生物技术在药用植物育种上的应用1.pptx

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1、 面对许多野生的药用植物濒于灭绝，一些特殊环境下的药用植物引种困难等问题，生物技术在药用植物育种上的应用研究已成为当今中药研究的热点，如育出了茎尖地黄新品系，已在产区应用，并将使传统中药进入一个崭新的时代。第1页/共171页什么是生物技术？生物技术（Biotechnology）：Bio Bio Biology Biology Technology Technology ApplicationApplicationThe application of BiologyThe application of Biologyfor the benefit of humansfor the benefit

2、 of humans第2页/共171页What is Biotechnology?ppTraditional/old biotechnologyThe conventional techniques that have been used to produce beer,wine,cheese,many other food.第3页/共171页 Beer,Bread,and Wine Making are Centuries Old.Ancient Egyptian drawing of a cylinder seal impression on a jar stopper bearing t

3、he name of Khasekhemwy,a Dynasty 2 pharoah.It shows a grapevine trained to run along a trellis or arbor.(around 2700 b.c.)第4页/共171页 远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成了醇香可口的饮料-人类最早发明的酒微生物发酵第5页/共171页qqNew/modern biotechnologyNew/modern biotechnologyAll methods of genetic modification by recombinant DNA and cell All me

4、thods of genetic modification by recombinant DNA and cell fusion techniques,together with the modern development of fusion techniques,together with the modern development of traditional biotechnological process.traditional biotechnological process.第6页/共171页组织培养Micropropagation第7页/共171页白菜白菜甘蓝甘蓝白菜甘蓝白菜

5、甘蓝体细胞杂交第8页/共171页基因工程重组乙肝疫苗第9页/共171页基因工程做成的基因工程做成的“超级细菌超级细菌”能吞食和分解多种污能吞食和分解多种污染环境的物质。染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的工程培育成功的“超级细菌超级细菌”却能分解石油中的多种烃却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDTDDT等毒害物质。等毒害物质。第10页/共171页通过基因工程的方式通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，

6、每大肠杆菌，每1Kg1Kg的培养液的培养液可提取可提取4 420mg20mg干扰素，若干扰素，若从人血中提取干扰素，从人血中提取干扰素，300L300L血才提取血才提取1mg1mg！人造血液及其生产人造血液及其生产第11页/共171页 Science Vol.222,Nov.1983Time Magazine,March 19971983 SCIENCE Cover Transgenic Mice1997 TIME Cover-Dolly第12页/共171页“黄金”大米通过转基因技术，转化胡萝卜素合成酶基因，使大米富含胡萝卜素，从而解决人们缺乏维生素A的问题，而大米也成了金黄色的“黄金大米”。

7、转基因技术第13页/共171页转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基转鱼抗寒基因的番茄因的番茄第14页/共171页S sensitive plantsR resistant plants PCR-RFLP marker linked to nematode resistance gene Mi分子标记辅助育种第15页/共171页Biotechnology:A collection of technologies第16页/共171页The Applications of BiotechnologyqqMedical BiotechnologyMedical Biotechno

8、logyvvDiagnosticsDiagnosticsvvTherapeuticsTherapeuticsvvVaccinesVaccinesqqAgricultural BiotechnologyAgricultural BiotechnologyPlant agriculturePlant agricultureAnimal agricultureAnimal agricultureFood processingFood processingqqEnvironmental BiotechnologyEnvironmental BiotechnologyCleaning through b

9、ioremediationCleaning through bioremediationPreventing environmental problemsPreventing environmental problemsMonitoring the environmentMonitoring the environment第17页/共171页第一节 细胞工程育种 植物细胞工程 指以植物细胞为操纵对象，在体外进行培养、繁殖，或指以植物细胞为操纵对象，在体外进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和

