抗肿瘤药物的筛选方法精选PPT.ppt

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1、关于抗肿瘤药物的筛选方法第1页，讲稿共105张，创作于星期二一、导论一、导论二、整体动物水平的筛选二、整体动物水平的筛选三、细胞水平的筛选三、细胞水平的筛选四、酶水平的筛选四、酶水平的筛选五、展望五、展望第2页，讲稿共105张，创作于星期二一、导论一、导论 1.肿瘤发病率和死亡率肿瘤发病率和死亡率 全球每年癌症新全球每年癌症新发病例都在发病例都在1200万万以以上，因癌症死亡人数上，因癌症死亡人数达达760多万多万，到，到2010年底全球肿瘤病人总年底全球肿瘤病人总数已逾数已逾5500万万人人(WHO)。心脏病心脏病脑血管病脑血管病肿瘤肿瘤25%消化系统病消化系统病肺病肺病其他其他第3页，讲稿

2、共105张，创作于星期二中国每年新增肿瘤病人中国每年新增肿瘤病人200万万人，死亡人，死亡130-170多万多万人左右，目前全国肿瘤患者人左右，目前全国肿瘤患者总数约总数约450万万人，并以每年人，并以每年3%的速度递增。肿瘤已的速度递增。肿瘤已经成为中国公民的头号杀经成为中国公民的头号杀手，每年因恶性肿瘤而死手，每年因恶性肿瘤而死亡的人口占到总死亡率的亡的人口占到总死亡率的22%。2009年中国居民主要疾病死亡率及死亡原因构成年中国居民主要疾病死亡率及死亡原因构成死亡原因死亡原因死亡率死亡率(1/10(1/10万万)占总死亡占总死亡人数百分率人数百分率恶性肿瘤恶性肿瘤13522%脑血管病脑血

3、管病111 20%心脏病心脏病9618%呼吸系统病呼吸系统病7215%损伤和中毒损伤和中毒315%消化系统病消化系统病175%糖尿病糖尿病171%(中国卫生年鉴中国卫生年鉴)第4页，讲稿共105张，创作于星期二9年中国常见恶性肿瘤的死亡率年中国常见恶性肿瘤的死亡率 我国居民常见我国居民常见癌症死亡率癌症死亡率:胃癌胃癌列肿瘤死列肿瘤死亡率首位亡率首位;其次肝癌、其次肝癌、肺肺癌癌、食管癌、食管癌、结直肠癌等。结直肠癌等。第5页，讲稿共105张，创作于星期二2.肿瘤的治疗方法肿瘤的治疗方法外科手术治疗外科手术治疗放射线治疗放射线治疗化学药物治疗化学药物治疗第6页，讲稿共105张，创作于星期二3.

4、常用的化疗药物常用的化疗药物v烷化剂烷化剂 环磷酰胺、异环磷酰胺环磷酰胺、异环磷酰胺v抗代谢药物抗代谢药物 甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷v抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素 柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素、多柔比星柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素、多柔比星v铂类化合物铂类化合物 顺铂、卡铂、奥沙利铂顺铂、卡铂、奥沙利铂v抗肿瘤植物药抗肿瘤植物药 长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇v激素类激素类 v血管新生抑制剂血管新生抑制剂 贝伐珠单抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼贝伐珠单抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼 第7页，讲稿共105张，创作于星期二化疗药物的主要

5、不良反应化疗药物的主要不良反应骨髓抑制骨髓抑制（血细胞减少）（血细胞减少）胃肠道反应胃肠道反应（恶心、呕吐、食欲不振等）（恶心、呕吐、食欲不振等）全身反应全身反应（脱发、发热、皮疹）（脱发、发热、皮疹）对各器官影响对各器官影响（心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性）心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性）泌尿道毒性泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性肾病）（血尿、蛋白尿、尿酸性肾病）局部静脉炎局部静脉炎致畸、致突变、致癌致畸、致突变、致癌第8页，讲稿共105张，创作于星期二4.天然产物与抗肿瘤药物天然产物与抗肿瘤药物 v天然产物在新药及新药先导化合物的发现中起着不可替代天然产物在新药及新药先导化合物的发现中起着不可

