液相色谱基本原理.pptx

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1、背景背景色谱法也称色层法，是色谱法也称色层法，是19061906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命名发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法色谱法”（Chromatography)Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。英国生物学家英国生物学家MartinMartin和和SyngeSyn

2、ge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。见卓识的预言。19441944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLCHPLC）等。）等。第1页/共94页色谱法的基本原理色谱法的基本原理色谱法是利用混合物中各组分色谱法是利用混合物中各组分物理化学物理化学性质的差性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定

3、的，分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。移动而达到分离的目的。第2页/共94页慢慢中等中等快快色谱分离色谱分离色谱分离色谱分离Temporal course淋洗液淋洗液第3页/共94页色谱的基本概念色谱的基本概念固定相固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换

4、等作用。流动相流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。第4页/共94页分配系数分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度第5页/共94页保留时间保留时间（tR）和保留体积（和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。第6页/共94页分离度分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。相邻的溶质相互分离的程度。两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值两个相邻

5、洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.第7页/共94页阻滞因子阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小.第8页/共94页洗脱体积洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异。第9页/共94页理论板，理论板当量高度（理论板，理论板当量高度（HETPHETP），理论塔板），理论塔板数（数（N N）、）、反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系。理论板：理论板：将溶质达到一次分配平衡的

6、色谱柱段。理论板当量高度：理论板当量高度：该段色谱柱的高度。第10页/共94页理论板数的计算方法理论板数的计算方法N N-理论塔板数理论塔板数 t tR R-保留时间保留时间W W1/21/2-半峰宽半峰宽 W Wb b-峰底宽度峰底宽度n理论塔板高度：理论塔板高度：L-柱长第11页/共94页22.2 色谱分离方法的分类色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：第12页/共94页第13页/共94页按操作形式不同分类：按操作形式不同分类：柱色谱：柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸色谱：纸色谱：用滤纸做液体

7、的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层色谱：薄层色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸色谱类似的方法进行物质的分离和鉴定。纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。谱形式。第14页/共94页按分离

8、的压力按分离的压力 高压色谱高压色谱 中压色谱中压色谱 低压色谱低压色谱按流动相分按流动相分 气相色谱气相色谱 液相色谱液相色谱 超临界流体色谱超临界流体色谱第15页/共94页22.3 22.3 各类色谱技术及应用各类色谱技术及应用 l凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱l离子交换色谱离子交换色谱l疏水色谱疏水色谱l聚焦色谱聚焦色谱l反相色谱反相色谱l超临界流体色谱超临界流体色谱l羟基磷灰石色谱羟基磷灰石色谱l灌注色谱灌注色谱l应用应用第16页/共94页凝胶过滤技术凝胶过滤技术1)Gel filtration chromatography(GFC)原原理理操操作作与与原原理理：含含有有不不同同组组分分的的

9、溶溶液液，通通过过网网状状结结构构的的凝凝胶胶粒粒子子(a)(a)，小小分分子子扩扩散散进进入入凝凝胶胶相相，大大分分子子被被排排阻阻于于凝凝胶胶相相外外，加加入入洗洗脱脱剂剂后后溶溶液液向向下下推推移移，大大分分子子及及剩剩余余的的小小分分子子进进入入下下层层新新的的凝凝胶胶相相中中，重重复复上上述述扩扩散散和和排排阻阻。这这样样最最先先流流出出的的为为最最大大的的分分子子，最最后后流流出出的的为为最最小小分分子子，分分段段收收集集可可以以获获得得按按分分子子量量大大小分布的各组分。小分布的各组分。分分子子筛筛色色谱谱:从从上上可可见见，凝凝胶胶过过滤具有分子筛的作用。滤具有分子筛的作用。第

