酚水和苯酚C C、

49、有些病毒的遗传物质是、有些病毒的遗传物质是RNARNA有些病毒只含有RNA和蛋白质，不含有DNA,称为RNA病毒，又叫做逆转录病毒。如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)，其遗传物质是RNA。第107页/共116页二、核酸结构改变与生物变异 任何一对碱基的改变或增减，都可以导任何一对碱基的改变或增减，都可以导致生物的变异。致生物的变异。DNA结构的改变即导致结构的改变即导致蛋白质结构的改变，从而引起生物遗传蛋白质结构的改变，从而引起生物遗传的变异。的变异。三、核酸与病变三、核酸与病变1、核酸与遗传性疾病、核酸与遗传性疾病2、核酸与病毒性疾病、核酸与病毒性疾病第108

50、页/共116页四、DNA与细菌转化细菌转化实验噬菌体侵染实验这些实验都证明了DNA是主要遗传物质有些病毒的遗传物质是RNA.第109页/共116页细菌的遗传物质是DNA的转化实验图示Griffith(1928)Griffith(1928)Griffith(1928)Griffith(1928)发现肺炎双球菌转化，发现肺炎双球菌转化，发现肺炎双球菌转化，发现肺炎双球菌转化，Avery Avery Avery Avery(1944)(1944)(1944)(1944)证实转化因子是证实转化因子是证实转化因子是证实转化因子是DNADNADNADNA而不是蛋白质，证实了而不是蛋白质，证实了而不是蛋白质