浙江大学刘振伟教授高级培训班膜片钳技术数据处理与分析.pptx

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1、一、一、膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理二、二、全细胞记录数据的分析全细胞记录数据的分析三、三、单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析四、四、突触放电活动数据的分析突触放电活动数据的分析1PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014内容内容第1页/共139页2PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理一、基线的调零一、基线的调零二、坏点的去除二、坏点的去除三、滤波三、滤波四、数据文件内部四、数据文件内部/之间的数学运算之间的数学运算第2页/共139页3Patchclamptraini

2、ngclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理一、基线的调零一、基线的调零l 基线的确认基线的确认 全细胞记录基线易确认，单通道记录基线不易确认。单通道开放时间较长所记录的时间较短同时开放的通道数目较多且长时间持续开放确定通道电流的方向：电流方向向上，最负向是基线位置，反之亦然。如何确定：膜片两侧液体、钳制电位单通道电流基线的确认单通道电流基线的确认如果通道开放时电流向上，则基线在最下面的位置基线通道开放第3页/共139页4PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第4页/共139页5P

3、atchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l 基线基线不在零点不在零点的的原因原因 封接电阻的改变：漏电流失调电位的存在：偏移、漂移噪声的干扰：交流干扰高通滤波的影响：对记录线的起始部位产生影响第5页/共139页6PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l 基线基线调零方法调零方法打开Analyze/Adjust/Baseline（1）Subtractmeanof（去除均值法）：适用于去除直流偏移。（2）Subtractslopeof（去除斜率法）：适

4、合于去除持续线性漂移。（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）：适用于去除直流偏移。数值有正负之分。（4）Adjustmanually（手工调零法）：适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律。第6页/共139页7PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理坐标零点坐标零点Epoch A段（1）Subtractmeanof（去除均值法）（2）Subtractslopeof（去除斜率法）第7页/共139页8PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据

5、的处理（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）（4）Adjustmanually（手工调零法）第8页/共139页9PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l 基线调零的注意事项基线调零的注意事项（1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零。但多数情况需要基线调零，建议都要进行基线调零。（2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能会用到上述的几种方法。（3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。建议最好在采集数据时就设法调整好基线。第9页/共139页10Patc

6、hclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示基线调零方法演示基线调零方法第10页/共139页11PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014二二、坏点的去除坏点的去除l 坏点产生的原因坏点产生的原因 刺激伪迹：给标本施加刺激时产生。电容瞬变电流：电容的充放电反应。瞬时脉冲干扰（Glitch）：打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时）手机来电：一过性高频。人手靠近记录探头：高幅、高频。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第11页/共139页12Patchclamptraining

7、classApr.23-25,2014l 坏点的赋值坏点的赋值 （1）Datavalueatcursor1：Cursor1的数值。（2）Meanbetweencursor1.2：Cursor1-2之间均值。（3）Meanbetweencursor3.4：Cursor3-4之间均值。（4）Straight-linefitbetweencursor1.2：Cursor1-2之间的直线拟合值。（5）Fixedvalue(pA/mV)：输入一个固定的数值。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第12页/共139页13PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验

8、数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示去除坏点演示去除坏点第13页/共139页14PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 注意事项注意事项 （1）坏点太多时，应在记录前予以去除。（2）坏点持续时间短，如果出现持续时间较长的坏点，则数据要废弃。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第14页/共139页15PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014三三、滤波滤波l 信号采集前的滤波信号采集前的滤波 全细胞通道电流记录：1-2kHz全细胞突触活动记录：10kHz单通道电流记录：10kHz动作电位记录：10kHz膜

9、片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第15页/共139页16PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 信号采集后的滤波信号采集后的滤波 膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第16页/共139页17PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014 Lowpass Highpass Bandpass Notch Electrical Interference l Clampfit滤波类型滤波类型 膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第17页/共139页18PatchclamptrainingclassApr.23-25,201

10、4l Lowpass 最为常用。Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示在该框底部。7种类型：（1）8-poleBessel：数据失真小，普遍用于时域数据。（2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前后一些数据点（取决于Smoothingpoints，取3-99中的奇数）的平均值赋予当前数据点，完成滤波。Smoothingpoints值越大，数据幅度削减越大。（3）Gaussian：数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均值中所占的比例较大。（4）RC(8-coincident-pole)：用于时域数据。（5）RC(single-po

11、le)：用于时域数据。（6）8-poleButterworth：用于频域数据。（7）8-poleChebyshev：用于频域数据。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第18页/共139页19PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Lowpass滤波滤波第19页/共139页20PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l Highpass又称交流耦合（ACCoupling），可削弱低频信号而通过高频信号。Clampfit提供两种：8-poleBessel，单极

