第15章蛋白质的生物合成.pptx

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1、目的要求1.理解蛋白质合成的信息来源，三种RNA在蛋白质合成中的作用2.掌握遗传密码的几个重要特性3.了解核糖体的结构、掌握氨酰-tRNA合成酶的作用机理4.了解蛋白质的合成过程5.了解多肽链的折叠与加工过程第1页/共77页q蛋白质生物合成是指生物体内遗传信息的翻译过程。q翻译（translation）：mRNA分子中的遗传信息转变为蛋白质的氨基酸排列顺序。第2页/共77页蛋白质的生物合成体系 q原料：20种氨基酸q模板：mRNAq场所：核蛋白体q氨基酸的“搬运工具”：tRNAq酶与蛋白质因子：启动、延长、终止因子q能量：ATP、GTP第3页/共77页15.1遗传密码Geneticcode密码

2、子：是mRNA上连续排列的三个核苷酸序列，并编码一个氨基酸信息的遗传单位。第4页/共77页体外翻译系统的建立核酸的人工合成核糖体结合技术一、密码子的破译：第5页/共77页1.同聚核苷酸MarshallNirenberg等建立了大肠杆菌无细胞翻译系统无细胞抽取物核糖体各种tRNA氨基酸AARSATP,GTP+mRNA=蛋白质Poly(U)poly(Phe)peptidePoly(C)poly(Pro)peptidePoly(A)poly(Lys)peptidePoly(G)poly(Gly)peptide第6页/共77页2.其他密码子的破译核糖体结合技术是建立在两个基本的事实上：一是人工合成的三

3、聚核苷酸可以作为模板；二是在无GTP时，三聚核苷酸可以促进同源的氨酰-tRNA结合在核糖体上，而不生成蛋白质。利用由核糖体和三聚核苷酸及其同源的氨酰-tRNA形成的三元复合物能被硝酸纤维素滤膜吸附的性质，可将结合的氨酰-tRNA与其它没有结合的氨酰-tRNA分开。通过分析结合在硝酸纤维素滤膜上的氨酰-tRNA上氨基酸的性质和原来的三聚核苷酸序列可以弄清某种氨基酸的密码子。第7页/共77页体外实验体外实验tRNAaaRibosome硝酸纤维膜过滤硝酸纤维膜过滤UUU(三联密码三联密码)Ser-C14,Leu,Lys,Arg,Ser,Leu-C14,Lys,Arg,Ser,Leu,Lys-C14,

4、Arg,第8页/共77页Ser-C14.Leu-C14.Lys-C14.Gly-C14.第9页/共77页 三联体密码子第10页/共77页二、密码子的主要特性1.通用性与变异性原核和真核生物的密码子近乎完全通用。但线粒体DNA中密码子有例外，如线粒体中AUA编码Met而不是Ile。古细菌中发现UGA编码天然的吡咯赖氨酸。第11页/共77页2.简并性一种氨基酸可由几种密码子编码的现象称之为简并性。大多数a.a有几组不同的密码子，Trp及Met只有一个密码子。简并性可以减少有害的突变。第12页/共77页3.摇摆性（wobble）：专一性主要由前二位碱基决定。第三位碱基具有摇摆性（Wobble Hyp

5、othesis）。mRNA密码子的第三个核苷酸（3端）与tRNA反密码子第一个核苷酸（5端）配对时，有时不遵守严格的碱基配对原则，除A-U、G-C外，还可有其它配对方式。I是最常见的摆动现象。第13页/共77页反密码子第反密码子第一个碱基一个碱基密码子第三密码子第三个碱基个碱基ACGUIUGC、UA、GA、C、U第14页/共77页4.遗传密码一般不重叠绝大多数生物的基因是不重叠的，但是少数病毒基因可能重叠，同一段核苷酸序列可以编码一个以上的蛋白质。噬菌体X174的基因组中，部分基因的遗传密码重叠。第15页/共77页5.密码子是连续的，没有逗号读码框如果移码会导致移码突变或缺失突变。各密码子之间

