基因工程的工具酶 (2)精选PPT.ppt

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1、LOGO关于基因工程的工具酶(2)第1页，讲稿共41张，创作于星期日第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 一一一一.限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现HamiltonO.Smith19681968年，年，年，年，SmithSmith等人首先从流感嗜血杆菌等人首先从流感嗜血杆菌等人首先从流感嗜血杆菌等人首先从流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出株中分离出株中分离出HinHindIIdII和和和和HinHindIIIdIII 。19781978年获得诺年获得诺年获得诺年获得诺奖。奖。奖。奖。此前（此前（此前（此前（2020世纪世纪世纪世纪5050年

2、代），研究人员在噬菌体感染大年代），研究人员在噬菌体感染大年代），研究人员在噬菌体感染大年代），研究人员在噬菌体感染大肠杆菌试验中发现了肠杆菌试验中发现了肠杆菌试验中发现了肠杆菌试验中发现了寄主细胞的限制和修饰现象寄主细胞的限制和修饰现象寄主细胞的限制和修饰现象寄主细胞的限制和修饰现象（R/M体系）体系）。第2页，讲稿共41张，创作于星期日二二二二.寄主的限制和修饰现象寄主的限制和修饰现象寄主的限制和修饰现象寄主的限制和修饰现象第3页，讲稿共41张，创作于星期日vv 限制限制限制限制(Restriction)(Restriction)：指一定类型的细菌可以通过：指一定类型的细菌可以通过：指一定

3、类型的细菌可以通过：指一定类型的细菌可以通过限制性内限制性内限制性内限制性内切酶切酶切酶切酶的作用，破坏入侵的噬菌体的作用，破坏入侵的噬菌体的作用，破坏入侵的噬菌体的作用，破坏入侵的噬菌体DNADNA，导致噬菌体的寄主，导致噬菌体的寄主，导致噬菌体的寄主，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。幅度受到限制。幅度受到限制。幅度受到限制。v 限制限制限制限制作用作用作用作用:实际就是限制性内切酶降解外源实际就是限制性内切酶降解外源实际就是限制性内切酶降解外源实际就是限制性内切酶降解外源DNADNA，维护宿主，维护宿主，维护宿主，维护宿主遗传稳定的保护机制。遗传稳定的保护机制。遗传稳定的保护机制。遗传稳定的

4、保护机制。第4页，讲稿共41张，创作于星期日vv修饰修饰修饰修饰(modification)(modification)：指寄主本身的：指寄主本身的：指寄主本身的：指寄主本身的DNADNA，由于在合成后通，由于在合成后通，由于在合成后通，由于在合成后通过过过过甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶的作用得以甲基化，使的作用得以甲基化，使的作用得以甲基化，使的作用得以甲基化，使DNADNA得以修饰得以修饰得以修饰得以修饰,从而免从而免从而免从而免遭自身限制性酶的破坏。遭自身限制性酶的破坏。遭自身限制性酶的破坏。遭自身限制性酶的破坏。v修饰修饰修饰修饰作用作用作用作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身

5、遗传宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。物质和外来遗传物质的目的。物质和外来遗传物质的目的。物质和外来遗传物质的目的。第5页，讲稿共41张，创作于星期日1 1）菌株中有三个菌株中有三个菌株中有三个菌株中有三个连锁连锁连锁连锁的基因位点：的基因位点：的基因位点：的基因位点：hsdRhsdR、hsdMhsdM、hsdShsdS。2 2）hsdhsdR R编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶-识别识别识别识别DNADNA分子特定位点，将双链分子特定位点，

6、将双链分子特定位点，将双链分子特定位点，将双链DNADNA切断。切断。切断。切断。（DNADNA分子转化细胞：受体细胞去掉分子转化细胞：受体细胞去掉分子转化细胞：受体细胞去掉分子转化细胞：受体细胞去掉hsdRhsdR基因位点）基因位点）基因位点）基因位点）3 3）hsdhsdMM编码产物是编码产物是编码产物是编码产物是DNADNA甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶-催化催化催化催化DNADNA分子特定位点的碱基分子特定位点的碱基分子特定位点的碱基分子特定位点的碱基甲基化反应。甲基化反应。甲基化反应。甲基化反应。4 4）hsdhsdS S表达产物的功能是表达产物的功能是表达产物的功能是表达产物的功