10、创造新品种，加速繁育植物个体或获得某种到改良生物品种和创造新品种，加速繁育植物个体或获得某种有用物质的过程。有用物质的过程。一、植物离体培养技术二、体细胞变异及突变体筛选三、原生质体培养和体细胞杂交四、染色体工程第18页/共171页一、离体培养技术（in vitro culture）植物细胞的全能性（Cell Totipotency）一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称之为细胞的全能性。即广义的组织培养，是现代生物技术的一个重要组成部分，它是指运用无菌操作技术，将从植物体分离的符合需要的组织、器官或细胞（包括去壁后的原生质体）等，接种在人工培养基上，置于人工控制的环境条件下进行培养，以获

11、得再生的完整植株或生产具有经济价值的其它生物产品的技术。第19页/共171页切取切取接种接种愈伤组织的形成愈伤组织的形成分化形成小芽或根分化形成小芽或根试管苗的形成试管苗的形成移栽移栽第20页/共171页植物离体培养主要包括：植物离体培养主要包括：1、胚珠和子房培养2、离体胚的培养3、组织或愈伤组织培养4、细胞培养5、原生质体培养第21页/共171页离体培养技术在药用植物育种上的应用 1、种质创新克服远缘杂交障碍获得远缘杂种 远缘杂交的障碍：杂交不亲和性（cross-imcompatibility）试管授粉受精杂种不育性（hybrid invability）幼胚培养和胚胎拯救、体细胞融合杂种不

12、稔性（hybrid infertility）第22页/共171页获得体细胞杂种（somatic hybrid）体细胞杂交可以获得通过有性杂交不能获得的属间或种间杂种，转移胞质遗传性状（如雄性不育性）以及非豆科作物转移固氮基因，或高光合效率的基因转移。A somatic hybrid(center)between cultivated potato(left)and wild species(right).第23页/共171页突变诱发与体细胞无性系筛选 体细胞无性系变异（somaclonal variation）是选择变异的一个重要来源。为了筛选出特殊的突变类型，可以把某种选择因素结合到培养基或

13、环境逐个进行筛选。通过这一途径，已分离出广谱的变异细胞系，如抗药物、抗除草剂、抗病、抗不良环境条件细胞系，从而成功进行离体选择 Example of somaclonal variation;a dwarf banana after micropropagation Carrot family lines regenerated from tissue-culture.Both have been grown for 12 weeks in a glasshouse after 10 weeks vernalisation.Family 16(LHS)are flowering abundan

14、tly,while Family 17(RHS)have not flowered.第24页/共171页遗传转化受体系统 进行高效遗传转化的前提是建立良好的离体再生系统。以原生质体、叶片或愈伤组织等外植体作为受体进行遗传转化，培养出转基因植株，在作物改良上具有巨大的潜力 第25页/共171页倍性育种（胚乳培养、花药培养）利用花药及花粉利用花药及花粉培养进行单倍体育培养进行单倍体育种，将优良的单倍种，将优良的单倍体进行染色体加倍，体进行染色体加倍，便可迅速地获得纯便可迅速地获得纯合的二倍体，从而合的二倍体，从而加速亲本材料的纯加速亲本材料的纯化。三倍体植物也化。三倍体植物也可通过胚乳培养再可通过

15、胚乳培养再生植株的途径获得生植株的途径获得。第26页/共171页单倍体育种程序：材料采集 接种培养 诱导愈伤组织 获得再生植株 染色体加倍 幼苗培育和品种选择第27页/共171页2、无病毒苗木繁育 对于无性繁殖植物感对于无性繁殖植物感染病毒引起退化的品种染病毒引起退化的品种可以通过分生组织培养可以通过分生组织培养或再结合如热处理等其或再结合如热处理等其它处理，有效地进行脱它处理，有效地进行脱毒，从而获得了脱毒苗。毒，从而获得了脱毒苗。如马铃薯、大蒜、草莓、如马铃薯、大蒜、草莓、甘薯等甘薯等第28页/共171页脱毒第29页/共171页3、种质资源保存中国农业科学院国家种质资源库 利用茎尖培养利用