10、17页/共94页第18页/共94页分子筛凝胶色谱原理分子筛凝胶色谱原理第19页/共94页分离关系：组分分离关系：组分0 0的的M M最大，不能进入最大，不能进入gelgel，洗脱，洗脱体积为空隙体积体积为空隙体积V V0 0；组分；组分t t的的M M最小，能进入最小，能进入到到gelgel的细孔中，其洗脱体积接近柱体积的细孔中，其洗脱体积接近柱体积V Vt t,组分组分1-21-2在在V V0 0-V-Vt t之间之间.显然，显然，GFCGFC能分离洗脱能分离洗脱体积在体积在V V0 0-V-Vt t之间的组分。对于组分之间的组分。对于组分1 1和和2 2，两，两峰距离峰距离分配系数m影响因

11、素：分子量分子量,分子形状分子形状,gel,gel孔径孔径结构；与结构；与pH,I,TpH,I,T无关无关.第20页/共94页2)2)凝胶介质凝胶介质对介质的要求：对介质的要求：1st亲水性高；2nd表面惰性，不发生化学和物理变化；3rd高稳定性，有较宽的pH和I适应范围；4th具有一定的孔径分布；5th机械强度高，耐高压操作，寿命长。商品化的介质均能满足1-4条的要求。介质的类型：1st Sephadex2nd Sephacryl 3rd Superose/-dex,Sepharose4th Cellulose5th TSKgel第21页/共94页第22页/共94页凝胶介质特征参数凝胶介质特

12、征参数排排阻阻极极限限(exclusion(exclusion limit)limit)：指指不不能能扩扩散散到到凝凝胶胶网网络络内内部部的的最最小小分分子子的的M M。如如，Sephadex Sephadex G50G50的排阻极限为的排阻极限为30kD30kD。分分级级范范围围(fractionation(fractionation range)range)：能能阻阻滞滞组组分分并并且且使使组组分分相相互互之之间间得得到到分分离离的的组组分分分分子子量量范范围。如，围。如，Sephadex G50Sephadex G50的分级在内。的分级在内。溶胀率溶胀率/吸水率：吸水率：如，如，Seph

13、adex G50Sephadex G50的溶胀率的溶胀率 =500 30%=500 30%。第23页/共94页凝凝胶胶粒粒径径：软软gelgel粒粒径径较较大大，在在50-15050-150 m m之之间间；硬硬gelgel较较小小，在在5-505-50 m m之之间间。粒粒径径越越小小，HETPHETP越小，分离效率越高。越小，分离效率越高。床床体体积积(bed(bed volume)volume)：1g1g干干燥燥gelgel溶溶胀胀后后所所占占有有的的体体积积。如如，Sephadex Sephadex G50G50的的床床体体积积为为9-11 9-11 cmcm3 3/g/g干胶。干胶。

14、空空隙隙体体积积(void(void volume)volume)：凝凝胶胶之之间间的的空空隙隙体体积积，即即V V0 0。空空隙隙体体积积一一般般用用平平均均分分子子量量在在2000KD2000KD水水溶溶性性蓝蓝葡葡聚糖聚糖(blue dextran)(blue dextran)测定测定。第24页/共94页4)4)影响影响GFCGFC分离特性的因素分离特性的因素线速度：线速度：1 1stst HW40FHW40F凝凝胶胶的的排排阻阻极极限限小小，在在该该凝凝胶胶中中蛋蛋白白质质的的m m=0 0，故故HETPHETP =2 2D Dz z/u u (D Dz z ududp p)=常数。常

15、数。2 2ndnd HW55FHW55F凝凝胶胶的的排排阻阻极极限限较较大大，在在此此，m m 0,0,HETP HETP u;u;在在 u u=0 0处处，直直 线线 交交 于于 点点 2 2D Dz z/u u。3 3rdrd 当当u u 0.2 0.2 cm/min,cm/min,NaClNaCl的的HETPHETP随随流流速速降降低低急急剧剧增增大大。这主要由于分子的扩散影响。这主要由于分子的扩散影响。第25页/共94页进样体积：进样体积：1st 在一定相对料液体积范围内，HETP为常数；2nd 但一定时间之后，HETP随料液相对体积的增加而急剧增大。3rd 意义：为得到较高的分离度，

