核酸的物理化学性质精选PPT.ppt

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1、关于核酸的物理化学性质第1页，讲稿共49张，创作于星期二 一一.核酸的水解核酸的水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。解切断。DNA和和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，溶液中，RNA几乎可以几乎可以完全水解，生成完全水解，生成2-或或3-磷酸核苷；磷酸核苷；DNA在同样条件在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上核糖基上2-OH参与作用有很大的关系。在参与作用有很大的关系。在RNA水水解时，

2、解时，2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用下形成水解时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用下形成水解产物。产物。第2页，讲稿共49张，创作于星期二酸易水解酸易水解N-糖苷键糖苷键，嘌呤碱基比嘧啶碱基易，嘌呤碱基比嘧啶碱基易被酸水解，脱氧核糖比核糖的糖苷键易水解，被酸水解，脱氧核糖比核糖的糖苷键易水解，DNA的嘌呤碱在的嘌呤碱在pH2以下即脱落而成嘌呤以下即脱落而成嘌呤酸。酸。碱易水解碱易水解磷酸酯键磷酸酯键，RNA在在0.3N碱中即被水碱中即被水解，解，DNA对碱相对稳定。对碱相对稳定。第3页，讲稿共49张，创作于星期二第4页，讲稿

3、共49张，创作于星期二第5页，讲稿共49张，创作于星期二 酶水解酶水解生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。链中的磷酸二酯键。核酸酶的分类核酸酶的分类按按底底物物专专一一性性分分：以以DNA为为底底物物的的DNA水水解解酶酶（DNases）和以和以RNA为底物的为底物的RNA水解酶（水解酶（RNases）。）。按作用方式分：按作用方式分：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶和核酸内切酶。核核酸酸外外切切酶酶的的作作用用方方式式是是从从多多聚聚核核苷苷酸酸链链的的一一端端（3-端端或或5-端端）开开始始，逐

4、逐个个水水解解切切除除核核苷苷酸酸；核核酸酸内内切切酶酶的的作作用用方方式式刚刚好好和和外外切切酶酶相相反反，它它从从多多聚聚核核苷苷酸酸链链中中间间开开始始，在在某某个个位位点点切切断断磷磷酸酸二酯键。二酯键。按作用键分：水解按作用键分：水解3-磷酸酯键和磷酸酯键和5-磷酸酯键的核酸酶，产磷酸酯键的核酸酶，产物分别是物分别是5-磷酸核苷和磷酸核苷和3-磷酸核苷磷酸核苷第6页，讲稿共49张，创作于星期二 核糖核酸酶举例核糖核酸酶举例牛牛胰胰核核糖糖核核酸酸酶酶（RNase I）,内内切切酶酶，水水解解嘧嘧啶啶3-磷磷酸酸和和其其他他核核苷苷酸酸5 -OH形形成成的的酯酯键键，产产生生3 -磷磷

5、酸酸核核苷。苷。核核糖糖核核酸酸酶酶T1，内内切切酶酶，发发现现于于米米曲曲霉霉，水水解解3 -鸟鸟苷苷酸酸与与其其他他核核酸酸5 -OH形形成成的的酯酯键键，产产物物为为3 -鸟苷酸为末端的寡核苷酸。鸟苷酸为末端的寡核苷酸。第7页，讲稿共49张，创作于星期二脱氧核糖核酸酶举例脱氧核糖核酸酶举例1.牛牛胰胰脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸酶酶（DNase I），内内切切酶酶，水水解解DNA 3 -磷磷酸酸酯酯键键，产产生生5 -磷磷酸酸的的寡寡核核苷苷酸酸，平平均均长长度度为为4个个核核苷酸。苷酸。2.牛牛脾脾脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸酶酶（DNase II），内内切切酶酶，水水解解DNA 5 -磷磷酸

6、酸酯键，产生酯键，产生3-磷酸的寡核苷酸，平均长度为磷酸的寡核苷酸，平均长度为6个。个。3.限限制制性性内内切切酶酶，可可识识别别特特异异的的碱碱基基序序列列并并水水解解断断开开，产产物物带带5 -磷磷酸基，已发现数千种，是基因工程的重要工具酶。酸基，已发现数千种，是基因工程的重要工具酶。N-糖苷酶糖苷酶 水解糖苷键，产物为含氮碱基和无碱基末湍的寡核苷酸水解糖苷键，产物为含氮碱基和无碱基末湍的寡核苷酸第8页，讲稿共49张，创作于星期二第9页，讲稿共49张，创作于星期二第10页，讲稿共49张，创作于星期二第11页，讲稿共49张，创作于星期二第12页，讲稿共49张，创作于星期二第13页，讲稿共49