16、茎尖培养结合低温或超低温冷结合低温或超低温冷冻贮藏来保存种质资冻贮藏来保存种质资源，特别是对一些无源，特别是对一些无性繁殖作物的种质资性繁殖作物的种质资源保存更有价值。它源保存更有价值。它不仅节约空间，又可不仅节约空间，又可减少病虫为害，也便减少病虫为害，也便于运输利种质资源的于运输利种质资源的交换。交换。第30页/共171页4、生产人工种子种皮种皮胚芽胚芽胚根胚根现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡胶等几十种植物的人工种子试种成功。胚乳或子叶第31页/共171页二、体细胞变异与突变体的筛选1、体细胞变异及突变体类型 Larkint Scowcroft把由任何形式的细胞培养所

17、产生的植株统称为体细胞无性系，而把这些植株所表现出来的变异称为体细胞无性系变异。植物细胞在离体培养过程中，细胞、愈伤组织以及再生植株因各种外部因素的影响可能会发生一定频率的变异。发生了可遗传变异的体细胞或再生植株等个体称为突变体。突变体类型：抗性突变体不育性突变体营养缺陷型突变体形态特征和生物学特性突变体第32页/共171页体细胞突变体的诱发和筛选材料选择 目标性状明确；细胞培养技术可行；细胞类型适当突变诱发 采用物理或化学人工诱变突变体筛选 直接筛选法，间接筛选法突变体鉴定 筛选后先转移到非选择培养基上，再转到分化培养基上再生植株，最后利用各种手段检测突变体的表达及遗传稳定性。第33页/共1

18、71页三、药用植物原生质体培养和体细胞杂交 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。植物原生质体培养是指将植物细胞去壁后，放在无菌条件下，使其进一步生长发育的技术。目前，药用植物原生质体（protoplast)培养已获得成功的包括夹竹桃科、五加科、紫草科、菊科、葫芦科、龙胆科、豆科、毛茛科、茄科、玄参科、伞形科、天南星科和百合科的数十种植物。第34页/共171页1、原生质体培养的意义：第35页/共171页Washing process to remove debris PROTO

19、PLAST ISOLATION AND PURIFICATION第36页/共171页2、原生质体的分离 植物细胞具有细胞壁，获得大量有活力的原生质体，需要设法去掉细胞壁。材料的来源一般采用叶肉、茎尖或液体悬浮培养的细胞，在有合适的渗透稳定剂溶液中（如在高渗的蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇溶液），运用分离细胞和降解细胞壁的酶（如果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）混合处理，进行原生质体分离。第37页/共171页影响原生质体分离的因素：影响原生质体分离的因素：（1）材料来源：叶肉细胞是常用的材料，其次为愈伤组织或细胞悬浮培养物。此外,从根、茎、叶、花、果实、胚芽鞘、子叶、花粉、四分体等均能分离原生质体。（2

20、）渗透压：原生质体分离之前必须确定一个适合的渗透压。CPW溶液甘露醇或蔗糖调节，维持较高的渗透压。（3）酶 植物细胞壁结构复杂,由纤维素和半纤维素组成,需要一定的酶组成才能降解它。（4）分离培养基。钙离子、镁离子和PO43-等对原生质体的活力保持很重要，（5）培养条件酶处理时的温度和 pH 最重要。PH 缓冲剂MES，PH范围4.8-7.2（6）组织前处理 高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不同植物原生质体分离可能有较好的效果。第38页/共171页3、原生质体培养、原生质体培养 原生质体培养前必须调到一定密度，一般 103105/ml 的密度比较适合原生质体培养。原生质体