16、料液体积需根据溶质的m差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取最大值。料液浓度料液浓度依据GFC的原理，tr和HETP与浓度无关。但实验表明，当浓度较高时，洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双峰；使HETP极度上升。这主要为样品黏度高造成。经验表明，料液与流动相的黏度比应控制在2以内。第26页/共94页分子量分子量M M和分配系数和分配系数m m1st 在GFC分级范围内m与M关系 此时，分离度方程为 方程示：b值越大，即凝胶分级范围越小，Rs越大。2nd 因此，一定料液时，根据组分的M选择分级范围较小的介质，提高Rs和料液的处理量。第27页/共94页凝胶的粒径凝胶的粒径1st dp,HET

17、P.故dp是N的最佳途径；2nd dp10倍,而h和v不变，u10倍，HETP(=hdp)10倍，R10倍第28页/共94页5）应用1st 分离纯化M：x0-106，之间；种类：肽、脂质、抗生素、糖、核酸、病毒(50-400nm)。2nd 除热原、过敏原如青霉噻唑蛋白 Sephadex G25凝胶柱。3rd脱盐/置换buffer第29页/共94页4 4thth M M测定测定原理：原理：挑挑选选标标准准蛋蛋白白质质：cyt cyt C(12500),C(12500),Mb(16900),Mb(16900),胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白(23200),(23200),卵卵白白蛋蛋白白(45000)(45

18、000)和和Hb(64500).Hb(64500).条件：在凝胶介质分级范围内条件：在凝胶介质分级范围内.作图：作图：第30页/共94页6 6）优点）优点1st 如其他色谱相比，操作简便，介质价廉易得；适合于大规模生产；2nd 溶质和介质不发生任何形式的相互作用，故操作条件温和，回收率接近100%；3rd 分离结束后，无须对分离介质进行清洗和再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；4th 作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。5th 分离机理简单，操作参数少，易于放大。7 7）缺点）缺点1st 分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少；2nd 经

19、GFC洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。第31页/共94页离子交换色谱离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法第32页/共94页原理原理 (ion exchanger chromatography,IEC)1st 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数m I-离子强度；A和B为常数,均为pH的函数，在物理意义上，B为溶质的静电荷数与交换剂的离子价数之比(对于pro,一般大于10)。m-离子强度无限大时的溶质分配系数,为静电作用外的非特异性吸附引起的溶质在交换剂上分配。2nd 意义：意义：对于pro.和aa调节I value

20、调节|pH pI|value第33页/共94页常用的离子交换树脂常用的离子交换树脂葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂第34页/共94页Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列Mo

21、noBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列第35页/共94页Mini Q PC 3.2/3:Glutathione synthetaseSDS-PAGEStarting materialPeak 2第36页/共94页操作1st 恒定洗脱(Sephadex常用)缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽第37页/共94页2nd 线性梯度洗脱线性梯度洗脱(linear gradient elution)线性梯度洗脱的优缺点线性梯度洗脱的优缺点优点：流动相I/pH 连续变化，不易出现干扰峰，操作范

22、围广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。第38页/共94页3 rd 阶梯洗脱法(stepwise elution)优点：无须特殊设备，操作简单；缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。第39页/共94页线性洗脱时间定义：GHdI/dV-离子强度梯度(mol/l)，F-流动相流量(l/s).利用GH和Ip关系图及上述方程，可算tr第40页/共94页分离度和柱效1st 分离度意义：4因素可控制2nd 柱效意义：I+dIImi富集效应第41页/共94页应用：第42页/共94页疏水性吸附色谱(hydrophobic interaction chromatogr

23、aphy,HIC)原理原理1)吸附1st pro疏水性2nd pro稀疏水性差异3rd 原有吸附介质的亲水性4th 亲水性介质的改造第43页/共94页第44页/共94页第45页/共94页2)影响pro水化层因素1st 水化层(hydration shell)tight hydration shell(0.35g water/1g pro)loose hydration shell(2g water/1g pro)2nd ionic strength3rd|pH水 pI|Value|pH水 pI|Value zeta电势 水化层4th 增加亲水性物质离子：SCN-，ClO4-，I-有机物：乙二醇