6、替代的作用，是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来的作用，是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。源。v美国国立癌症研究所（美国国立癌症研究所（NCI）从从1955年开始从天然产物中年开始从天然产物中筛选抗肿瘤药物。筛选抗肿瘤药物。v目前世界上被批准广泛使用的抗肿瘤药物中目前世界上被批准广泛使用的抗肿瘤药物中,以以上来源于天然产物。上来源于天然产物。第9页，讲稿共105张，创作于星期二二、整体动物水平的筛选二、整体动物水平的筛选 非实体瘤动物模型非实体瘤动物模型肿瘤名称肿瘤名称代号代号宿主宿主肿瘤名称肿瘤名称代号代号宿主宿主艾氏艾氏腹水瘤腹水瘤ECAKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤肉瘤腹

7、水型腹水型S180AKM小鼠BALB/c小鼠肝癌肝癌腹水瘤腹水瘤HepAKM小鼠BALB/c小鼠白血病白血病L1210DBA小鼠白血病白血病P388KM小鼠BALB/c小鼠白血病白血病P615615小鼠常用小鼠腹水瘤动物模型表（细胞株及动物）常用小鼠腹水瘤动物模型表（细胞株及动物）国内外推荐模型国内外推荐模型第10页，讲稿共105张，创作于星期二 肿瘤移植方法：肿瘤移植方法：1）无菌操作）无菌操作 2）接种部位：腹腔）接种部位：腹腔 3）癌细胞悬液的制备及接种）癌细胞悬液的制备及接种 接种710天小鼠处死，酒精消毒，穿过腹 部肌肉吸取腹水24 mL*，置冰块上保存。细胞计数后，PBS稀释制备1

8、x107/0.1 mL细胞浓度悬液，每只小鼠注射0.2 mL 肿瘤细胞悬液注射到腹腔。5天左右，小鼠出现腹水即为造模成功。*腹水应为白色浓稠液体，若为黄色或红色应弃去腹水应为白色浓稠液体，若为黄色或红色应弃去第11页，讲稿共105张，创作于星期二给药及药效评价：给药及药效评价：动物分组：动物分组：随机分五组（溶剂对照组、阳性药组、高、中、低随机分五组（溶剂对照组、阳性药组、高、中、低 给药组）；每组给药组）；每组8-10只。只。药品制备：药品制备：药品溶解生理盐水或药品溶解生理盐水或PBS等缓冲盐溶液等缓冲盐溶液给药方式：给药方式：连续给药；连续给药；1-2次次/天天;（ig,ip,iv）14

9、天以上天以上评价指标：评价指标：观察记录荷瘤小鼠的存活天数（观察记录荷瘤小鼠的存活天数（30天）天）（7天死亡率天死亡率20%20%或或20%20%动物存活超过动物存活超过4 4周，实验失败周，实验失败 对照组存活时间对照组存活时间14-2014-20天）天）数据处理：数据处理：生命延长率生命延长率(%)治疗组存活天数对照组存活天数 对照组存活天数 非腹腔给药生命延长率非腹腔给药生命延长率50%腹腔给药腹腔给药75%x100%第12页，讲稿共105张，创作于星期二.实体瘤动物模型实体瘤动物模型1）动物移植性肿瘤）动物移植性肿瘤肿瘤名称肿瘤名称代号代号宿主宿主肿瘤名称肿瘤名称代号代号宿主宿主艾氏

10、癌艾氏癌实体型实体型ECSKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤肉瘤S180KM小鼠BALB/c小鼠肝癌肝癌实体型实体型HepSKM小鼠BALB/c小鼠黑色素瘤黑色素瘤B16C57BL/6小鼠BALB/c小鼠肺癌肺癌LewisC57BL/6小鼠BALB/c小鼠结肠癌结肠癌C26BALB/c小鼠瓦克癌瓦克癌肉瘤肉瘤W256Wistar大鼠结肠癌结肠癌C38BALB/c小鼠常用小鼠、大鼠实体瘤动物模型表（细胞株及动物）常用小鼠、大鼠实体瘤动物模型表（细胞株及动物）国内外推荐模型国内外推荐模型第13页，讲稿共105张，创作于星期二 肿瘤移植方法：肿瘤移植方法：1）无菌操作）无菌操作 2）接种部位：）接种部位：