7、张，创作于星期二 二二.核酸的酸碱性质核酸的酸碱性质两性解离两性解离：DNA无，只有酸解无，只有酸解，碱基被屏蔽（在分子碱基被屏蔽（在分子内部形成了氢键）。内部形成了氢键）。RNA有两性解离，有有两性解离，有pI。核酸核酸的碱基的碱基、核苷核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质性电解质碱碱基基的的解解离离：嘧嘧啶啶和和嘌嘌呤呤环环上上的的N及及各各取取代代基基具具有有结结合和释放质子的能力。合和释放质子的能力。核苷的解离核苷的解离：碱基和核糖具有结合和释放质子的能力：碱基和核糖具有结合和释放质子的能力核核酸酸的的解解离离：磷磷酸酸基基具具有有较较强强的的

8、酸酸性性，核核酸酸的的两两性性解解 离离 主主 要要 决决 定定 于于 磷磷 酸酸 基基 和和 含含 氮氮 碱碱 基基。第14页，讲稿共49张，创作于星期二 三三.核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤碱和在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在一般在260nm左右有最大吸收峰，左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。测定的依据。以以A260/A280进行定性、定量进行定性、定量DNA和和RNA溶液中加入溶液中加入溴化乙溴化乙锭（锭（

9、EB），在紫外线下发出荧在紫外线下发出荧光。光。用用A260/A280还可用来表示核酸还可用来表示核酸的纯度：的纯度：大于大于1.8，DNA很纯；很纯；大于大于2，RNA很纯。很纯。第15页，讲稿共49张，创作于星期二样品中如含有杂蛋白及苯酚，比值明显样品中如含有杂蛋白及苯酚，比值明显降降低低。对于纯的样品，只要读出对于纯的样品，只要读出260nm的的A值即可值即可算出含量。通常以算出含量。通常以A值为值为1相当于相当于50g/ml 双双螺旋螺旋DNA，或或40 g/ml单链单链DNA（或或RNA），或或20 g/ml寡核苷酸寡核苷酸计算。计算。第16页，讲稿共49张，创作于星期二有时核酸的紫

10、外吸收以有时核酸的紫外吸收以摩尔磷的吸光度摩尔磷的吸光度来表示，来表示，摩尔磷即相摩尔磷即相当于摩尔核苷酸当于摩尔核苷酸。先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数系数(P)。(P)=A/cLA为吸收值，为吸收值，c为每升溶液中磷的摩尔数，为每升溶液中磷的摩尔数，L为比色杯内径。为比色杯内径。c=每升中磷的重量（克）每升中磷的重量（克）W/磷的原子量（磷的原子量（30.98）(P)=30.98 A/WL一般天然一般天然DNA的的(P)为为6 600，RNA为为7 700-7 800。核酸的。核酸的(P)值较所含核苷酸单体

11、的值较所含核苷酸单体的(P)要低要低40%-45%。单链多核苷酸的单链多核苷酸的(P)值比双螺旋结构多核苷酸的值比双螺旋结构多核苷酸的(P)要高，所要高，所以核酸发生变性时，以核酸发生变性时，(P)升高约升高约25%，此现象称为，此现象称为增色效应增色效应（hyperchromic effect）。复性后复性后(P)又降低，这现象称又降低，这现象称减色减色效应效应(hypochromic effect)。第17页，讲稿共49张，创作于星期二四四.核酸的变性，复性及杂交核酸的变性，复性及杂交(一一)变性变性稳定核酸双螺旋的次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构稳定核酸双螺旋的次级键断裂，空间结构

12、破坏，变成单链结构的过程。的过程。核酸的一级结构核酸的一级结构(核苷酸顺序核苷酸顺序)保持不变。保持不变。变性表征变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）增加（增色效应）变性因素变性因素 pH（11.3或或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度低离子强度 加热加热第18页，讲稿共49张，创作于星期二第19页，讲稿共49张，创作于星期二 热变性与热变性与TmDNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达区间