21、的培养方法各种各样，依药用植物和材料来源而异。平板培养 液体浅层培养 悬滴培养 液、固双层培养 琼脂糖包埋 看护培养等第39页/共171页影响原生质体培养的因素影响原生质体培养的因素培养基：基本培养基、生长调节剂、有机附加物等物理条件：密度、光照和温度等都会影响培养效果。低于一定密度原生质体不能分裂，一般认为大群体的原生质体有利于将培养基中原生质体在培养过程中释放的有害物质脱毒。原生质体培养一般在暗处进行，有利于壁形成和细胞再生，有的物种一直在暗处直到形成愈伤组织，有的一周后移到光下。照光与否以及什么时候照光，光强如何，均直接影响着植板率。植板率的计算公式如下：植板率=形成小愈伤块个数/接种时

22、细胞总数100%第40页/共171页4、体细胞杂交（somatic hybridization）也称原生质体融合（protoplast fusion），是在离体条件下将同一物种或不同物种的原生质体进行融合培养并获得杂种细胞的再生植株。体细胞杂交的意义：克服了植物种属间生殖障碍，为新种质的创造提供了一条有效途径。用于转移母性遗传性状，如分别由叶绿体和线粒体基因控制的不同的除草剂阿特拉津抗性和雄性不育性状等。利用非对称融合技术，将采用X-射线处理抑制核活性的雄性不育系（供体），与用碘乙酰胺处理抑制胞质活性的受体进行原生质体融合，获得具有雄性不育性状的二倍体胞质杂种，而且雄性不育性状可稳定地遗传。第

23、41页/共171页植物体细胞杂交的过程植物体细胞杂交的过程植物植物细胞细胞A A植物植物细胞细胞B B原生原生质体质体A A原生原生质体质体B B原生质原生质体融合体融合正在融合的正在融合的原生质体原生质体再生出再生出细胞壁细胞壁杂种杂种细胞细胞愈伤愈伤组织组织杂种杂种植株植株去去掉掉细细胞胞壁壁植物组织培养植物组织培养植物细胞融合植物细胞融合第42页/共171页原生质体的融合方式原生质体的融合方式 自发融合（spontaneous fusion）当酶降解细胞壁时，常常可以发现相邻的同源原生质体融合在一起形成同核体（homokaryons），即自发融合。这种自发融合的每一个同核体中可以发现有2

24、40个核。当利用正处于活跃分裂的培养细胞制备原生质体时，更容易出现这种多核融合体。诱导融合（induced fusion）两种。化学融合 电融合第43页/共171页化学融合 多采用高分子量的（1500 6000MW）2850的聚乙二醇（PEG）处理，两个不同物种的异源原生质体就会形成粘连的团聚体，然后再用高钙、高pH的溶液处理，形成异核体（heterokaryons）。电融合 主要步骤是：原生质体悬浮液在两极间施加高频交流电场（一般为0.41.5MHz，100250V/cm），使原生质体偶极化而沿电场线方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链；再用一次或多次瞬间高压直流电脉冲（一般为3

25、10s，13KV/cm）来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。第44页/共171页Potato leaves suspended in wall-dissolving enzyme solutionPotato leaves suspended in wall-dissolving enzyme solution第45页/共171页Protoplasts float to Protoplasts float to top in sugar solutiontop in sugar solutionPotato leaf protoplasts immediately after Potato l

26、eaf protoplasts immediately after digestion of cell wallsdigestion of cell walls叶肉细胞经酶解去壁获得原生质体第46页/共171页Freshly isolated potato protoplasts第47页/共171页Two protoplasts ready to fuse together第48页/共171页 Fusion products begin to divide on nutrient medium第49页/共171页 small shoots emerge from the green calli

27、第50页/共171页Putative somatic hybrid plants第51页/共171页S.bulbocastanumS.bulbocastanumSomaticSomatichybridhybridPotatoPotato第52页/共171页四、染色体工程 按照特定目标，通过对染色体操纵，来改变染色体的组成，并进而改变其遗传特性的过程叫染色体工程。通常包括倍性育种（单倍体与多倍体育种）、体细胞杂交、染色体的遗传操作（异附加系、异代换系等）以及染色体微切割、人工染色体等。此处仅就染色体微切割、人工染色体作一介绍。第53页/共171页1染色体微切割、微克隆 染色体微切割（microd