6、没有分隔信号第16页/共77页15.2蛋白质生物合成的主要部件一、mRNA作为指导肽链合成的模板从mRNA 5 端起始密码子AUG到3 端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框（open reading frame,ORF）。AUGUAAORF第17页/共77页原核生物的多顺反子原核生物的多顺反子真核生物的单顺反子真核生物的单顺反子非编码序列核蛋白体结合位点起始密码子终止密码子编码序列PPP5 3 蛋白质PPPmG-5 3 蛋白质第18页/共77页mRNA的起始密码子AUG上游8-13个核苷酸以外有一段5-UAAGGAGG-3的保守核苷酸序列,称

7、为SD序列(Shine-Dalgarno Sequence).SD序列是mRNA和核糖体识别、结合的位点。它能够与细菌核糖体小亚基16SrRNA的3-AUUCCUCC-5保守序列反向互补,从而使核糖体借此判定mRNA的翻译起始位点.原核生物原核生物mRNA结构结构第19页/共77页真核生物的mRNA没有SD序列,核糖体小亚基识别5端帽子结构，随后移动到起始密码子处。起始密码子常处于-CCACCAUGG-序列中,这段保守序列的存在能增加翻译起始的效率,这段序列称为Kozak序列.真核生物真核生物mRNA结构结构第20页/共77页二、tRNA在蛋白质合成中的作用 tRNA分子有二个功能:A.专一性

8、地结合氨基酸，生成氨酰-tRNA，使氨基酸活化。B.识别氨基酸密码子，依靠核糖体的特定位点对mRNA的密码子进行识别。第21页/共77页每一个细菌细胞内约有60种不同tRNA（至少有31-32种），真核细胞内可达100-120种。同一种氨基酸能够连接到多种tRNA上，这一组能运载同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。第22页/共77页根据tRNA的功能，大致分为三类：1)起始tRNA:fMet-tRNAfMet 和 Met-tRNAiMet2)延伸tRNA3)校正tRNA tRNASu3+Tyr反密码子为CUA，能识别变异产生的终止密码子UAG。第23页/共77页三、氨酰-tRNA合成酶氨基

9、酸在掺入肽链前，必须活化生成氨酰-tRNA，获得足够的能量。活化反应由各种氨酰-tRNA合成酶（AARS）催化。氨基酸氨基酸+tRNA氨基酰氨基酰-tRNAATP AMPPPi氨基酰氨基酰-tRNA合成酶合成酶.氨酰tRNA第24页/共77页B.氨酰-tRNA合成酶特点特点a、专一性：、专一性：对对氨氨基基酸酸有有极极高高的的专专一一性性，每每种种氨氨基基酸酸都都有有专专一一的的酶酶，只只作作用用于于L-氨氨基基酸酸，不不作作用用于于D-氨基酸。氨基酸。对对tRNA具具有有极极高高专专一一性性：一一种种AARS只只能能识识别别装装载载同同一一种种氨氨基基酸酸的的一一组组同同工工受受体体（tRN

10、A分子）分子）第25页/共77页b、校对作用：、校对作用：AARS具有具有底物结合位点底物结合位点（包括（包括tRNA、氨基酸和氨基酸和ATP结合位点）和结合位点）和水解位点水解位点。氨酰氨酰-tRNA合成酶的水解部位可以水解合成酶的水解部位可以水解错误活化的氨基酸。错误活化的氨基酸。第26页/共77页第27页/共77页第28页/共77页图氨酰-tRNA第29页/共77页AARS对特定tRNA的准确识别与结合是确保被活化氨基酸能准备负载的前提。这种专一性是依赖AARS对副密码子的识别而实现的。副密码子(Paracodon)：tRNA中与AARS的“tRNA结合位点”发生特异性分子契合的一种空间