11、右前肢腋下 3）癌块的制备及接种）癌块的制备及接种 接种710天小鼠处死，酒精消毒，切开皮肤取出肿瘤块，置于生理盐水中，冰块上保存。剪碎瘤块成2-3 mm3的小块或组织块匀浆成细胞悬液，接种到右前肢腋下。5天左右，小鼠出现瘤块即为造模成功。7天后对照组天后对照组20%小鼠肿瘤小于小鼠肿瘤小于400 mg或大于或大于2g，实验失败，实验失败 第14页，讲稿共105张，创作于星期二给药及药效评价：给药及药效评价：给药方式：给药方式：连续给药；连续给药；1-2次次/天天;（ig,ip,iv）10-12天天评价指标：评价指标：记录小鼠的体重变化。记录小鼠的体重变化。12天后，处死小天后，处死小 鼠，拨

12、瘤称重（对照组瘤重鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1 g左右）。左右）。取脾脏和胸腺称重，并测定脾细胞数目取脾脏和胸腺称重，并测定脾细胞数目数据处理：数据处理：抑瘤率抑瘤率(%)对照组瘤重治疗组瘤重 对照组瘤重 抑瘤率抑瘤率30%认为有效认为有效x100%第15页，讲稿共105张，创作于星期二）人癌异种移植模型）人癌异种移植模型细胞：细胞：人源肝癌，胃癌，肺癌，结肠癌等肿瘤细胞人源肝癌，胃癌，肺癌，结肠癌等肿瘤细胞动物：动物：裸鼠裸鼠（nude mice）特点：特点：1）裸体，行似无毛；）裸体，行似无毛；2）不能执行正常）不能执行正常T细胞功能，免疫力低下细胞功能，免疫力低下 3）B细胞功能正常，细胞

13、功能正常，NK细胞活性高细胞活性高T淋巴功能缺陷淋巴功能缺陷先天性无胸腺小鼠先天性无胸腺小鼠 11号染色体上隐性号染色体上隐性 突变裸基因（突变裸基因（nu）第16页，讲稿共105张，创作于星期二 肿瘤移植和给药方法：肿瘤移植和给药方法：1）无菌操作）无菌操作 2）接种部位：背部）接种部位：背部 3）细胞悬液的制备及接种）细胞悬液的制备及接种 细胞悬液浓度细胞悬液浓度1x108/mL，接种，接种0.1mL到背部。到背部。7天左右，瘤天左右，瘤块达到块达到50 mm3体积即为造模成功，开始给药体积即为造模成功，开始给药。4）给药时间：）给药时间：根据药效确定，一般根据药效确定，一般12-60天。

14、天。第17页，讲稿共105张，创作于星期二阳性药阳性药 5-Fu（5-氟尿嘧啶）氟尿嘧啶）ADM（阿霉素）（阿霉素）Taxol（紫杉醇）（紫杉醇）CTX（环磷酰胺）（环磷酰胺）选择性对照药选择性对照药推荐剂量：推荐剂量：1-20 mg/kg给药方式：给药方式：与测试药物相同与测试药物相同;常隔天给药常隔天给药 第18页，讲稿共105张，创作于星期二药效评价：药效评价：评价指标：评价指标：记录小鼠的体重变化。结束治疗后，处记录小鼠的体重变化。结束治疗后，处 死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1 g左左 右）。取脾脏称重，并测定脾细右）。取脾脏称重，并测定脾细 胞数目。胞数目

15、。数据处理：数据处理：抑瘤率抑瘤率(%)对照组对照组肿瘤体积治疗组肿瘤体积肿瘤体积治疗组肿瘤体积 对照组肿瘤体积对照组肿瘤体积 抑瘤率抑瘤率30%认为有效认为有效x100%第19页，讲稿共105张，创作于星期二抗肿瘤谱抗肿瘤谱v Taxol （卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、淋（卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、淋巴瘤）巴瘤）v 5-Fu （乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、膀胱（乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤）癌、前列腺癌和头颈部肿瘤）v ADM （乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮肤癌）乳腺癌、胰腺癌、肝癌、