28、issection）、微克隆（microcloning）是指在显微镜下利用特种工具，对特定染色体片段进行微切割加工，并从分离相中分离出来，进行DNA体外扩增并克隆到载体中以构建特定染色体区段、特异性DNA文库的技术。该技术首先在动物及人类遗传中建立，1991年首次应用到植物中。目前已有多种植物，如番茄、柚、银杏、大豆、百合、蚕豆等的染色体显微分离、文库构建与特定序列的克隆。目标染色体分离克隆的前提是高质量的染色体制片。染色体大小、臂比、随体有无等形态特征是识别染色体的最常用的依据。端着丝粒染色体形态独特，无需分带和荧光染色即可在有丝分裂中期加以辨认，因而是理想的微切割材料，可提高分辨率、准确性

29、，也可通过分带或荧光原位杂交等技术加以鉴别。第54页/共171页微克隆方法有两种；一是酶解直接克隆法，目标染色体片段经蛋白酶裂解后提取出目标片段DNA，由于目标染色体DNA的量很少，最初的染色体微切割需切割分离大量染色体（100200条）；另一是PCR介导克隆法，PCR技术的应用大大促进了染色体微切割、微克隆技术的发展。单条染色体经内切酶消化后，在DNA片段两端加接头，接头内可包含根据克隆需要而设计的内切酶位点，并根据接头序列设计引物进行PCR扩增。扩增产物可进行微克隆、构建成染色体或染色体片段DNA文库。目前染色体微切割仍局限于构建特定染色体和特定染色体片段的DNA文库。这种文库可用来筛选目

30、标基因的候选克隆，也可以从中筛选对某个染色体区段有特异性的探针，这些探针属于同一连锁群，因而可用来构建高密度分子标记连锁图，进行YAC、BAC文库筛选。第55页/共171页2人工染色体 真核生物染色体呈线状，着丝粒、端粒和复制起始点是真核生物染色体的最基本的组成元件。1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。第56页/共171页酵母人工染色体（Yeast arti

31、ficial chromosome，YAC）YAC载体的基本组成部分：*一段来自酵母染色体的着丝粒序列（CEN）；*一段控制酵母DNA复制的自主复制序列(autonomously replicating sequence,ARS)*一对酵母的端粒序列，有的载体中（如pYAC4）来自四膜虫染色体；*选择记号；*克隆位点第57页/共171页 第一个酵母人工染色体MurrayMurray和SzostakSzostak（19831983）在大肠杆菌质粒pBR322pBR322基础上加入酵母着丝粒，ARSARS及四膜虫的核糖体RNARNA基因末端（TrTr，其结构和功能与端粒DNADNA相似）及基因，总

32、长度为10.7kb10.7kb。YACYAC是基因工程的主要载体和基因组分析的有力工具。现已构建了人、牛、猪、绵羊、小鼠、果蝇等动物以及拟南芥、玉米、番茄、大麦、甜菜、水稻和马铃薯等植物YACYAC文库。第58页/共171页第59页/共171页第60页/共171页 细菌人工染色体（BAC）细菌人工染色体是以大肠杆菌F因子为基础构建的，具有F因子遗传稳定的优点，可负载小于350kb的DNA片段。BAC的环状形式存在于E.coli中，在宿主菌中能稳定遗传，没有缺失，重组和嵌合现象，转化效率高，极大方便了目的基因筛选。目前已构建了人、牛、鼠、鸡、水稻、高粱等生物的BAC基因组文库。第61页/共171

33、页优点：能携带大片段优点：能携带大片段DNADNA，约，约300kb300kb。在每个细胞中，一个载体在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产分子能繁殖多个拷贝，高产DNADNA。缺点：会出现插入片段在结构缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆上的不稳定，导致克隆DNADNA部部分的缺失或重排。为克服上述分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，子载体，如，E coliE coli中的中的F F因因子。此质粒含有子。此质粒含有2 2种基因种基因（part A,part Bpart A,part B）。每个）。每个E coliE co