11、密码。paracodon位于tRNA 的各种环或臂上不同tRNA 的 paracodon 的定位不同第30页/共77页第31页/共77页 原核细胞约2000个，真细胞106-107个。核糖体是一个大的核糖核蛋白体，由大亚基和小亚基组成，是蛋白质合成场所。1.E.coli.核糖体结构 70S:30S and 50S subunit 30S:16s rRNA and proteins（S1-S21）50S:5s rRNA，23S rRNA and protein（34）在16S rRNA的3端有一段富含嘧啶的序列，可以识别、结合mRNA的S.D序列。四、核糖体作为蛋白质合成的工厂第32页/共77页

12、2.真核生物核糖体结构 80S:40Sand60Ssubunit40S:18SrRNAandproteins（30）60S:5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA andproteins（50）3.核糖体结构模型50S亚基上有两个tRNA位点：氨酰基位点（A）和肽酰基位点（P）。50S与30S接触面上有一个mRNA结合位点。第33页/共77页4.多核糖体在一个mRNA上有多个核糖体，它们能分别合成一条完整的肽链。可提高蛋白质合成的效率。第34页/共77页第35页/共77页五、参与蛋白质合成的可溶性因子蛋白质的合成还必须有可溶性因子：起始因子、延伸因子、释放（终止）因子等参与才能合成多肽

13、链。第36页/共77页第37页/共77页第38页/共77页15.3蛋白质合成机制蛋白质合成通过核糖体正确阅读mRNA密码逐个引入氨基酸合成多肽链的过程；多肽链从N端向C端方向延伸合成；蛋白质的合成可分为三个阶段：起始、延伸和终止。第39页/共77页细 胞 中 有 两 种 携 带 Met的 tRNA：tRNAf和tRNAm起始氨基酸：N-甲酰甲硫氨酰-tRNA(fMet-tRNAf)15.3.1原核生物蛋白质的合成一、蛋白质合成起始第40页/共77页IF-1帮助帮助IF-3的结合的结合IF-2促使促使fMet-tRNAfmet结合在结合在30S亚基上亚基上IF-3具有具有解离解离30S与与50S

14、亚基亚基的活性的活性促使促使fMet-tRNAfmet-30S亚基复合体亚基复合体结合于结合于mRNA起始部位起始部位原核生物的起始因子：原核生物的起始因子：第41页/共77页IF-3IF-11.核蛋白体大小亚基分离核蛋白体大小亚基分离目录IF-1和IF-3与小亚基结合，促进核蛋白体大、小亚基拆离，为新一轮合成作准备。第42页/共77页A U G53IF-3IF-12.mRNA在小亚基定位结合在小亚基定位结合目录原核mRNA的起始部位由一段富含嘌呤的特殊核苷酸顺序组成，称为SD序列（核蛋白体结合位点，RBS）。而原核16SrRNA存在一段富含嘧啶的序列，二者之间可通过碱基配对，使mRNA与核蛋

15、白体小亚基结合。第43页/共77页IF-3IF-1IF-2GTP3.起始氨基酰起始氨基酰tRNA(fMet-tRNAfmet)结合到结合到小亚基小亚基A U G53目录起始fMet-tRNAfmet以及IF2-GTP一起，识别结合小亚基P位，并对应模板mRNA的起始密码AUG。第44页/共77页IF-3IF-1IF-2GTPGDPPi4.核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成A U G53目录IF2结合的GTP被水解，三种IF脱离，50S大亚基与30S小亚基、模板mRNA以及起始fMet-tRNAfMet构成起始复合体。第45页/共77页IF-3IF-1A U G

16、53IF-2GTPIF-2-GTPGDPPi目录第46页/共77页第47页/共77页肽链延伸指起始后第二个和以后密码子编码的氨基酸连接上去形成肽链的过程。包括：氨酰-tRNA与核糖体结合，转肽与肽键形成和转位三个步骤。二、肽链的延伸第48页/共77页原核延长原核延长因子因子生物功能生物功能对应真核延对应真核延长因子长因子EF-Tu结合氨酰结合氨酰tRNA和和GTP(热不热不稳定型稳定型）eEF-1EF-TsEF-Tu/GTP再生（再生（热稳定型热稳定型）eEF-1-EF-G有转位酶活性，促进有转位酶活性，促进mRNA-肽酰肽酰-tRNA由由A位前位前移到移到P位，促进卸载位，促进卸载tRNA释