7、能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。特殊的作用位点。特殊的作用位点。特殊的作用位点。三三三三.限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制第6页，讲稿共41张，创作于星期日第7页，讲稿共41张，创作于星期日四四四四.限制性核酸内切酶的概念和命名限制性核酸内切酶的概念和命名限制性核酸内切酶的概念和命名限制性核酸内切酶的概念和命名 概念：概念：概念：概念：一类能够一类能够一类能够一类能够识别识别识别识别双链双链双链双链

8、DNADNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由分子中的某种特定核苷酸序列，并由分子中的某种特定核苷酸序列，并由分子中的某种特定核苷酸序列，并由此此此此切割切割切割切割DNADNA双链结构的核酸水解酶。双链结构的核酸水解酶。双链结构的核酸水解酶。双链结构的核酸水解酶。命名：命名：命名：命名：19731973年年年年H.O.SmithH.O.Smith和和和和D.NathamsD.Nathams首次提出了命名原则，首次提出了命名原则，首次提出了命名原则，首次提出了命名原则，19801980年年年年RobertsRoberts在此基础上进行了在此基础上进行了在此基础上进行了在此基础上进行了系统分类系统

9、分类系统分类系统分类：用具有某种限制性酶有机体的用具有某种限制性酶有机体的用具有某种限制性酶有机体的用具有某种限制性酶有机体的属名第一个字母属名第一个字母属名第一个字母属名第一个字母(大写大写大写大写)和和和和种名的种名的种名的种名的前两字前两字母母(小写小写)组成组成3个字母个字母的略语作为该酶的基本名称。的略语作为该酶的基本名称。如果酶是存在于特殊的菌株中，还应在第如果酶是存在于特殊的菌株中，还应在第3个字母后面标注菌株名称的符号个字母后面标注菌株名称的符号株或型株或型(strain)。如果一种特殊的菌株具有几个不同的限制与修饰体系，则以如果一种特殊的菌株具有几个不同的限制与修饰体系，则以

10、罗马数字罗马数字表示该表示该菌株中发现某种酶的菌株中发现某种酶的先后次序先后次序。第8页，讲稿共41张，创作于星期日Hind III属名属名属名属名种名种名种名种名株名株名株名株名发现顺序发现顺序发现顺序发现顺序HHinind dIIIIII嗜血流感杆菌（嗜血流感杆菌（嗜血流感杆菌（嗜血流感杆菌（HHaemophilusaemophilusininfluenzaefluenzae）dd株株株株所发现的所发现的所发现的所发现的第三个第三个第三个第三个限制性内切酶。限制性内切酶。限制性内切酶。限制性内切酶。EcoR来自来自来自来自于于于于EscherichiacoliEscherichiacoli

11、RY13RY13的第一个限制酶。的第一个限制酶。的第一个限制酶。的第一个限制酶。举例举例举例举例+读法读法读法读法第9页，讲稿共41张，创作于星期日五五五五.限制性内切酶的种类限制性内切酶的种类限制性内切酶的种类限制性内切酶的种类识别序列识别序列切割序列切割序列限制酶的作用模型限制酶的作用模型限制酶的作用模型限制酶的作用模型vv识别序列识别序列识别序列识别序列：是一段特殊的：是一段特殊的：是一段特殊的：是一段特殊的DNADNA序列，该序列与其对应的限制性内序列，该序列与其对应的限制性内序列，该序列与其对应的限制性内序列，该序列与其对应的限制性内切酶结合，是该酶切割切酶结合，是该酶切割切酶结合，

12、是该酶切割切酶结合，是该酶切割DNADNA的前提。的前提。的前提。的前提。vv切割序列切割序列切割序列切割序列：识别完成后，限制性内切酶实施切割作用所在的：识别完成后，限制性内切酶实施切割作用所在的：识别完成后，限制性内切酶实施切割作用所在的：识别完成后，限制性内切酶实施切割作用所在的DNADNA序列。序列。序列。序列。第10页，讲稿共41张，创作于星期日型酶型酶:19681968年年年年，M.M.MeselsonMeselson和和和和R.R.YuanYuan在在在在E.E.colicoliB B和和和和E.E.colicoliKK中中中中分分分分离离离离出出出出的的的的核核核核酸酸酸酸内内