34、li能接受能接受 300kbDNA300kbDNA片片段。段。细菌人工染色体（BAC）第62页/共171页第二节 基因工程在药用植物育种中的应用 基因工程是分子遗传学和工程技术结合的产物，是现代生物技术的核心。它能按人类需要，把遗传物质DNA分子从生物体中分离出来，进行剪切、组合、拼装，合成新的DNA分子，再将新的DNA分子植入某种生物细胞中，使遗传信息在新的宿主细胞或个体中得到表达，以达到定向改造或重建新物种的目的。第63页/共171页 植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、基因遗传转化技术及植物组织培养技术的发展而兴起的生物技术。可定向改造遗传性状；打破物种间生殖隔离障碍；在药用植物

35、重要性状的遗传改良、抗逆抗病育种、品质改良与种质创新等方面发挥着日益巨大的作用。第64页/共171页转基因食品(Genetically modified foods，GMF，又称基因修饰食品或基因改良食品)，系指利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植物和微生物生产的食品和食品添加剂。GMO 是genetically modified organisms 的缩写，指通过基因工程改造的生物。常听到的几个名词第65页/共171页Crops Crops availableavailable that have been genetically that have been genetically m

36、odifiedmodifiedCornSoybeansCottonCanolaCauliflowerTomatoSugarbeetPapayaPotatoCabbageNot available for commercial productionWheatBarleyGrapesBananasPineappleCarrotsAlfalfaTobaccoSugarcaneRicePeppersOnionCelery第66页/共171页2001年转基因植物种植面积比例大豆63%油菜 5%棉花 13%玉米 19%第67页/共171页Transgenic plants were first creat

37、ed in the early 1980s by three groups working independently.Subsequent research has developed transgenic plants with commercially useful traits such as resistance to herbicides,insects,and viruses.83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02FirsttransgenicplantDelay-ripening tomatoCom

38、mercialized in the USFirstfieldtests6/92Herbicide resistant,insect resistant plants commercializedGM maize approved by EU First Bt corn plants 6/90Rotting resistant tomato approved by FDA转基因植物发展简史转基因植物发展简史第68页/共171页第69页/共171页基因工程主要步骤：（一）目的基因的获取（二）植物表达载体的构建（三）遗传转化四、转化细胞筛选及转基因植株鉴定五、外源基因整合及表达分析六、转基因作物新

39、品种选育第70页/共171页Exogenous genes(non-plant genes)Applications -transgenicpathogen-derived genesbacterial genesany other organismPathogen resistanceHerbicide resistancebioreactorsDelivery systems（一）目的基因的获取1、目的基因的来源第71页/共171页Endogenous genes(Plant genes)Gene discovery(functional genomics)Applications-mar

40、kers-transgenicEnzymes in biochemical pathwayNatural resistance genesMarker assisted breedingPlant improvementMappingESTs,librariesSilencing,expressionMutants,arrays第72页/共171页（1）化学合成（2）筛选基因组文库或cDNA文库（3）PCR方法（Polymerase Chain Reaction）（4）图位克隆（map-based cloning）与染色体步移（chromosome Walking）（5）酵母双杂交体系Two-

41、hybrid system2、目的基因的获得第73页/共171页（1）化学法直接合成基因针对已经知道序列和分子结构的基因，在实验室进行人工合成。针对已经知道序列和分子结构的基因，在实验室进行人工合成。19771977年，年，K.ItakuraK.Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。基因得到了很大的发展迅速。早期通过化学合成的部分基因早期通过化学合成的部分基因 基因人胰岛素转

42、运RNA-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素-干扰素大小（bp）12654281162453合成年代197819791981198219821984 基因视紫红质前脑菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶大小（bp）105777170385324375合成年代198519851985198519861987第74页/共171页（2）通过筛选基因组文库和cDNA文库克隆目的基因基因组DNA文库（genomic DNA library）指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片断，克隆到某种载体上而形成的集合。基因组DNADNA片断连接克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶酶切受体