24、、丙三醇等含羟基物质5th 表面活性剂Tight hydration shellProtein coreLoose hydration shell洗脱方法?第46页/共94页3)、洗脱方法降低离子强度增加|pH pI|乙二醇 or I-表面活性剂4)、富集效应I+dIImi第47页/共94页分离效率和柱效1st 分离效率2nd 柱效3rd 降低颗粒大小的极端重要性第48页/共94页Applications第49页/共94页特点：1st互补工具：HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相当。2nd 与盐析衔接

25、：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3rd 可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。4th 疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。第50页/共94页反相色谱reversed phase chromatography,RPC固定相：非极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基，R为C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODS Octadecyl silica)。烷基化密度：45%，55%的羟基用三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全非极性化。溶质在介质上的分配

26、系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，m高。流动相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇,乙晴,异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等)洗脱：有机溶剂增加。第51页/共94页30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect第52页/共94页Source RPC第53页/共94页应用：主要应用于5000KD以下，特别是1000以下的非极性小分子物质的分离蛋白质：可以应用，但存在变性的危险。有机溶剂第54页/共94页亲和色谱亲和色谱（Affinity chromatography）载体活化、配基连接、吸附、洗脱第55页/共94页生物亲和作用和亲和纯化技术

27、生物亲和作用和亲和纯化技术生物分子能够区分结构和生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分选择性地与其中某一种分子相结合。生物分子间的子相结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为这种特异性相互作用称为亲和作用。亲和作用。利用生物分子间的这种特利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术称为亲和纯化技术第56页/共94页亲和纯化技术的发展亲和纯化技术的发展亲和层析亲和层析 1951年，年，Campbell等，半抗原修饰纤维素制备了生物亲和介质从血情等，半抗原修饰纤维

28、素制备了生物亲和介质从血情中纯化了抗体。中纯化了抗体。1967年，年，Axen等利用溴化腈活化琼脂糖凝胶成功制备了亲和吸附介质，等利用溴化腈活化琼脂糖凝胶成功制备了亲和吸附介质，使亲和层析技术从研究走向实用。使亲和层析技术从研究走向实用。其他新型亲和技术：亲和过滤，亲和分配，亲和反胶团萃取，亲和沉淀，亲和电泳等其他新型亲和技术：亲和过滤，亲和分配，亲和反胶团萃取，亲和沉淀，亲和电泳等第57页/共94页生物亲和作用生物亲和作用-本质本质亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理尚不清楚亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理尚不清楚蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构，上述结构恰好能使某些小分子进入到其中

29、，蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构，上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，形成构象上的钥匙形成构象上的钥匙-锁关系锁关系亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多种力的相互作用亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多种力的相互作用第58页/共94页亲和作用中的相互作用力亲和作用中的相互作用力静电作用静电作用氢键氢键疏水性相互作用疏水性相互作用配位键配位键弱共价键弱共价键第59页/共94页影响亲和作用的因素影响亲和作用的因素离子强度离子强度pH抑制氢键形成的物质抑制氢键形成的物质温度温度螯合剂螯合剂第60页/共94页亲和作用体系亲和作用体系特异性特异性亲和体系亲和体系高特异性高特异性酶酶-底物、产物、

30、抑制剂底物、产物、抑制剂抗原抗原-单克隆抗体单克隆抗体荷尔蒙荷尔蒙-受体蛋白受体蛋白核酸核酸-互补碱基链段互补碱基链段群特异性群特异性免疫球蛋白免疫球蛋白-A-A蛋白、蛋白、G G蛋白蛋白酶酶-辅酶辅酶酶、蛋白质酶、蛋白质-过渡金属离子（过渡金属离子（CuCu2+2+,Zn,Zn2+2+)凝集素凝集素-糖、糖蛋白、细胞表面受体糖、糖蛋白、细胞表面受体第61页/共94页配基（配基（ligand)ligand)：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子。：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子。L+EL+EE LE L解离常数：解离常数：K Kd d=EL/EL=EL/EL 结合常数：结合常数：