17、释放放（转位因子）（转位因子）EF-2肽链合成的延长因子第49页/共77页Tu TsGTPGDPA U G53TuTsGTP目录（一）进位第50页/共77页延长因子EF-T催化进位（原核生物）Ts移走移走GDP，并与，并与Tu结合生成结合生成Tu-Ts复复合体，然后合体，然后GTP替换替换Ts，生成有活性的，生成有活性的Tu-GTP第51页/共77页（二）成肽A、P位的氨基酸形成肽键transpeptidasePAPAP位上tRNAimet所携带的甲酰甲硫氨酰（fmet）转移到A位，与A位上的氨基酸形成肽键P位上无负载的tRNA生成的二肽酰-tRNA在A位第52页/共77页（三）转位由转位酶（

18、translocase；活性存在于EF-G）催化，核蛋白体向mRNA的3端移动相当于一个密码子的距离，原有带肽链的tRNA由A位转移至P位,mRNA分子第三个密码子定位于A位，空着的A位等待接受下一个氨基酰-tRNAPAPA1 22 3 第53页/共77页fMetA U G53fMetTuGTP目录第54页/共77页进位转位成肽*肽链延伸方向：N端C端第55页/共77页进位进位进位进位TuTsGTP是指根据是指根据mRNA下一组遗传密码指导，使氨基酰下一组遗传密码指导，使氨基酰tRNA进入核蛋白体进入核蛋白体A位位第56页/共77页fMetGTPTuGDPTsGTPfMetfMet第57页/共

19、77页E位fMetfMet成肽成肽成肽成肽是转肽酶催化的是转肽酶催化的 肽键形成的过程肽键形成的过程第58页/共77页E位fMetfMet转位转位转位转位在转位酶的作用下，促进核蛋白体向在转位酶的作用下，促进核蛋白体向mRNA的的3测移动，使肽酰测移动，使肽酰tRNA和和mRNA相对位移进入核蛋白体相对位移进入核蛋白体P位，而卸载的位，而卸载的tRNA进入进入E位位第59页/共77页E位fMetfMetAA3AA3TuGTP转位转位转位转位第60页/共77页原核生物释放因子：原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3识识别别终终止止密密码码，如如RF-1特特异异识识别别UAA、UAG；而；

20、而RF-2可识别可识别UAA、UGA；RF-3促促进进RF-1和和RF-2在在完完成成翻翻译译终终止止，释释放肽链后从核糖体中解离出来放肽链后从核糖体中解离出来三、多肽链翻译的终止第61页/共77页(a)RF-1containsthetripeptidePro-Ala-Thr.Thefirstaa,Pro,caninteractwiththeringhydrogenofA,butnottheaminogroupofG,whereasthethirdaa,Thr,caninteractwitheitherAorG.Thus,thistripeptideallowsRF-1tobindtoUAG(

21、orUAA),butnottoUGA.(b)RF-2containsthetripeptideSer-Pro-Phe.Thefirstaa,Ser,likeThr,caninteractwitheitherAorG.Butthethirdaa,Phe,caninteractwiththeringhydrogenofA,butnottheaminogroupofG.Thus,thistripeptideallowsRF-2tobindtoUGA(orUAA),butnottoUAG.(Source:ReprintedfromNakamuraetal.,Cell101:349,2000.Roleo

22、fthetripeptidedeterminantinRF-1andRF-2inrecognizingstopcodons.RecognizingUAA/UAGRecognizingUAA/UGAAA第62页/共77页肽链合成的肽链合成的终止及释放终止及释放（1 1）释放因子RFRF1 1或RFRF2 2进入核糖体A A位。（2 2）多肽链的释放（3 3）70S70S核糖体解离 核糖体释放因子RRFRRF5 5 3 3 UAGUAG30S30S亚基亚基亚基亚基50S50S亚基亚基亚基亚基5 5 3 3 UAGUAGtRNARFRF第63页/共77页U A G53RFCOO-第64页/共77页1