12、RC采用-f-3dB，Clampfit自动计算出f-3dB范围并显示在该框底部。最常见的是在神经元上进行细胞内记录时使用高通滤波器，它可降低膜电位的低频振荡对突触电流的干扰。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第20页/共139页21PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Highpass滤滤波波第21页/共139页22PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l Bandpass相当于低通滤波与高通滤波的交叉，需要同时设定高通滤波与低通滤波。高通滤波的f-

13、3dB不能高于低通滤波的f-3dB。带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时，对其它频率的噪声进行滤波。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第22页/共139页23PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l Notch带阻滤波：削弱某一特定频率（如50Hz交流）信号。中心频率（Centerfrequency）：10-3,000Hz。频率宽度（3dBwidth）：频率宽度。-3dBwidth越窄，滤波需要的数据点越多，滤波效果越好。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第23页/共139页24PatchclamptrainingclassApr.23-

14、25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Notch滤波滤波第24页/共139页25PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l Electrical Interference（EI）电干扰滤波器（Electricalinterferencefilter,EI）为数码滤波器。可同时去除50Hz及其谐波（100Hz、150Hz等）的复杂交流噪声。Harmonicsfrom1to：用于设定欲去除的交流谐波的最高数目，最大数目为20（对应于1kHz），一般去除第1-3个就够了。Cyclestoaverage：数目越大，-3dB频

15、率宽度越窄，滤波效果越好，但需时越长。Referencefrequency：选50Hz。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第25页/共139页26PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014EI所需最少数据点的计算举例所需最少数据点的计算举例滤波器所需最少数据点（采样频率/50Hz）Cyclestoaverage若采样频率10kHz，则一个50Hz正弦波周期的采样点数10kHz/50200点若设定Cyclestoaverage10，则需要的最少采样点数2,000点采样数据点不够的话，将不能清除谐波干扰。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第26页/共13

16、9页27PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014四四、数据文件内部、数据文件内部/之间的数学运算之间的数学运算l Analyze/Average Traces平均文件内任意几条相同的Trace，获得平均后的一条Trace。要求：Clampex软件的Fixed-lengthevents、Episodicstimulation和High-speedoscilloscope模式。重复记录的信号，时程必须固定不变。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第27页/共139页28PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014 降低信号噪声降低

17、信号噪声信号频率谱与噪声频率谱一致或有重叠时，滤波不行。平均Trace的原理：设有N条Trace，则（见表）：先累加所有N条Trace，此时信号幅度增大为原来的N倍，而噪声却只增大为原来的N倍。然后再除以Trace条数N，信号幅度不发生大的变化，而噪声幅度却降低为原来的1/N。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第28页/共139页29PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Average Traces功能功能第29页/共139页30PatchclamptrainingclassApr.2

18、3-25,2014l Analyze/Segmented Average可对几个Trace中的某一相同时段（如EpochA）或Cursor1-2之间的时间段进行平均，平均后的文件通常用于Analyze/SubtractControl功能中的ControlFile。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第30页/共139页31PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l Analyze/Arithmetic对文件内的任何Trace进行加减乘除等运算，使原来的Trace得到新值。如t3=t1+t2，t3=2t1+3t2Results窗口中的该功能可对不同Colum

19、n的数据进行运算，得到新的Column的数值。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第31页/共139页32PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l Analyze/Average Files对几个文件进行平均。例如在进行相同的实验时，需要将几个采样文件相应的每一个Trace进行平均。平均后的文件会自动生成，文件名为Average000-999.abf。仅适用于EpisodicStimulation、High-speedoscilloscope模式的数据；Protocol设置必须一致。同样具有降低噪声的作用。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第32页

20、/共139页33PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Average Files功功能能第33页/共139页34PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l Analyze/Subtract Control两个文件中所有相应的Trace进行相减，可用于去除漏电流或分离某种通道电流。要求两个文件要采用相同的Protocol来采集（信号数目、Sweep数目与长短、信号单位、采样频率）。Testfile为“大”文件“被减数”，ControlFile为“小”文件“减数

21、”。Multiplycontroltracesby:将ControlFile中的Trace乘以该倍数，然后再从Testfile中减除。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第34页/共139页35PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Subtract Control功能功能第35页/共139页36PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 注：注：如需要，可用Analyze/DataReduction或Interpolation功能使采样频率变为一致。若T

22、estfile中的Signal或Sweep数少于Controlfile，后者多余的Signal或Sweep将不被使用。反之，若Testfile中的Signal或Sweep数大于Controlfile，后者最后一个Signal或Sweep将被反复使用。若Testfile中的Sweep长度小于Controlfile，后者Sweep中多余的点将不被使用。反之，若Testfile中的Sweep长度大于Controlfile，后者Sweep中最后一个点将被反复使用。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理以Testfile为准第36页/共139页37PatchclamptrainingclassApr.