31、K Ka a=1/Kd=EL/EL=1/Kd=EL/EL亲和体系的结合常数为亲和体系的结合常数为10104 4-10-108 8dmdm3 3/mol/mol第62页/共94页亲和层析原理亲和层析原理 亲和层析是利用偶亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和联亲和配基的亲和吸附介质为固定相吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，亲和吸附目标产物，使目标产物得到分使目标产物得到分离纯化的液相层析离纯化的液相层析法法第63页/共94页亲和层析亲和层析-操作过程操作过程第64页/共94页亲和配基亲和配基酶的抑制剂酶的抑制剂:大豆胰蛋白酶抑制剂大豆胰蛋白酶抑制剂抗体：抗体抗体：抗体-抗原，抗原，Ka=10Ka=10

32、7 7-10-101212。单抗免疫亲和层析。单抗免疫亲和层析A A蛋白：与免疫球蛋白蛋白：与免疫球蛋白IgGIgG结合。结合。凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。辅酶和磷酸腺苷：辅酶辅酶和磷酸腺苷：辅酶I I，与脱氢酶，激酶结合。，与脱氢酶，激酶结合。三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。Reactive Blue 2 Reactive Blue 2 与脱氢酶，与脱氢酶，激酶结合。激酶结合。过渡金属离子过渡金属离子:Cu2+,Ni2+,Zn2+:Cu2+,Ni2+,Zn2+组氨酸组氨酸:咪唑环，

33、静电和疏水作用。咪唑环，静电和疏水作用。肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等结合。等结合。第65页/共94页亲和吸附介质亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联在固体粒子表面（孔内）即将亲和配基共价偶联在固体粒子表面（孔内）即可制备亲和吸附介质可制备亲和吸附介质具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；物理和化学稳定性高，有较高的机械强度物理和化学稳定性高，有较高的机械强度含有可活化的反应基团含有可活化的反应基团粒径均一的球形粒子粒径均一的球形粒子第66页/共94页亲和配基固定化

34、亲和配基固定化亲和配基的固定化方法亲和配基的固定化方法介质的活化介质的活化溴化腈活化法：溴化腈活化法：-NH-NH2 2，在碱性条件下完成。在碱性条件下完成。环氧基活化法：环氧基活化法：-NH-NH2 2,-OH,-SH,-OH,-SH直接固定法和间接固定法（氧化法，碳二亚胺法，直接固定法和间接固定法（氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法）戊二醛活化法）硅胶的活化法硅胶的活化法:-OH:-OH，不宜在碱性条件下进行。，不宜在碱性条件下进行。第67页/共94页间隔臂的作用间隔臂的作用当配基分子量较小时，当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，为了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间需要在配基和载

35、体之间连接一个连接一个“间隔臂间隔臂”间隔臂的长度有一定限间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，制，超过一定长度后，配基与目标分子的亲和配基与目标分子的亲和力会减弱力会减弱第68页/共94页过程及影响过程及影响因素因素过程过程：进料进料清洗清洗洗脱洗脱柱子再生。柱子再生。应应保证配基对目标产物有较高的吸附容量。保证配基对目标产物有较高的吸附容量。目标产物在亲和介质上的吸附平衡多用目标产物在亲和介质上的吸附平衡多用Freundlich或或Langmuir型的等温式表示。型的等温式表示。进料过程中的杂质影响进料过程中的杂质影响 料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，料液中目标

36、产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降低纯化效果。杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、会大大降低纯化效果。杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关。载体材料、配基固定化方法等众多因素相关。进料的料液流速进料的料液流速 流速的增大，分离速度加快，但柱效降低。流速的增大，分离速度加快，但柱效降低。第69页/共94页目标产物洗脱目标产物洗脱特异性洗脱特异性洗脱 洗脱剂：含有与亲和配基或目标产洗脱剂：含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物物具有亲和作用的小分子化合物例：精氨酸溶液洗脱赖氨酸为配基亲和吸附的例：精氨酸溶液洗脱赖氨酸为配基亲和