13、内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称最大量一半时的温度称熔解温度熔解温度，用，用Tm表示。表示。（或者把加热变性使（或者把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的双螺旋结构失去一半时的温度称为该的温度称为该 DNA的熔点或熔解温度）。的熔点或熔解温度）。一般一般DNA的的Tm值在值在82-95 C之间。之间。第20页，讲稿共49张，创作于星期二第21页，讲稿共49张，创作于星期二DNA的的Tm值大小与下列因素有关：值大小与下列因素有关：（1）DNA的均一性。均质的均一性。均质DNA，如一些病毒的如一些病毒的DNA，人工合成的人工合成的poly d(A-T),poly d(

14、G-C)熔解过程发生熔解过程发生在一个较小的范围内。异质在一个较小的范围内。异质DNA熔解的过程发生在熔解的过程发生在一个较宽的范围内。所以一个较宽的范围内。所以Tm 值可作为衡量值可作为衡量DNA样样品均一性的标准。品均一性的标准。（2）分子中）分子中G和和C的含量。的含量。G和和C的含量高，的含量高，Tm值高值高。因而测定。因而测定Tm值，可反映值，可反映DNA分子中分子中G,C含量，可通过经验公式计算：含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)2.44（3）介质的离子强度。一般离子强度较低的介质中，）介质的离子强度。一般离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，而且溶解

15、温度的范围较宽。的熔解温度较低，而且溶解温度的范围较宽。第22页，讲稿共49张，创作于星期二第23页，讲稿共49张，创作于星期二第24页，讲稿共49张，创作于星期二第25页，讲稿共49张，创作于星期二盐浓度对盐浓度对DNA变性的影响变性的影响第26页，讲稿共49张，创作于星期二第27页，讲稿共49张，创作于星期二RNA的变性的变性：RNA也具有螺旋也具有螺旋 线团之间的线团之间的转变。但这种较变不如转变。但这种较变不如DNA明显。变性曲线明显。变性曲线不陡，不陡，Tm值较低。值较低。tRNA具有较多的双螺旋区，具有较多的双螺旋区，所以具有较高的所以具有较高的Tm值，变性曲线也较陡。值，变性曲线

16、也较陡。第28页，讲稿共49张，创作于星期二第29页，讲稿共49张，创作于星期二第30页，讲稿共49张，创作于星期二 （二）复性（二）复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。旋结构的过程称为复性。DNADNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有能得到部分的恢复，具有减色效应减色效应。将热变性的将热变性的DNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变不可能复性。变性的性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为缓慢冷却时可复

17、性，因此又称为“退火退火”。退火温度退火温度Tm25复性影响因素复性影响因素 片段浓度片段浓度/片段大小片段大小/片段复杂性（重复序列数目）片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度溶液离子强度第31页，讲稿共49张，创作于星期二第32页，讲稿共49张，创作于星期二将热变性的将热变性的DNA骤然冷却时，骤然冷却时，DNA不可能复性不可能复性DNA的片段越大，复性越慢的片段越大，复性越慢DNA的浓度越大，复性越快的浓度越大，复性越快在一定条件下，复性反应的速度用在一定条件下，复性反应的速度用Cot 1/2来衡量，来衡量，Co为变性为变性DNA复性时的初始浓度，复性时的初始浓度，t为时间，为时间，C

18、ot 表示复性一半时的表示复性一半时的DNA浓度。浓度。两种浓度相同但来源不同的两种浓度相同但来源不同的DNA，复性时间的长短复性时间的长短与基因组的大小有关与基因组的大小有关有很多重复序列的有很多重复序列的DNA复性也快复性也快第33页，讲稿共49张，创作于星期二第34页，讲稿共49张，创作于星期二第35页，讲稿共49张，创作于星期二 （三）核酸的杂交三）核酸的杂交DNA单链与在某些区域有互补序列的异源单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链单链或或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交分子称为杂交DNA分子。分子。核酸的杂交在分子生物学

19、和遗传学的研究中具有重核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。要意义。Southern 杂交（杂交（Southern bolting）Northern 杂交（杂交（Northern bolting）Western 杂交杂交（Western bolting）第36页，讲稿共49张，创作于星期二vv核酸分子杂交（核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技技术术 核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在19681968年由华盛顿卡内基年由华盛顿卡内基年由华盛顿卡内基年由华盛顿卡内基学院（学院（学院（学院（Cavnegie Ins

20、titute of WashingtonCavnegie Institute of Washington）的的的的Roy Roy BrittenBritten及其同事发明的。所依据的原理是，及其同事发明的。所依据的原理是，及其同事发明的。所依据的原理是，及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补带有互补带有互补带有互补的特定核苷酸序列的单链的特定核苷酸序列的单链的特定核苷酸序列的单链的特定核苷酸序列的单链DNADNA或或或或RNARNA，当它们混当它们混当它们混当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双合