43、菌第75页/共171页cDNA文库(complementary DNA library，cDNA)指生物某一发育时期或某一特定组织所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片断与某种载体连接而形成的克隆的集合。第76页/共171页从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。如菌斑杂交法(plaque hybridization)筛选噬菌体核基因库。第77页/共171页（3）通过）通过聚合酶链式反应（聚合酶链式反应

44、（PCR）方法克隆）方法克隆 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。第78页/共171页lPCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质：（1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。第79页/共171页n 聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板

45、的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链第80页/共171页聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段第81页/共171页基于PCR方法克隆目的基因的方法如：mRNA差别显示技术（DD-PCR）RT-PCRRACE分离cDNA全长TAIL-PCR代表性差异分析（cDNA RDA）抑制消减杂交法（SSH）第82页/共171页(4)图位克隆和染色体步移方法分离目的基因 染色体步移(chromosome walking)是通过逐一克隆来自染色体基因组DNA 的彼此重复的序列,而慢慢

46、的靠近目的基因开始步移的克隆可以是已知的基因、RFL Ps、RAPDs 或其它已鉴定的分子标记,用它来杂交筛选大片段DNA 文库中的阳性克隆,这样就得到了“一步”克隆,进一步的走步工作需要新的杂交探针,利用新获得的探针对文库进行第二次杂交,得到了与探针具重复序列的阳性克隆,称为“二步”克隆,理论上讲,这就向前步查了两步。远距离的目的基因通过这样周而复始的查步而获得。第83页/共171页第84页/共171页第85页/共171页（5）通过酵母双杂交方法克隆目的基因酵母双杂交技术的基本原理第86页/共171页（二）植物表达载体的构建 在植物基因转化过程中，已建立了多种转化系统，如载体转化系统，原生质

47、体转化系统，DNA直接导入转化系统，基因枪导入转化系统，花粉管介导转化系统等，但载体转化系统是目前使用最多、技术最成熟、成功实例最多的一种转化系统，也是植物基因工程最重要的一种转化系统，因此所谓植物基因工程载体主要是指这一类载体，它具体包括Ti质粒转化载体、Ri质粒转化载体及病毒转化载体，其中Ti质粒转化载体是最主要的。第87页/共171页cause Crown gall diseaseA natural DNA delivery systemAgrobacterium tumefaciens第88页/共171页Agrobacterium is a natural genetic engine

48、eri.e.it transfers some of its DNA to plants A plant pathogen found in nature Infects many plant species Delivers DNA that encodes for plant hormones DNA incorporates into plant chromosome Hormone genes expressed and galls form at infection site第89页/共171页1.Auxin,cytokinin,opine synthetic genes trans

49、ferred to plant2.Plant makes all 3 compounds3.Auxins and cytokines cause gall formation4.Opines provide unique carbon/nitrogen source only A.tumefaciens can use!天然Ti质粒的主要功能基因：第90页/共171页用于天然的Ti质粒必须要进行改造，才能用于基因工程，有几个重要问题必须解决：(1)Ti 质粒太大，很难进行分子生物学操作；(2)在大肠杆菌中要易于操作；(3)转化植物后，能够易于筛选，不能有致瘤性；(4)单一的限制性内切酶位点，以

50、便外源基因的插入T-DNA中。第91页/共171页天然Ti质粒和工程改造Ti质粒的差异包括选择标记基因、报告基因和目的基因第92页/共171页一些常见的遗传选择标记和报告基因（Reporter Genes/Selectable Markers）Neomycin Phosphotransferase gene(nptII)抗卡那霉素Hygromycin(hpt)抗潮霉素Phosphinothricin(bar)抗除草剂GUS-glucuronidase enzyme which converts colorless substrate to blue product 葡萄糖苷酸酶基因Lucife