质粒DNA提取及浓检测.pptx

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1、基本技术基本技术核酸核酸 的分离纯化的分离纯化(Isolation and Purification of DNA and RNA)；电泳技术电泳技术(Gel Electrophoresis)；基基因因重重组组、亚亚克克隆隆及及表表达达（Gene Recombination,Subcloning and Expression)；PCR技术技术(Polymerase Chain Reaction)；分子杂交及互作分子杂交及互作(Molecular Hybridization and Interaction)；DNA测序技术测序技术(DNA Sequencing)；基因功能的研究技术基因功能的研究

2、技术(Gene Function)；基因的染色体定位（基因的染色体定位（Localization of Gene to Chromosomes）生物芯片技术（生物芯片技术（Bio-Chips or Bioarray).第1页/共42页 以完整、常用、重要为原则，经典与先进技术相结合，同时介绍相关知识，尽量让学生在有限的学时内掌握更多的分子生物学技术以及相关的知识。我们的分子生物学实验课程的设计从整体上可以说是一个完整的大实验，因为自始至终，各实验之间相互连贯，要求学生每一次实验既得到本次实验的结果，同时也为下一次更深入的实验做准备（提供实验材料）。课程基本情况：第2页/共42页次次 序序实实

3、验验 名名 称称周次周次学学 时时备注备注1课程基本情况简介课程基本情况简介/质粒质粒DNA提取提取36.02质质粒粒DNA酶酶切切鉴鉴定定及及琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳45.03聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)扩增扩增DNA56.04DNA回收纯化及重组体的构建回收纯化及重组体的构建66.55大大肠肠杆杆菌菌感感受受态态细细胞胞的的制制备备、重重组组DNA的转化及克隆筛选的转化及克隆筛选76.56重组克隆的鉴定重组克隆的鉴定87.07植物总植物总RNA的提取与电泳的提取与电泳95.08核酸转膜、探针标记核酸转膜、探针标记105.09核酸杂交核酸杂交124.510综合测验、实验讨论与总

4、结综合测验、实验讨论与总结134.0实验安排与实验报告实验安排与实验报告注：实验报告分为注：实验报告分为12、3、4(实验实验6的设计的设计)、45、6、7、89、10第3页/共42页第4页/共42页实验操作基本要求实验操作基本要求1.认真预习认真预习实验指导；实验指导；2.按照操作规程使用仪器设备按照操作规程使用仪器设备,注意个人以及注意个人以及公共设施安全；公共设施安全；3.节约节约实验试剂及材料；实验试剂及材料；4.实验完毕后，将实验器皿清洗干净，并清理实验完毕后，将实验器皿清洗干净，并清理实验台面；实验台面；5.按时、按质、按量完成按时、按质、按量完成实验工作，不迟到，实验工作，不迟到

5、，不早退；不早退；6.实事求是、认真而及时地写出实验报告。实事求是、认真而及时地写出实验报告。第5页/共42页评分考虑评分考虑1.平时实验课成绩平时实验课成绩 70%；2.综合技术测验综合技术测验 30%。第6页/共42页实验一实验一 质粒质粒DNA的提取及浓度检测的提取及浓度检测第7页/共42页1.目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。第8页/共42页2.相关知识及原理质粒(Plasmid)(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNADNA分子。存在于细

6、菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。第9页/共42页第10页/共42页第11页/共42页DNA超螺旋结构超螺旋结构第12页/共42页细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。第13页/共42页严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛

7、型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒类型：第14页/共42页载体(Vector)(Vector)：用于携带重组DNADNA，并且能够使外源DNADNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。第15页/共42页1.1.抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin gene,such as Ampicillin resistance gene,Kanamycine resistance gene,Kanamy

8、cine resistance gene)resistance gene)2.2.启始复制子（启始复制子（oriori,Origin of,Origin of replication)replication)；3.3.多克隆位点多克隆位点(MSC,Multiple cloning(MSC,Multiple cloning site or polylinker)site or polylinker)；4.4.标记基因标记基因(Marker gene,such as(Marker gene,such as LacZ gene)LacZ gene)。载体的结构：第16页/共42页InsertEcoR

9、IXhoI1.9kb第17页/共42页DNA DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNADNA的变性，如加热、极端pHpH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNADNA复性。原理：第18页/共42页SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDSSDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNADNA以及基因组DNADNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNADNA遇到强碱性（NaOHNaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNADNA将迅速复性，而基因组DNADNA，由于

10、分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNADNA将在上清中，而基因组DNADNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提取出来。第19页/共42页细菌裂解的方法：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。第20页/共42页测定DNADNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNADNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNADNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。DNADNA浓度的测定：第21页

11、/共42页紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C(G,A,T,C）在260nm260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm260nm的吸收峰即可对DNADNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pHpH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pHpH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。第22页/共42页3.材料与试剂材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5。pCMV-MycpCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N N端c-c-Myc Myc 尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。Suitable ho

12、st strains:DH5a,HB101,and other general purpose strains.Selectable marker:plasmid confers resistance to ampicillin(100 mg/ml)to E.coli hosts.E.coli replication origin:pUCCopy number:500 第23页/共42页InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T10第24页/共42页4.步骤A.质粒DNA的提取 碱裂解法碱裂解法第25页/共42页溶液1GET缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L E