16、肺癌、淋巴瘤和皮肤癌）第20页，讲稿共105张，创作于星期二沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用 (Carcinogenesis,2013,34:1331)第21页，讲稿共105张，创作于星期二三、细胞水平的筛选三、细胞水平的筛选1.抑制肿瘤细胞增殖实验抑制肿瘤细胞增殖实验2.诱导肿瘤细胞分化实验诱导肿瘤细胞分化实验3.诱导肿瘤细胞凋亡实验诱导肿瘤细胞凋亡实验4.抗肿瘤血管生成实验抗肿瘤血管生成实验5.肿瘤多药耐药性逆转实验肿瘤多药耐药性逆转实验6.抗肿瘤侵袭和转移实验抗肿瘤侵袭和转移实验7.诱导肿瘤细胞自噬实验诱导肿瘤细胞自噬实验第22页，讲稿共105张，创作于星期二细胞株的选择

17、细胞株的选择第23页，讲稿共105张，创作于星期二.抑制肿瘤细胞增殖实验抑制肿瘤细胞增殖实验A)噻唑兰实验（噻唑兰实验（MTT）原理：原理：活细胞活细胞线粒体中脱氢酶线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的能够代谢还原黄色的MTT，生成蓝紫，生成蓝紫色不溶于水的色不溶于水的甲臜甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶标仪在）。甲臜的多少可以用酶标仪在570 nm 处进行测定。甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根处进行测定。甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度据光密度OD值推测出活细胞的数目。值推测出活细胞的数目。第24页，讲稿共105张，创作于星期二MTT 原理示意图原理示意图甲臜生成量正

18、比于活细胞数甲臜生成量正比于活细胞数采用比色法（采用比色法（570 nm）测定甲臜生成量）测定甲臜生成量第25页，讲稿共105张，创作于星期二实验方法实验方法1）细胞培养）细胞培养 培养液：培养液：RPMI 1640、DMEM、MEM、M199、McCoys5A等 血清血清：FBS、NBS、抗生素抗生素：青霉素、链霉素、庆大霉素、新生霉素等 胰酶胰酶：Trypsin-EDTA、Collagenase 缓冲液缓冲液：PBS、HBSS等 生长因子生长因子：EGF、B-27、N-2等第26页，讲稿共105张，创作于星期二 2）细胞传代）细胞传代 贴壁细胞生长贴壁细胞生长3-5天，天，80%融合度。用

19、胰酶消化融合度。用胰酶消化1-3 min后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养液中。后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养液中。3）细胞计数）细胞计数 细胞计数板细胞计数板第27页，讲稿共105张，创作于星期二 5）细胞接种）细胞接种 3000-10000细胞接种在细胞接种在96孔板，贴壁孔板，贴壁 24小时，或对数生长期小时，或对数生长期 6）加药处理）加药处理72 h（指定时间点）（指定时间点）7）MTT溶液（溶液（5 mg/ml），孵育，孵育2-4小时小时 8）弃去培养液，加入）弃去培养液，加入DMSO溶解生成的溶解生成的 甲臜甲臜 9）酶标仪测定）酶标仪测定OD值值 第28页，讲稿共105

20、张，创作于星期二结果处理：结果处理：肿瘤细胞生长肿瘤细胞生长抑制率（抑制率（%）=（OD对照对照-OD实验实验）OD对照对照X 100%根据生长抑制的量效曲线求出根据生长抑制的量效曲线求出IC50 值值肿瘤细胞存活率（肿瘤细胞存活率（%）=OD实验实验OD对照对照X 100%第29页，讲稿共105张，创作于星期二AB问题：问题：根据上图中细胞生长抑制曲线，根据上图中细胞生长抑制曲线，判断化合物判断化合物A和和B哪一个具有较好的哪一个具有较好的 肿瘤生长抑制作用？肿瘤生长抑制作用？第30页，讲稿共105张，创作于星期二）磺酰罗丹明）磺酰罗丹明B（SRB）实验）实验原理：原理：SRB是是粉红色的氨

21、基甲氧杂蒽类化合物粉红色的氨基甲氧杂蒽类化合物，是蛋白结合，是蛋白结合染料，与蛋白质的碱性氨基酸结合后呈粉红色，用酶标仪染料，与蛋白质的碱性氨基酸结合后呈粉红色，用酶标仪测定其吸光度。测定其吸光度。细胞中的蛋白含量与吸光度成正比，因此可根据光密度细胞中的蛋白含量与吸光度成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目和活性。值推测出活细胞的数目和活性。第31页，讲稿共105张，创作于星期二方法：方法：类似于法，类似于法，10-20%三氯乙酸固定三氯乙酸固定1 h 后，加入后，加入0.5-1%染色染色30 min，洗去，洗去 染料，空气干燥后，加入染料，空气干燥后，加入10 mM Tris 溶解