13、内内切酶。切酶。切酶。切酶。特特特特征征征征：分分分分子子子子量量量量较较较较大大大大，反反反反应应应应需需需需MgMg2+2+、S-S-腺腺腺腺苷苷苷苷甲甲甲甲硫硫硫硫氨氨氨氨酸酸酸酸（SAMSAM）、ATPATP等等等等。这这这这类类类类酶酶酶酶有有有有特特特特异异异异的的的的识识识识别别别别位位位位点点点点但但但但没没没没有有有有特特特特异异异异的的的的切切切切割割割割位位位位点点点点，而而而而且且且且切切切切割割割割是是是是随随随随机机机机的的的的，所所所所以以以以在在在在基基基基因工程中应用不大。因工程中应用不大。因工程中应用不大。因工程中应用不大。由于切割的随机性，由于切割的随机性

14、，由于切割的随机性，由于切割的随机性，不能得到目的片段。不能得到目的片段。不能得到目的片段。不能得到目的片段。第11页，讲稿共41张，创作于星期日型酶型酶:这这这这类类类类酶酶酶酶可可可可识识识识别别别别特特特特定定定定碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列，并并并并在在在在这这这这识识识识别别别别位位位位点点点点下下下下游游游游的的的的33端端端端24262426bpbp处处处处切切切切开开开开DNADNA，所以它的切割位点也是，所以它的切割位点也是，所以它的切割位点也是，所以它的切割位点也是没有特异性的没有特异性的没有特异性的没有特异性的。型酶（重点）型酶（重点）19701970年，年，年，年，

15、SmithSmith和和和和WilcoxWilcox在流感嗜血在流感嗜血在流感嗜血在流感嗜血d d株中分离出来的限制酶。株中分离出来的限制酶。株中分离出来的限制酶。株中分离出来的限制酶。分子量通常较小，只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。反应只需分子量通常较小，只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。反应只需分子量通常较小，只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。反应只需分子量通常较小，只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg2+Mg2+的存在。的存在。的存在。的存在。特点：特点：特点：特点：（1 1）识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。）识别位点是一个回文

16、对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。）识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。）识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。（2 2）许多）许多）许多）许多型酶切割型酶切割型酶切割型酶切割DNADNA后，可在后，可在后，可在后，可在DNADNA上形成粘性末端，有利于上形成粘性末端，有利于上形成粘性末端，有利于上形成粘性末端，有利于DNADNA片段的片段的片段的片段的重组。重组。重组。重组。第12页，讲稿共41张，创作于星期日型酶型酶:这这这这类类类类酶酶酶酶可可可可识识识识别别别别特特特特定定定定碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列，并并并并在

17、在在在这这这这识识识识别别别别位位位位点点点点下下下下游游游游的的的的33端端端端24262426bpbp处切开处切开处切开处切开DNADNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。，所以它的切割位点也是没有特异性的。，所以它的切割位点也是没有特异性的。，所以它的切割位点也是没有特异性的。型酶（下节重点）型酶（下节重点）第13页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征qq绝绝绝绝大大大大多多多多数数数数IIII型型型型限限限限制制制制性性性性内内内内切切切切酶酶酶酶都都都都能能能能识识识识别别别别由由由由4-64-6个个个个核核

18、核核苷苷苷苷酸酸酸酸组组组组成成成成的的的的特特特特定定定定序序序序列列列列。6.1每一种酶都有各自的特异识别序列每一种酶都有各自的特异识别序列q限限制制性性内内切切酶酶是是在在DNA分分子子双双链链的的识识别别序序列列内内切切割割DNA分分子子，因此识别序列又称为该限制性内切酶靶序列。因此识别序列又称为该限制性内切酶靶序列。EcoRI:GAATTCBamHI:GGATCCPstI:CTGCAGSmaI:GGGCCC第14页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征q限限制制性性内内切切酶酶II的的识识别别序序列列具具有有双双