23、23-25,2014l Analyze/Concatenate Files将在同一条件下获得的数据文件并成一个文件。同一条件是指相同的采集模式/采样频率/采样时间/信号个数连接后的文件会自动生成:Concatenate000-999.abf。膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理第37页/共139页38PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Concatenate Files功能功能第38页/共139页39PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全

24、细胞记录数据的数据的分析分析一、一、离子通道的激活曲线离子通道的激活曲线二、二、离子通道的离子通道的I-VI-V曲线曲线三、三、离子通道的衰减离子通道的衰减四、四、离子通道的失活曲线离子通道的失活曲线五、量效曲线五、量效曲线第39页/共139页40PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l膜两侧电压差Vm改变，激活离子通道，用激活曲线描述。反映通道开启的速度速度及难易程度难易程度。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析一一、离子通道的激活曲线离子通道的激活曲线第40页/共139页41PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l

25、给予细胞一系列脉冲电压来记录全细胞电流，作通道的激活曲线：X轴脉冲电压VmY轴全细胞通道电导g/gmaxBoltzmann方程拟合全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第41页/共139页42PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014g：全细胞通道激活电导gmax：全细胞通道最大激活电导Vm：不同的去极化（或超极化）脉冲电压V1/2：通道激活50%时的脉冲电压k：斜率因子（反映激活速度快慢，k越大，激活速度越慢）全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析lBoltzmann方程第42页/共139页43PatchclamptrainingclassApr.23-2

26、5,2014设：f(V)=gImax=gmax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=0则即为前述的激活曲线方程：全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann,charge-voltage方程第43页/共139页44PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014先对数据进行处理（如基线调零、滤波、选择用于分析的Sweep数目等）。测量不同去极化脉冲电压下全细胞电流的峰值I（pA）。计算全细胞电导。gI/(VmVrev)对全细胞电导g进行标化：g/gmax，gmax=Imax/(Vm-Vrev)。作点图最后

27、用激活曲线方程对散点图进行拟合全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l 离子通道激活曲线制作步骤离子通道激活曲线制作步骤第44页/共139页45PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示激活曲线的制作演示激活曲线的制作第45页/共139页46PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l 几点说明几点说明（1）通过激活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通道开启过程的影响。（2）若要反映一类通道的激活特点或对

28、不同组数据进行比较，需要有细胞例数上的要求，要求出平均g/gmax值与标准差，再作激活曲线。（3）通道反转电位可通过Nernst方程计算出来，也可直接测试出来，后者更准确。第46页/共139页47PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l离子通道电流-电压关系曲线（I-V曲线）：反映通道：激活过程、阈电位、反转电位、整流特性l给予连续变化的步阶/斜坡脉冲电压Vm（范围大，最好跨越反转电位），测通道电流大小I，作I-V曲线：X轴VmY轴Il药物可影响通道激活或衰减，使I-V曲线形状发生改变。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析二二、离子通道的离子通道的I-V

29、I-V曲线曲线第47页/共139页48PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 用用Analyze/Quick Graph/I-V作作I-V曲线曲线适用于脉冲电压为歩阶（方波）形式的记录数据。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第48页/共139页49PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示用用Quick Graph/I-V作作I-V曲线曲线第49页/共139页50PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 注意事项注意

30、事项（1）通道未开放时，电流应该为零。因此要对基线进行细致的调零，可能要对每个Trace都进行基线调零。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第50页/共139页51PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（2）若要在一个细胞上测量多次，可选择Clampex中EditProtocol的Run功能，也可用Analyze/AverageFiles功能进行文件间的平均，得到某一个细胞的电流平均幅度值。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第51页/共139页52PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（3）测量同一种类多个细胞的

31、I-V曲线，需要对电流幅度标化。原因：细胞大小不同，通道电流幅度不同。对于一个球形细胞，膜电容Cmd2/100(pF)（d为细胞直径(m)）例子：若细胞直径d=20m，其膜电容Cm=12pF。电流密度：I/Cm，I/Cm-V曲线Cm值的获得：（a）封接过程直接获得（b）OnlineStatistics窗口采集Cm，最后获得平均Cm值I/Imax-V曲线。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第52页/共139页53PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（4）如果从钳制电位开始去极化（或超极化），在I-V曲线上应不包含钳制电位这个数据点。全细胞记录全细胞记录