22、溶解 后，后，50 nm测定光密度测定光密度结果处理：结果处理：同法同法第32页，讲稿共105张，创作于星期二）细胞排染法（酞酚蓝）细胞排染法（酞酚蓝）原理：原理：细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏，正 常细胞排染，而死亡细胞染成蓝色。常细胞排染，而死亡细胞染成蓝色。伊红、苯胺黑伊红、苯胺黑等染料等染料第33页，讲稿共105张，创作于星期二细胞死亡率细胞死亡率（%）对照组活细胞数给药组活细胞数对照组活细胞数给药组活细胞数对照组活细胞数对照组活细胞数X100%=结果结果：方法：方法：细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀，用细胞计数板，分别计细胞悬液加入酞酚蓝染色液混

23、匀，用细胞计数板，分别计数活细胞（未染色）和死细胞数目（蓝色）数活细胞（未染色）和死细胞数目（蓝色）第34页，讲稿共105张，创作于星期二.诱导肿瘤细胞分化实验诱导肿瘤细胞分化实验1.NBT还原法还原法原理：原理：硝基蓝四氮唑兰硝基蓝四氮唑兰(NBT)(NBT)还原法测定细胞株分化还原法测定细胞株分化诱导。正常的中性粒细胞内磷酸戊糖支路活跃诱导。正常的中性粒细胞内磷酸戊糖支路活跃,细胞内细胞内还原型辅酶含量增加还原型辅酶含量增加,将可溶性将可溶性NBTNBT还原还原为不溶性蓝紫色颗粒为不溶性蓝紫色颗粒,而沉积于细胞浆内。而沉积于细胞浆内。方法：方法：HL-60 HL-60 细胞株是筛选分化诱导

24、剂的细胞株是筛选分化诱导剂的,药物作用后药物作用后,细胞形态向粒细胞方向分化。细胞形态向粒细胞方向分化。结果：结果：显微镜计数显微镜计数NBTNBT还原阳性细胞，计算诱导分化率还原阳性细胞，计算诱导分化率第35页，讲稿共105张，创作于星期二对照组对照组药物处理组药物处理组第36页，讲稿共105张，创作于星期二.诱导肿瘤细胞凋亡实验诱导肿瘤细胞凋亡实验）形态学观察（透射电镜）形态学观察（透射电镜）原理：原理：细胞超微结构观察细胞超微结构观察方法：方法：药物处理后，收集细胞，药物处理后，收集细胞，4%4%戊二醛固定戊二醛固定2 h2 h以上，以上，PBSPBS清洗，清洗，1%1%俄酸固定俄酸固定

25、1 h,1 h,酒精丙酮梯度脱水，酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，切片做成铜网，经醋酸铀、枸橼环氧树脂包埋，切片做成铜网，经醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜下观察拍照。酸铅染色，透射电镜下观察拍照。第37页，讲稿共105张，创作于星期二对照组对照组凋亡细胞凋亡细胞正常细胞胞质正常细胞胞质散在内质网、散在内质网、核膜清楚、染核膜清楚、染色质均匀、核色质均匀、核仁明显。仁明显。凋亡细胞染色质浓缩、凋亡细胞染色质浓缩、致密，沿核分布形成致密，沿核分布形成新月体状，有凋亡小新月体状，有凋亡小体出现。体出现。对照组对照组第38页，讲稿共105张，创作于星期二坏死坏死线粒体肿胀线粒体肿胀 凋亡细胞胞质出现凋

26、亡细胞胞质出现明显的线粒体肿胀。明显的线粒体肿胀。坏死细胞细胞膜不完坏死细胞细胞膜不完整，核膜破裂，染色整，核膜破裂，染色质呈虫蚀状溶解。质呈虫蚀状溶解。第39页，讲稿共105张，创作于星期二B）DNA形态观察（形态观察（Hoeschst333258）原理原理：Hoeschst333258Hoeschst333258与与DNADNA特异性结合发出蓝特异性结合发出蓝色荧光色荧光方法：方法：肿瘤细胞用肿瘤细胞用Hoeschst333258Hoeschst333258染色后，在染色后，在荧光显微镜下观察荧光显微镜下观察结果：结果：活细胞成均匀的淡荧光，调亡细胞核或细活细胞成均匀的淡荧光，调亡细胞核或