37、吸附的t t-PA-PA第70页/共94页目标产物洗脱目标产物洗脱n非特异性洗脱：调节洗脱液的非特异性洗脱：调节洗脱液的pH值，值，离子强度，离子种类或温度等理化性质。离子强度，离子种类或温度等理化性质。柱子：柱子：BSA-Sepharose 4B BSA-Sepharose 4B 洗脱方式：逐次降低洗脱液洗脱方式：逐次降低洗脱液pHpH值值分离组分：分离组分：BSABSA血清不同的抗体组分。血清不同的抗体组分。第71页/共94页应用举例组织纤溶酶原激活剂（组织纤溶酶原激活剂（t t-PAPA）的纯化）的纯化干扰素（干扰素（IFNIFN）的纯化）的纯化 重组人白细胞干扰素，经重组人白细胞干扰素

38、，经一步单抗免疫亲和层析，一步单抗免疫亲和层析，rhIFN-rhIFN-比活提高了比活提高了11501150倍，收率达倍，收率达95%95%。柱子：精氨酸柱子：精氨酸-Sepharose -Sepharose 4B4B亲和柱亲和柱洗脱液：盐酸胍（洗脱液：盐酸胍（GuCl)GuCl)猪心组织猪心组织t-PA:t-PA:活性提高活性提高7 7倍，收率为倍，收率为56%56%第72页/共94页22.4 蛋白质分离常用的色谱方法蛋白质分离常用的色谱方法免疫亲和色谱属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和色谱介质的获得：（1）获得抗体（2）抗体连

39、接到载体上第73页/共94页疏水色谱在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。操作要点蛋白质的局部变性洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行第74页/共94页离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段操作要点：由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）第75页/共94页缓冲溶液的离子强度不能过高，通常

40、在1020m mol。色谱方案的确定，需要视试验情况作适当调整。洗脱方式：pH梯度 离子强度梯度第76页/共94页22.5 色谱系统高通量液相色谱系统分析型色谱系统第77页/共94页AKTA explorer 100色谱系统第78页/共94页AKTA explorer 100色谱系统工作流程第79页/共94页第80页/共94页 HPLC第81页/共94页HPLC第82页/共94页AIEXTechniqueUltrafiltrationUFSuperdex 200 p.g.GFPurificationfactorQ Sepharose FF 10 times purification 82%yi

41、eldPhenyl Sepharose HPHICY.-F.Liao et al.(1996)J.Biol.Chem.271,2834863622719Purification of recombinant a a-mannosidase from Pichia pastoris第83页/共94页多肽的分离纯化多肽的分离纯化第84页/共94页蛋白的纯化蛋白的纯化第85页/共94页第86页/共94页第87页/共94页TechniquePptHICAIEXCIEXACPurificationfactor720240818647Porcine cerebella homogenateRESOURCE

42、 QAmmonium sulfateprecipitationButyl Sepharose Fast FlowRESOURCE sHiTrap HeparinG Protein Receptor Kinase PurificationG Protein Receptor Kinase Purification第88页/共94页Rec Rec a a a a-Mannosidase Purification from Pichia-Mannosidase Purification from PichiaTechniquePurificationfactor63622719UFGFAIEXHIC

43、Phenyl Sepharose HPQ Sepharose FFSuperdex 200 pgUltrafiltration第89页/共94页DNA Binding Protein PurificationDNA Binding Protein PurificationTechniqueDNA-1 Sepharose CIEXACACACCIEXPurificationfactor58494392447HeLa cell nuclearextractsSP Sepharose High PerformanceHeparin Sepharose Fast FlowDNA-2 Sepharose

44、 Mono S第90页/共94页思考题思考题什么是色谱分离技术？什么是色谱分离技术？色谱分离技术的分类？色谱分离技术的分类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理其原理.什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？什么是吸附色谱及其分类和基本原理？什么是吸附色谱及其分类和基本原理？什么是分配色谱？什么是分配色谱？简述高效液相色谱的工作原理？简述高效液相色谱的工作原理？第91页/共94页离子交换色谱的分类及应用凝胶色谱的分离原理及分类离子交换及疏水作用色谱的原理高效液相色谱的分离原理及应用？共价色谱的工作原理？第92页/共94页第93页/共94页感谢您的观看！第94页/共94页