32、数据的数据的分析分析Vhold=-60mV第53页/共139页54PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 用用Analyze/Quick Graph/Trace vs.Trace作作I-V曲线曲线适用于脉冲电压为斜坡（Ramp）形式的记录数据。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第54页/共139页55PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示用用Quick Graph/Trace vs.Trace作作I-V曲线曲线第55页/共139页56Patchcl

33、amptrainingclassApr.23-25,2014l 注意事项注意事项用用（1）Cursor1、2的位置要放置准确，不要由于放置的误差导致出现错误。为了更好、更准确地放置Cursor，应该：（a）在采集时设计好Protocol。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析不好好第56页/共139页57PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（b）应该以电流线（而不是Waveform电压线）为准设置Cursor。因为电流线滞后全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析1电流线Waveform221第57页/共139页58Patchclamptrainingc

34、lassApr.23-25,2014（2）可通过选择对话框中的Append，将两条I-V曲线作在一个图中。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第58页/共139页59PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l通道在激活因素（一般为去极化）持续存在条件下的失活衰减（Decay）衰减的指标：（1）时间常数；（2）10-90%衰减时间。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析三三、离子通道的衰减离子通道的衰减CurrentWaveform第59页/共139页60PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l衰减的时间常数衰减的时间常

35、数通道电流的衰减过程可用单指数方程或者双指数方程拟合，获得衰减的时间常数。Clampfit软件中“Exponential,standurd”指数拟合方程：全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析：衰减的时间常数i=2时，为双指数方程，拟合后获得1和2两个时间常数值。第60页/共139页61PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示衰减的拟合衰减的拟合第61页/共139页62PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 10-90%衰减时间衰减时间打开Analyze

36、/Statistics窗口，除设置其他选项外，要在Measurement中勾上Risetime,From10To90%。OK后，在Window/Results窗口中可查看到结果。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第62页/共139页63PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 给予细胞膜一个电压刺激，持续一段时间后，开放了的通道会逐渐失活，再给予电压刺激时，失活的通道将不再开放稳态失活（Steady-stateinactivation）。用失活曲线反映。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析四、离子通道的失活曲线四、离子通道的失活曲线2nA10ms-

37、50mVConditioning pulsesTesting pulsesVh=-90mV第63页/共139页64PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l失活曲线采用双脉冲设置的Protocol来获得数据条件脉冲将膜钳制在不同的电位水平，使相应部分通道处于完全失活状态。测试脉冲检测未失活通道的电流大小。X轴条件脉冲的电压数值Y轴测试脉冲的电流大小用Boltzmann方程拟合全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析2nA10ms-50mVConditioning pulsesTesting pulsesVh=-90mV第64页/共139页65Patchclam

38、ptrainingclassApr.23-25,2014I：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的电流大小Imax：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的最大电流Vm：不同条件脉冲电压V1/2：通道失活50%时的条件脉冲电压k：斜率因子（反映失活速度快慢，k越大，失活速度越慢）全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析lBoltzmann方程VmImax /2V1/20Imax第65页/共139页66PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann,charge-voltage方

39、程设：f(V)=IImax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=1则即为前述的失活曲线方程：第66页/共139页67PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 失活曲线制作步骤失活曲线制作步骤（1）对数据进行分析前的处理：基线调零、滤波等。（2）测量不同条件脉冲下的测试脉冲诱发的全细胞电流峰值（I）。以测试脉冲的全细胞最大电流峰值Imax为1，对其它电流标化，计算出I/Imax。（3）以Vm为x轴，I/Imax为y轴，作点图。（4）最后用失活曲线方程对散点图进行拟合。打开Clampfit中的Fit窗口，选择Boltzmann,charge-voltage方

40、程。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第67页/共139页68PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示失活曲线的制作演示失活曲线的制作第68页/共139页69PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 几点说明几点说明（1）通过失活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通道失活过程的影响。（2）同通道激活曲线一样，若要比较不同组之间的差异，作失活曲线也需要有细胞例数（n）上的要求，要求出平均I/Imax值与标准差，再作失活曲线。（3）在作失