13、DTA，25mMTris-HCl pH8.0。溶液20.2mol/L NaOH,1%SDS溶液3乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/L KAc,11.5ml冰醋酸，28.5mL H2OTE缓冲液或水（+20 g/ml RNase）:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,100%乙醇，70乙醇第26页/共42页注意：注意：用移液器操作时，每一步都要格用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液外小心，特别是在加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要剧烈振荡，以免后，一定不要剧烈振荡，以免切碎切碎DNA(DNA(包括质粒包括质粒

14、DNADNA和基因组和基因组DNA)DNA)！第27页/共42页1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时;2.取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100 l溶液1(GET)，充分混匀放置3-5分钟;3.加入200 l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;质粒小量提取的方法（手工提取）：第28页/共42页4.加入150 l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;5.用台式高速离心机，

15、10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;6.沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;7.加入30-50 l含有20 g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);8.将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。第29页/共42页BiodevBiodev（博大泰克）质粒快速提取试剂盒（plasmid rapid plasmid rapid iso

16、lation kitisolation kit）碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液中按1:3的比例加入无水乙醇。第30页/共42页操作步骤1.1.收集收集1.51.53ml3ml菌液沉淀于菌液沉淀于1.5ml1.5ml离心管中。离心管中。加入加入100100 l溶液溶液1 1，振荡至彻底悬浮。，振荡至彻底悬浮。为了获得高质量的质粒为了获得高质量的质粒DNADNA，培养细菌的时，培养细菌的时间不宜过长，一般为间不宜过长，一般为1212小时；小时；细菌沉淀中加入溶液细菌沉淀中加入溶液1 1后，一定要彻底悬浮，后，一定要彻底悬浮，否则抽提质粒否则

17、抽提质粒DNADNA的纯度及得率会大大降低的纯度及得率会大大降低2.2.加入加入150150 l溶液溶液2 2，立即轻柔颠倒离心管数，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管清亮。随后将离心管冰上冰上放置放置1 12 2分钟分钟（时间勿超）。（时间勿超）。第31页/共42页3.3.加入加入150150 l溶液溶液3 3，立即温和颠倒离心管数次，立即温和颠倒离心管数次，室温放置室温放置5 5分钟。分钟。12000rpm12000rpm离心离心1212分钟。分钟。要要获获得得更更好好得得质质粒粒提提取取效效果果，请请于于步步骤骤

18、2 2和和步步骤骤3 3后，冰上放置。后，冰上放置。4.4.将将420420 l结合缓冲液结合缓冲液加入加入离心柱离心柱中。然后将中。然后将步步骤骤3 3的上清的上清加入离心加入离心吸附柱中吸附柱中（尽量去除杂质），（尽量去除杂质），混匀。混匀。12000rpm12000rpm离心离心3030秒钟。倒掉废液收集管秒钟。倒掉废液收集管中得溶液。中得溶液。5.5.加入加入750750 l洗涤缓冲液洗涤缓冲液于离心吸附柱中，于离心吸附柱中，12000rpm12000rpm离心离心1 1分钟。分钟。第32页/共42页浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无水乙醇

19、，否则，吸附于硅基质材料上的水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNADNA可能可能被洗脱下来，影响回收效率。被洗脱下来，影响回收效率。6.6.A.A.重复步骤重复步骤5 5一次；一次；B.B.随后，再次于随后，再次于12000rpm12000rpm空空管离心管离心2 2分钟，尽量除去漂洗液。分钟，尽量除去漂洗液。洗涕时（即步骤洗涕时（即步骤5和和6）一定要尽量除去漂洗液，）一定要尽量除去漂洗液，否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促反应。必要时，可适当延长离心时间或者用反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip头吸净。头吸净。第33页/共42页如果含

20、有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗涤几次。涤几次。7.小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中。加入离心管中。加入50 l洗脱缓冲液洗脱缓冲液，室温，室温放置放置5分钟后，分钟后，12000rpm离心离心1分钟。分钟。洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中得得DNA都能被洗脱下来。为提高回收效率，都能被洗脱下来。为提高回收效率，可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。第

21、34页/共42页为了充分除尽为了充分除尽RNARNA的污染，可在提取的质粒中的污染，可在提取的质粒中加入加入0.50.5 l lRNaseARNaseA（10mg/ml10mg/ml）。这并不影响）。这并不影响其他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来其他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作为测序模板和其他酶促反应。作为测序模板和其他酶促反应。若提取的质粒大于若提取的质粒大于10Kb10Kb，在加入洗脱缓冲液后，在加入洗脱缓冲液后，可在可在7070水浴中放置水浴中放置3 35 5分钟，以确保质粒分钟，以确保质粒DNADNA的完全洗脱。的完全洗脱。第35页/共42页B.用分光光度计法定量DNA1

22、.取2 l提取的质粒DNA，加入98 l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);2.蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。第36页/共42页3.加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50 g/ml双链DNA，33 g/ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。第37页/共42页4.记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:ds

23、DNA=50(OD260)稀释倍数以上浓度单位为 g/ml第38页/共42页C.C.凝胶电泳检测DNADNA的浓度0.8%0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40100V,40分钟。NEB NEB 标准分子量片段(1kb DNA(1kb DNA Ladder)Ladder)第39页/共42页1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder虽然不能对DNADNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按0.5g0.5g上样量计。应按1313条带计算，因为3kb3kb的量是其它片段量的近三倍）：片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb 的条带由500bp和517bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。第40页/共42页5.实验报告实验报告1)目的与要求目的与要求2)实验原理实验原理3)材料与方法材料与方法4)结果与讨论结果与讨论第41页/共42页感谢您的观看！第42页/共42页