21、在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。链的结构。链的结构。链的结构。第37页，讲稿共49张，创作于星期二核酸的杂交核酸的杂交第38页，讲稿共49张，创作于星期二核酸分子杂交的意义：核酸分子杂交的意义：发现原核生物的基因是连续基因，而真核生物的发现原核生物的基因是连续基因，而真核生物的基因是断裂基因。基因是断裂基因。连续基因连续基因：基因中的：基因中的bp序列能够连续的在成熟的蛋序列能够连续的在成熟的蛋白质中找到其相应的白质中找到其相应的AA，电镜显示这种基因能够电镜显示这种基因能够和它的成熟和它的成熟mRNA形成平滑的杂交分子。形成平滑的杂交分子。断裂基因断裂基因：基因中的：基因中

22、的bp序列能够断续的在成熟的蛋白序列能够断续的在成熟的蛋白质中找到其相应的质中找到其相应的AA，电镜显示这种基因和它的成电镜显示这种基因和它的成熟熟mRNA只能形成带泡的杂交分子。只能形成带泡的杂交分子。发现癌基因的普遍性发现癌基因的普遍性：肿瘤病毒的：肿瘤病毒的RNA能够与人类能够与人类正常的正常的DNA分子形成带泡的杂交分子形成带泡的杂交分子。第39页，讲稿共49张，创作于星期二核酸分子杂交的技术核酸分子杂交的技术Southern Blotting（南印迹）南印迹）：用于钓基因，即用已知的：用于钓基因，即用已知的DNA单链或单链或RNA，钓取未知钓取未知DNA分子中的基因，方法如下：分子中

23、的基因，方法如下：未知的未知的DNA-DNA限制性内切酶限制性内切酶 DNA片段片段 琼脂糖电琼脂糖电泳分离泳分离 碱液变性碱液变性 影印在硝酸纤维薄膜上影印在硝酸纤维薄膜上 与放射性标记与放射性标记的已知的已知DNA单链或单链或RNA杂交杂交 放射自显影放射自显影Northern Blotting（北印迹）北印迹）：用已知的：用已知的DNA钓钓mRNA，方法方法如下：如下：众多未知的众多未知的RNA 电泳分离电泳分离 变性变性 影印影印 用标记的已用标记的已知知DNA单链杂交单链杂交 放射自显影放射自显影Western Blotting（西印迹）西印迹）：蛋白质与抗体的杂交，跟核酸无：蛋白质

24、与抗体的杂交，跟核酸无关。关。第40页，讲稿共49张，创作于星期二第41页，讲稿共49张，创作于星期二 SouthernSouthern DNADNA印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的离的离的离的DNADNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后片段转移并结合在适当的滤膜上，然后片段转移并结合在适当的滤膜上，然后片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同位素标记的单链通过同位素标记的单链通过同位素标记的单链通过同位素标记的单链DNADNA或或或或

25、 RNARNA探针的杂交作探针的杂交作探针的杂交作探针的杂交作用用用用检测这些被转移的检测这些被转移的检测这些被转移的检测这些被转移的DNADNA片段片段片段片段，这种实验方法叫，这种实验方法叫，这种实验方法叫，这种实验方法叫做做做做DNADNA印迹杂交技术印迹杂交技术印迹杂交技术印迹杂交技术。由于它是由。由于它是由。由于它是由。由于它是由E.SouthernE.Southern于于于于19751975年首先设计出来的，故又叫年首先设计出来的，故又叫年首先设计出来的，故又叫年首先设计出来的，故又叫Southern DNA Southern DNA 印印印印迹转移技术。迹转移技术。迹转移技术。迹

26、转移技术。第42页，讲稿共49张，创作于星期二Southern 凝胶转移凝胶转移杂交技术杂交技术（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交同探针同源杂交的基因的基因DNA片段片段X光底片光底片第43页，讲稿共49张，创作于星期二第44页，讲稿共49张，创作于星期二Southern BlottingDNAmigrationDNA Marker第45页，讲稿共49张，创作于星期二GelPaper towelsSalt solution第46页，讲稿共49张，创作于星期二第47页，讲稿共49张，创作于星期二第48页，讲稿共49张，创作于星期二感感谢谢大大家家观观看看第49页，讲稿共49张，创作于星期二