19、重重（180度度）旋旋转转的的对对称称结结构构，也也就就是说识别序列的核苷酸对是呈是说识别序列的核苷酸对是呈回文结构回文结构。AGCGCTTCGCGAACNGTTGNCA第15页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征习题：下列序列中哪些可能是习题：下列序列中哪些可能是习题：下列序列中哪些可能是习题：下列序列中哪些可能是IIII类限制酶的识别序列？类限制酶的识别序列？类限制酶的识别序列？类限制酶的识别序列？vv A A：ATATCG ATATCG vv B B：CCCGGGCCCGGGv C C：GATATCGATATCvv

20、 D D：AGCCGAAGCCGA2 2个方法：对折个方法：对折个方法：对折个方法：对折 oror写出互补链写出互补链写出互补链写出互补链第16页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征6.2限制酶的切割方式限制酶的切割方式uu平末端的平末端的平末端的平末端的DNADNA片段片段片段片段uu55端具有粘性末端的端具有粘性末端的端具有粘性末端的端具有粘性末端的DNADNA片段片段片段片段uu33端具有粘性末端的端具有粘性末端的端具有粘性末端的端具有粘性末端的DNADNA片段片段片段片段切切切切割割割割位位位位点点点点位位位位于

21、于于于识识识识别别别别序序序序列列列列的的的的对对对对称称称称轴轴轴轴上上上上，这这这这样样样样形形形形式式式式的的的的断断断断裂裂裂裂是是是是形形形形成成成成具具具具有有有有平平平平末末末末端端端端的的的的DNADNADNADNA片片片片断断断断，不易重新环化。不易重新环化。不易重新环化。不易重新环化。切切切切割割割割位位位位点点点点位位位位于于于于对对对对称称称称轴轴轴轴的的的的两两两两侧侧侧侧，产产产产生生生生突突突突出出出出末末末末端端端端，在在在在适适适适当当当当温温温温度度度度下下下下，产产产产生生生生的的的的末末末末端端端端可可可可以以以以退退退退火火火火互互互互补，重新连接。补

22、，重新连接。补，重新连接。补，重新连接。C C C G G GG G G C C C55C C CG G GG G GC C C55Sma I第17页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征6.2限制酶的切割方式限制酶的切割方式第18页，讲稿共41张，创作于星期日识别序列识别序列切割位点切割位点粘性末端粘性末端第19页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特点限制酶的切割特点识别序列不同，切割方式也不同。识别序列不同，切割方式也不同。1

23、.EcoR I酶切产生的酶切产生的55粘性末端粘性末端;2.Pst I酶切产生的酶切产生的33粘性末端；粘性末端；3.Pvu ll酶切产生的酶切产生的平头平头平头平头末端；末端；第20页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特点限制酶的切割特点识别序列不同，切割方式也不同识别序列不同，切割方式也不同第21页，讲稿共41张，创作于星期日第22页，讲稿共41张，创作于星期日第23页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特

24、点限制酶的切割特点识别序列不同，产生相同的粘性末端识别序列不同，产生相同的粘性末端同尾酶同尾酶。一些限制性内切酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但一些限制性内切酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称之为同尾酶。都产生出相同的粘性末端，称之为同尾酶。由一对同尾酶分别产生出的粘性末端共价结合形成的位点，称之为由一对同尾酶分别产生出的粘性末端共价结合形成的位点，称之为杂种杂种位点位点(hybridsite)。实例（百度文库实例（百度文库自学）：自学）：1.利用三引物利用三引物PCR和同尾酶连接的策略实现多基因片段的重组。和同尾酶连接的策略实现多基因片段

25、的重组。2.同尾酶技术在构建疟疾多价重组同尾酶技术在构建疟疾多价重组DNA疫苗中的应用。疫苗中的应用。第24页，讲稿共41张，创作于星期日 杂种位点（杂种位点（杂种位点（杂种位点（hybridsitehybridsite）：由一对同尾酶分别产生的粘）：由一对同尾酶分别产生的粘）：由一对同尾酶分别产生的粘）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。性末端共价结合形成的位点。性末端共价结合形成的位点。性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。Bam Bam HH G GATC CG GATC C BclBcl T GATC AT G