27、细胞质内可见强荧光的颗粒状物质。胞质内可见强荧光的颗粒状物质。第40页，讲稿共105张，创作于星期二对照组对照组药物处理组药物处理组第41页，讲稿共105张，创作于星期二C）染色体断裂测定）染色体断裂测定原理：原理：凋亡细胞内源性核酸酶激活，链被切割凋亡细胞内源性核酸酶激活，链被切割成成200 bp200 bp不同倍数的片段，将这些片断进行不同倍数的片段，将这些片断进行电泳，可观察到梯带电泳，可观察到梯带方法：方法：裂解肿瘤细胞，消化蛋白，提取，上凝胶裂解肿瘤细胞，消化蛋白，提取，上凝胶电泳，染色后，灯下观察。电泳，染色后，灯下观察。结果：结果：凋亡细胞显示梯带。凋亡细胞显示梯带。第42页，讲

28、稿共105张，创作于星期二 CTLDRUG1DRUG2 MARKER第43页，讲稿共105张，创作于星期二）PI/Annexin-FITC双染色分析双染色分析 原理：原理：调亡细胞磷脂酰丝氨酸（调亡细胞磷脂酰丝氨酸（PSPS）暴露于细胞）暴露于细胞表面，表面，PSPS结合标记荧光素结合标记荧光素FITCFITC的的Annexin-VAnnexin-V但细胞膜仍然完整，荧光染料不能进但细胞膜仍然完整，荧光染料不能进 入，而调亡晚期的细胞可同时受入，而调亡晚期的细胞可同时受Annexin-VAnnexin-V 和和PIPI的双标记。的双标记。方法：方法：肿瘤细胞同时加入肿瘤细胞同时加入Annexi

29、n-Annexin-和染色，和染色，用流式细胞仪分析。用流式细胞仪分析。第44页，讲稿共105张，创作于星期二正常细胞正常细胞Annexin-V(-)PI (-)晚期凋亡细胞晚期凋亡细胞Annexin-V(+)PI (+)早期凋亡细胞早期凋亡细胞Annexin-V(+)PI (-)Annexin-VPI第45页，讲稿共105张，创作于星期二PI/AnnexinV-FITC 双染激光共聚焦分析结果双染激光共聚焦分析结果PI红色荧光红色荧光细胞核细胞核AnnexinV-FITC绿色荧光绿色荧光细胞膜细胞膜第46页，讲稿共105张，创作于星期二Annexin-V-FITCPI 对照组对照组药物处理组

30、药物处理组第47页，讲稿共105张，创作于星期二.抗肿瘤血管生成实验抗肿瘤血管生成实验 肿瘤发生、生长和转移与肿瘤发生、生长和转移与新生血管新生血管形成密切相关，当肿形成密切相关，当肿瘤直径超过瘤直径超过2 mm2 mm时时,直接由微环境提供的营养就不能满足直接由微环境提供的营养就不能满足其生长需要其生长需要,此时此时肿瘤的生长依赖于新生血管肿瘤的生长依赖于新生血管运送营养物质。运送营养物质。肿瘤血管生成抑制剂能抑制血管生成肿瘤血管生成抑制剂能抑制血管生成,阻止肿瘤生长和阻止肿瘤生长和转移，在治疗肿瘤中具有高效、广普、副作用小、不易产生耐转移，在治疗肿瘤中具有高效、广普、副作用小、不易产生耐药

31、性等优点。药性等优点。第48页，讲稿共105张，创作于星期二）血管内皮细胞体外筛选模型）血管内皮细胞体外筛选模型原理：原理：体外培养的血管内皮细胞在含生长因子条件下体外培养的血管内皮细胞在含生长因子条件下 能形成细胞条索，然后形成管状。肿瘤血管生能形成细胞条索，然后形成管状。肿瘤血管生 成抑制剂能抑制细胞管腔的形成。成抑制剂能抑制细胞管腔的形成。方法：方法：人脐静脉血管内皮细胞在含有药物和不含有人脐静脉血管内皮细胞在含有药物和不含有TAI 药物的胶原凝胶中分别培养后药物的胶原凝胶中分别培养后,在显微镜下比较在显微镜下比较 它们形成的管腔数目。它们形成的管腔数目。对照组对照组药物处理组药物处理组