23、.核糖体不同真核80S，原核70S。2.起始tRNA不同真核：Met-tRNAi甲硫氨酸原核：fMet-tRNAf甲酰甲硫氨酸3.起始密码子真核AUG，原核AUG（有时GUG）。4.起始因子真核eIF，起始因子比较多15.3.2真核生物蛋白质的合成第65页/共77页第一步：装配前起始复合物，包括40s核糖体、elF-2-Met-tRNAiMet-GTP复合体和elF-1、elF-1A和elF-3 共3个起始因子第二步：前起始复合物与mRNA 的5端结合形成起始复合物（需帽子复合物帮助，包括elF-4A、elF-4E、elF-4G三种起始因子）随后起始复合物沿着mRNA分子向3端扫描，寻找起始密

24、码子AUGKozak序列：序列：ACCAUGG，也称为，也称为“-3A，+4G”序序列列真核生物蛋白合成起始第66页/共77页40S起始复合物与AUG结合后，60S大亚基就结合，形成80S复合体elF-5因子帮助大亚基结合，并释放其他因子第67页/共77页PolyPoly（A A）会影响）会影响mRNAmRNA与前起始复合物的结合与前起始复合物的结合PABP PABP 多腺苷结合蛋白多腺苷结合蛋白帽子结构和帽子结构和polypoly（A A）尾一起作）尾一起作用用第68页/共77页 1.嘌呤霉素嘌呤霉素是酪氨酰是酪氨酰-tRNA的结构类的结构类似物，能结合在核糖体的似物，能结合在核糖体的A位上

25、，抑制位上，抑制AA-tRNA的进入。它所带的氨基与的进入。它所带的氨基与AA-tRNA上的氨基一样，能与生长中肽链上上的氨基一样，能与生长中肽链上的羧基生成肽键，这个反应的产物是一条的羧基生成肽键，这个反应的产物是一条3羧基端挂了一嘌呤霉素。羧基端挂了一嘌呤霉素。15.3.3蛋白质生物合成的阻断剂第69页/共77页2.链霉素（新霉素、卡那霉素）抑制原核生物蛋白质的起始合成；容易导致错读。链霉素在高浓度下干扰fMet-tRNA与核糖体小亚基结合，主要是影响30S小亚基上的S12蛋白质，从而抑制蛋白质合成的正确起始。在低浓度下，引起mRNA读码错误。例如，以polyU为模板，加入链霉素后除Phe

26、外，Ile也能掺入多肽链。第70页/共77页3.四环素类四环素、土霉素、金霉素均属于四环素类，可与30S小亚基结合，阻碍氨酰-tRNA与30S小亚基和mRNA结合。4.氯霉素与细菌50S亚基结合，通过阻断肽酰基的转移来抑制细菌蛋白质的合成。这类抗生素也可抑制真核生物线粒体内蛋白质的过程，因此对人有毒性。第71页/共77页四四环环素素族族氯霉素氯霉素链霉素和卡那霉素链霉素和卡那霉素嘌呤霉素嘌呤霉素第72页/共77页3553Transcription And Translation In ProkaryotesRibosomeRibosome5mRNARNAPol.第73页/共77页Cytopla

27、smGAAAAAAExportEukaryotic Gene ExpressionGAAAAAARNAProcessingmRNARNATranscriptionDNANucleusNuclear poresRibosomeTranslationPackagingModificationTransportation第74页/共77页分子伴侣（molecular chaperon）；蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）；肽基脯氨酰顺反异构酶（peptide prolyl cis-trans isomerase,PPI）。细胞内蛋白质正确折叠的保障机制第75页/共77页第76页/共77页感谢您的观看！第77页/共77页