26、ATC A C CTAG GC CTAG G A CTAG TA CTAG T 杂种位点杂种位点 T T GATC CGATC C A A CTAGCTAG G G SauSau3A3A第25页，讲稿共41张，创作于星期日第26页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特点限制酶的切割特点识别简并序列识别简并序列 简并序列是指序列中有的核苷酸位点可以是不同的核苷酸。简并序列是指序列中有的核苷酸位点可以是不同的核苷酸。简并序列是指序列中有的核苷酸位点可以是不同的核苷酸。简并序列是指序列中有的核苷酸位点可以是不

27、同的核苷酸。例如：例如：例如：例如：GTGTYRYRACY=CACY=C或或或或TR=GTR=G或或或或AAHinHind d实际上可以识别实际上可以识别实际上可以识别实际上可以识别4 4个个个个特定序列。特定序列。特定序列。特定序列。第27页，讲稿共41张，创作于星期日六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征6.3限制酶的切割特点限制酶的切割特点 识别序列相同，切割位点不同识别序列相同，切割位点不同同位酶。同位酶。一些限制性内切酶，具有相同的识别位点，但切割部位不同，这一些限制性内切酶，具有相同的识别位点，但切割部位不同，这一些限制性内切酶，具有相同

28、的识别位点，但切割部位不同，这一些限制性内切酶，具有相同的识别位点，但切割部位不同，这类酶称为类酶称为类酶称为类酶称为同位酶同位酶同位酶同位酶。SmaSma CCCGGGCCCGGGCCCGGGCCCGGGXmaXma 双酶切双酶切双酶切双酶切&酶的价格酶的价格酶的价格酶的价格第28页，讲稿共41张，创作于星期日一些来源不同的限制性内切酶，具有相同的识别位点和切割位点，这一些来源不同的限制性内切酶，具有相同的识别位点和切割位点，这一些来源不同的限制性内切酶，具有相同的识别位点和切割位点，这一些来源不同的限制性内切酶，具有相同的识别位点和切割位点，这类酶称为类酶称为类酶称为类酶称为同裂酶同裂酶同

29、裂酶同裂酶。如：如：如：如：HpaHpaII/II/MspMspI I。CCGGHpaHpaIIII不能切割不能切割不能切割不能切割MspMspII能够切割能够切割能够切割能够切割C*CGGC*CGG表示甲基化6.3限制酶的切割特点限制酶的切割特点六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征第29页，讲稿共41张，创作于星期日型限制性内切酶不具甲基化功能。型限制性内切酶不具甲基化功能。型限制性内切酶不具甲基化功能。型限制性内切酶不具甲基化功能。vv、型限制性内切酶本身具有甲基化酶的功能。型限制性内切酶本身具有甲基化酶的功能。型限制性内切酶本身具有甲基化酶的

30、功能。型限制性内切酶本身具有甲基化酶的功能。vv型限制性内切酶甲基化：由相应的甲基化酶承担。型限制性内切酶甲基化：由相应的甲基化酶承担。型限制性内切酶甲基化：由相应的甲基化酶承担。型限制性内切酶甲基化：由相应的甲基化酶承担。6.3限制酶的切割特点限制酶的切割特点GAATTCCTTAAGEcoEcoRR甲基化酶甲基化酶甲基化酶甲基化酶AAEcoEcoRR六六六六.型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征型限制酶的基本特征第30页，讲稿共41张，创作于星期日七七七七.型限制酶的主要用途型限制酶的主要用途型限制酶的主要用途型限制酶的主要用途在特异位点上切割在特异位点上切割在特异位点上切

31、割在特异位点上切割DNADNA，产生特异的限制酶片段。，产生特异的限制酶片段。，产生特异的限制酶片段。，产生特异的限制酶片段。建立建立建立建立DNADNA分子的限制酶图谱。分子的限制酶图谱。分子的限制酶图谱。分子的限制酶图谱。构建基因文库。构建基因文库。构建基因文库。构建基因文库。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。改建质粒。改建质粒。改建质粒。改建质粒。第31页，讲稿共41张，创作于星期日八八八八.酶酶酶酶切反应的操作切反应的操作切反应的操作切反应的操作大部分大部分大部分大部分

32、IIII型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0-100mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100L Temperature37Time1-1.5h1 1个单位个单位个单位个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20L20L反反反反应液中反应应液