32、第49页，讲稿共105张，创作于星期二）鸡胚绒毛尿囊膜血管新生模型）鸡胚绒毛尿囊膜血管新生模型原理：原理：鸡卵在胚胎发育过程中，尿囊膜上的血管生长鸡卵在胚胎发育过程中，尿囊膜上的血管生长很旺盛，将不同药物作用于尿囊膜，观察该膜很旺盛，将不同药物作用于尿囊膜，观察该膜上的血管生长。上的血管生长。方法：方法：鸡胚胎放在直培养皿内鸡胚胎放在直培养皿内,在无菌恒温箱中孵育在无菌恒温箱中孵育到第到第9 天的生长高峰时天的生长高峰时,将浸泡过药物将浸泡过药物 的明胶的明胶海绵置于鸡胚绒毛尿囊膜表面，培养天，在海绵置于鸡胚绒毛尿囊膜表面，培养天，在显微镜下随机取几个视野点显微镜下随机取几个视野点,记数记数“

33、热点热点”区的新区的新生血管数生血管数,计算平均值。计算平均值。第50页，讲稿共105张，创作于星期二血管生成血管生成抑制率（抑制率（%）对照组血管面积给药组血管面积对照组血管面积给药组血管面积对照组血管面积对照组血管面积X100%结果：结果：CTL低剂量药物低剂量药物高剂量药物组高剂量药物组第51页，讲稿共105张，创作于星期二）斑马鱼血管新生模型）斑马鱼血管新生模型 斑马鱼被广泛地应用于药物筛选方面的研究。主要用于筛选斑马鱼被广泛地应用于药物筛选方面的研究。主要用于筛选抗血管生成药物。抗血管生成药物。其胚胎早期发育的过程中其胚胎早期发育的过程中,血管生成的模式比较简单血管生成的模式比较简单

34、,主要出主要出现在头部和躯干部体节间现在头部和躯干部体节间,体节间的血管最初由背部的动脉出芽形体节间的血管最初由背部的动脉出芽形成于相邻体节之间。成于相邻体节之间。斑马鱼胚胎第52页，讲稿共105张，创作于星期二方法：方法：在在96 孔板上用药物处理胚胎孔板上用药物处理胚胎,通过血管内源通过血管内源 性碱性磷酸酶染色来显示血管性碱性磷酸酶染色来显示血管,进而评价药进而评价药物对血管生成的作用。物对血管生成的作用。结果：结果：第53页，讲稿共105张，创作于星期二第54页，讲稿共105张，创作于星期二耐药性逆转实验耐药性逆转实验 肿瘤细胞耐药性，分先天性耐药性和获得性耐药性，也可分为原药肿瘤细胞

35、耐药性，分先天性耐药性和获得性耐药性，也可分为原药耐药性和多药耐药性。多药耐药性基因耐药性和多药耐药性。多药耐药性基因mdr1编码表达编码表达P-糖蛋白糖蛋白（P-gp）是产生耐药性的主要机制。）是产生耐药性的主要机制。P-gp将化疗药物泵出体外，降低药将化疗药物泵出体外，降低药物在细胞内的浓度。物在细胞内的浓度。）肿瘤耐药性体外模型的建立）肿瘤耐药性体外模型的建立 逐步增加肿瘤细胞培养基中抗癌药物的浓度（逐步增加肿瘤细胞培养基中抗癌药物的浓度（Dox）诱导产）诱导产生肿瘤耐药株。用生肿瘤耐药株。用MTT法检测药物对敏感株和耐药株的细胞毒性，同法检测药物对敏感株和耐药株的细胞毒性，同时测定时测

36、定mdr1基因和基因和P-gp表达水平表达水平。第55页，讲稿共105张，创作于星期二耐药株耐药株敏感株敏感株P-gp敏感株敏感株耐药株耐药株第56页，讲稿共105张，创作于星期二2)逆转肿瘤多药耐药性作用的药物筛选逆转肿瘤多药耐药性作用的药物筛选方法：方法：采用采用MTT法测定加逆转剂前后法测定加逆转剂前后DOX对耐药株的细胞对耐药株的细胞 毒性。计算逆转效果毒性。计算逆转效果.FR(逆转倍数逆转倍数)=IC50(不加逆转剂不加逆转剂)/IC50(加逆转剂）加逆转剂）IC50(耐药性耐药性肝癌细胞株肝癌细胞株R-HepG2)FRDox 160 uMDox+Vep 31 uM5第57页，讲稿共