41、活曲线时，脉冲电压的设定要注意：条件脉冲时间要设定得足够长，以使通道在某一去极化水平的失活达到完全，这需要根据通道的失活特点来设定。Na+离子通道：衰减快，条件脉冲20ms宽L型Ca2+离子通道：衰减缓慢，条件脉冲的宽度十几秒条件脉冲与测试脉冲的间隔不能设定得过长，以防止失活的通道恢复，影响测试脉冲的测量。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析条件脉冲测试脉冲第69页/共139页70PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 概念概念量效曲线：X轴药物剂量/浓度大小Y轴药理效应强弱阈浓度半效浓度EC50最大效能效价强度全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析

42、五、五、量效曲线量效曲线第70页/共139页71PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l Clampfit中的中的Hill方程：方程：Hill(4 parameter logistic)方程方程（1）观察药物对某种受体/通道电流的诱发/增强作用时：Imax：药物作用后通道的最大电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半效浓度EC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1。若观察配体对受体通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近0。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampf

43、it中的中的Hill方程：方程：Hill(4 parameter logistic)方程方程（1）观察药物对某种受体/通道电流的诱发/增强作用时：Imax：药物作用后通道的最大电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半效浓度EC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1。若观察配体对受体通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近0。第71页/共139页72PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（2）观察药物对某种受体/通道电流的阻断作用时：Imax：最大浓度药物作用后的电流幅度Imin：

44、药物作用前的电流幅度C50：半抑制浓度IC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imin。拟合时，设Imin=1。若药物对通道电流完全阻断，拟合后，Imax接近0。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第72页/共139页73PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（3）观察配体诱发受体通道的电流时，因配体施加前通道不开放，可以采用Clampfit中的Hill,Langmuir方程对量效曲线进行拟合：设：i=1C=0C50：半效浓度EC50X：所施加的药物浓度h：Hill系数全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第73

45、页/共139页74PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 例例1.GABA诱发的诱发的GABA-A受体电流的量效曲线制作受体电流的量效曲线制作全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析GABA:0.5、1、5、10、50、100 mol/L第74页/共139页75PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示GABA电流的量效曲线电流的量效曲线第75页/共139页76PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 例例2.荷包牡丹碱荷

46、包牡丹碱Bicuculline对对GABA-A受体电流抑制作用的量效曲线制作受体电流抑制作用的量效曲线制作全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析Bicuculline:0,0.1,1,10,100 mol/LGABA:10 mol/L第76页/共139页77PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示Bicuculline的量效曲线的量效曲线第77页/共139页78PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014l 几点说明几点说明药物浓度的选择：（1）要含有阈浓度和最

47、大效能浓度。（2）按一定倍比关系：如1、2、5、10、20、50、100等。（3）至少4个浓度。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第78页/共139页79PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014药物施加原则：（1）按照从低到高浓度的顺序施加。在用浴槽灌流给药时要将前次药物冲洗掉，然后再给下一个浓度；在用培养皿时（难以灌流）每次施加的药量要少，防药物累加。（2）为获得稳定的量效曲线，药物从低到高的几个浓度最好在同一个细胞上施加。因此要求有合适的给药装置和高质稳定的全细胞记录。（3）正式实验前，需要先期做预实验来确定每个药物浓度的给药间隔时间，确保药物作用不

48、受受体失敏的影响。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第79页/共139页80PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014依据实验要求和药物特点选择给药方法：（1）配体或通道的激动剂的施加要求快速、微量的给药装置；（2）昂贵的药物一般不采用灌流给药，而采用压力喷射给药；（3）受体拮抗剂可与配体一起施加，也可预先加入拮抗剂；（4）用培养皿时，因灌流置换液体困难，要采用压力喷射给药方法；（5）直接用加样枪向培养皿或浴槽内滴加药物的方法，只用于简单的药物定性；（6）离子电泳的给药方法适合于能够离子化的药物。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第80页/共139页

49、81PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014Clampfit的作图效果不理想，不适合正式发表文章。采用作图软件Origin制作量效曲线：选择Analysis/Non-linearCurveFit中的Logistic方程。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第81页/共139页82PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014实验一般要求有细胞的个数（n），获得平均值和标准差。标准差可用作图软件Origin显示出来：在数据表窗口，选择Column/SetasYError。全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第82页/共139页

50、83PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014不同药物量效曲线的比较要求：选择相同的浓度兼顾阈浓度与最大效能浓度。将两个量效曲线作在一起的方法：Clampfit在制作第2个量效曲线时选择Analyze/AppendtoGraph功能来制作。Origin采用在数据表直接输入数据的方法将几条量效曲线作在一个图中。以某药物最大诱发电流来标化其他药物例子：Nic诱发最大电流=100%ACh诱发电流与之比较全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析第83页/共139页84PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014单通道记录数据的分析单通道记录