33、中反应应液中反应应液中反应1h1h，使，使，使，使1g1g标准标准标准标准DNADNA完全消化所需的酶量。完全消化所需的酶量。完全消化所需的酶量。完全消化所需的酶量。bufferbufferHMKLHMKL？第32页，讲稿共41张，创作于星期日电泳电泳电泳电泳紫外分析紫外分析紫外分析紫外分析37371h1h加反应液加反应液加反应液加反应液CKCKMMBuffer(10X)2.0Buffer(10X)2.0 LL（总体积决定）（总体积决定）（总体积决定）（总体积决定）Water16.5Water16.5 LL（可变）（可变）（可变）（可变）DNA1.0DNA1.0 Lor1.0Lor1.0 g

34、g（可变）（可变）（可变）（可变）Enzyme0.5-1.0Enzyme0.5-1.0 L LVolume20.0Volume20.0 LL1.0kb1.0kb1.0kb1.0kb0.4kb0.4kb0.5kb0.5kb0.6kb0.6kbCKCKMMT TT T八八八八.酶酶酶酶切反应的操作切反应的操作切反应的操作切反应的操作第33页，讲稿共41张，创作于星期日v对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。vv对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下

35、列方法：v使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。vv低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切。低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切。低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切。低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切。vv一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。v0.1倍体积的倍体积的5MNaAcpH5.4；v2.5倍体积的冰冷乙醇；倍体积的冰冷乙醇；v冰浴冰浴5分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥；分钟、干燥；九

36、九九九.联合酶解（双酶切）联合酶解（双酶切）联合酶解（双酶切）联合酶解（双酶切）第34页，讲稿共41张，创作于星期日十十十十.影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的纯度样品的纯度样品的纯度样品的纯度DNADNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、SDSSDS、EDTAEDTA、NaClNaCl等等等等,都有可能抑制酶活性。都有可能抑制酶活性。都有可能抑制酶活性。都有可能抑制酶活性。可采用以下方法，

37、提高酶活性：可采用以下方法，提高酶活性：可采用以下方法，提高酶活性：可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，加大酶的用量，加大酶的用量，加大酶的用量，1 1 gDNAgDNA用用用用10U10U酶酶酶酶加大反应总体积加大反应总体积加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间延长反应时间延长反应时间第35页，讲稿共41张，创作于星期日十十十十.影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNADNA样品的甲基化程度样品的甲基化程度样品的甲基化程度样品的甲基化程度vv大肠杆菌中的大肠杆菌中的大肠杆菌中的大肠杆菌

38、中的dcmdcm甲基化酶在甲基化酶在甲基化酶在甲基化酶在5 5 CCAGG3CCAGG3 或或或或5 5 CCTGG3CCTGG3 序序序序列中的胞嘧啶列中的胞嘧啶列中的胞嘧啶列中的胞嘧啶C5C5位上引入甲基，受其影响的酶有位上引入甲基，受其影响的酶有位上引入甲基，受其影响的酶有位上引入甲基，受其影响的酶有EcoEcoRIIRII等，等，等，等，但但但但BglBglI I、KpnKpnI I不受影响。不受影响。不受影响。不受影响。vv采用去甲基化酶的采用去甲基化酶的采用去甲基化酶的采用去甲基化酶的E.coliE.coli菌株来制备质粒菌株来制备质粒菌株来制备质粒菌株来制备质粒DNADNA，可防

39、止，可防止，可防止，可防止DNADNA的的的的甲基化。甲基化。甲基化。甲基化。第36页，讲稿共41张，创作于星期日十十十十.影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素 酶切反应的温度酶切反应的温度酶切反应的温度酶切反应的温度vv 多数标准反应温度是多数标准反应温度是多数标准反应温度是多数标准反应温度是3737，如，如，如，如SmaSmaI I为为为为2525或或或或3030，SfiSfiI I为为为为5050。vv 反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。反

40、应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。DNADNA分子结构分子结构分子结构分子结构某些酶切割超螺旋质粒某些酶切割超螺旋质粒某些酶切割超螺旋质粒某些酶切割超螺旋质粒DNADNA时，酶量比切割线性时，酶量比切割线性时，酶量比切割线性时，酶量比切割线性DNADNA时高出时高出时高出时高出许多倍，最高可达许多倍，最高可达许多倍，最高可达许多倍，最高可达2020倍。倍。倍。倍。第37页，讲稿共41张，创作于星期日十一十一十一十一.限制性内切酶的限制性内切酶的限制性内切酶的限制性内切酶的星活性星活性星活性星活性vv高浓度的酶高浓度的酶高浓度的酶高

41、浓度的酶、高浓度的甘油高浓度的甘油高浓度的甘油高浓度的甘油、低离子强度低离子强度低离子强度低离子强度、极端极端极端极端pHpH值值值值等条件下，等条件下，等条件下，等条件下，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性变化即所谓会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性变化即所谓会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性变化即所谓会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性变化即所谓的的的的StaractivityStaractivity现象。现象。现象。现象。vv例如：例如：例如：例如：EcoEcoRIRI在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割在正常条

42、件下识别并切割5 5GAATTC3GAATTC3 序列，但在甘油浓度超过序列，但在甘油浓度超过序列，但在甘油浓度超过序列，但在甘油浓度超过5%5%（v/vv/v）时，也可时，也可时，也可时，也可切割切割切割切割5 5 PuPuATPyPyPuPuATPyPy33或者或者或者或者5 5 AATTAATT33第38页，讲稿共41张，创作于星期日十一十一十一十一.限制性内切酶的限制性内切酶的限制性内切酶的限制性内切酶的星活性星活性星活性星活性星活性产生的原因如下：星活性产生的原因如下：星活性产生的原因如下：星活性产生的原因如下：反应体系中甘油的浓度大于反应体系中甘油的浓度大于反应体系中甘油的浓度大于

43、反应体系中甘油的浓度大于5%5%。酶用量过大，大于酶用量过大，大于酶用量过大，大于酶用量过大，大于100U/100U/gDNAgDNA 低离子强度，小于低离子强度，小于低离子强度，小于低离子强度，小于25mmol/L25mmol/L 高高高高pHpH，大于，大于，大于，大于8.08.0 含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。含有机剂如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。MnMn2+2+、CuCu2+2+、CoCo2+2+、ZnZn2+2+等非等非等非等非MgMg2+2+的二价离子的存在。的二价离子的存在

44、。的二价离子的存在。的二价离子的存在。常发生星活性的内切酶有：常发生星活性的内切酶有：常发生星活性的内切酶有：常发生星活性的内切酶有：EcoEcoRIRI、HinHindd、KpnKpnI I、PstPstI I、SalSalI I、HinHinfIfI等。等。等。等。第39页，讲稿共41张，创作于星期日注意事项注意事项商品化的限制酶均为浓缩液，商品化的限制酶均为浓缩液，商品化的限制酶均为浓缩液，商品化的限制酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头取酶，加入酶每次操作时应使用新的吸头取酶，加入酶每次操作时应使用新的吸头取酶，加入酶每次操作时应使用新的吸头取酶，加入酶的体积应不超过总体积的的体积应

45、不超过总体积的的体积应不超过总体积的的体积应不超过总体积的10%10%，否则酶液中的甘油浓度超过，否则酶液中的甘油浓度超过，否则酶液中的甘油浓度超过，否则酶液中的甘油浓度超过5%5%时将会抑制酶时将会抑制酶时将会抑制酶时将会抑制酶的活性。的活性。的活性。的活性。整个操作应在整个操作应在整个操作应在整个操作应在0 0进行，进行，进行，进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。最后加入酶。最后加入酶。最后加入酶。当切割大量当切割大量当切割大量当切割大量DN

46、ADNA时，时，时，时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。通常采用延长反应时间，减少酶的用量。通常采用延长反应时间，减少酶的用量。通常采用延长反应时间，减少酶的用量。当当当当DNADNA需需需需2 2种或以上酶切时，应用通用缓冲液。种或以上酶切时，应用通用缓冲液。种或以上酶切时，应用通用缓冲液。种或以上酶切时，应用通用缓冲液。若没有通用缓冲液若没有通用缓冲液若没有通用缓冲液若没有通用缓冲液时，只有用时，只有用时，只有用时，只有用1 1种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。种酶切完后，纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。第40页，讲稿共41张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第41页，讲稿共41张，创作于星期日