37、105张，创作于星期二Effect of NSC23925 to reverse drug resisitance in MDR cell lines第58页，讲稿共105张，创作于星期二第59页，讲稿共105张，创作于星期二 用荧光酶标仪、荧光显微镜或流式细胞仪检测加药前后耐用荧光酶标仪、荧光显微镜或流式细胞仪检测加药前后耐药细胞株内抗癌药多柔比星药细胞株内抗癌药多柔比星Dox的含量。的含量。Control0.5 uM Dox+1 uM Vep0.5 uM Dox0.5 uM Dox+5 uM Vep0.5 uM Dox+10 uM Vep第60页，讲稿共105张，创作于星期二HepG/AD

38、M ControlVerapamil 5 mMDrug 1.25 mMDrug 2.5 mMDrug 5 mM多柔比星累积实验多柔比星累积实验第61页，讲稿共105张，创作于星期二Rhm123累积实验累积实验ControlVerapamil 5 mMDrug 1.25 mMDrug 2.5 mMDrug 5 mM第62页，讲稿共105张，创作于星期二6.抗肿瘤侵袭和迁移实验抗肿瘤侵袭和迁移实验 转移是恶性肿瘤的重要特征转移是恶性肿瘤的重要特征v肿瘤的迁移是一个多阶段的复杂过程，肿瘤的迁移是一个多阶段的复杂过程，Liotta等提出肿瘤侵袭和转等提出肿瘤侵袭和转移的三步学说，即移的三步学说，即粘附

39、、降解和移动粘附、降解和移动。粘附是肿瘤细胞侵袭的起始，。粘附是肿瘤细胞侵袭的起始，肿瘤细胞通过表面特定受体与基底膜的层粘连蛋白、纤维连接蛋白和肿瘤细胞通过表面特定受体与基底膜的层粘连蛋白、纤维连接蛋白和型胶原等相粘连，然后在蛋白水解酶和相关因子的作用下，侵袭基底膜，型胶原等相粘连，然后在蛋白水解酶和相关因子的作用下，侵袭基底膜，降解细胞外基质肿瘤细胞一旦突破基底膜，逃避免疫监视，即在基质内降解细胞外基质肿瘤细胞一旦突破基底膜，逃避免疫监视，即在基质内较快侵袭性生长并发生转移。较快侵袭性生长并发生转移。v阻断其中任何一个过程，都可以抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭阻断其中任何一个过程，都可以抑制肿瘤细

40、胞的迁移和侵袭第63页，讲稿共105张，创作于星期二）粘附实验）粘附实验原理：原理：将将Matrigel铺在铺在96孔板上，能形成与天然基底膜极为相似孔板上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构，可以有效地在体外模拟肿瘤细胞的粘附过的基底膜结构，可以有效地在体外模拟肿瘤细胞的粘附过程。程。方法：方法：将将Matrigel包被包被96孔板，过夜，将药物处理后的细胞孔板，过夜，将药物处理后的细胞接种在接种在96孔板，孔板，1h后，弃去未粘附的细胞，加入后，弃去未粘附的细胞，加入MTT培养，测定吸光度。培养，测定吸光度。结果：结果：细胞粘附细胞粘附 抑制率（抑制率（%）=（OD对照对照-OD实验实

41、验）OD对照对照X 100%第64页，讲稿共105张，创作于星期二2）细胞划痕实验（运动能力检测）细胞划痕实验（运动能力检测）方法：方法：细胞按细胞按30000个个/孔密度接种于孔密度接种于6孔板，待细胞贴壁生长到孔板，待细胞贴壁生长到90%融合度，用融合度，用20 uL移液器枪头在每孔划出十字形划痕，移液器枪头在每孔划出十字形划痕，PBS清洗后，加入药物处理后（无血清培养基），显微镜清洗后，加入药物处理后（无血清培养基），显微镜下观察拍照。下观察拍照。第65页，讲稿共105张，创作于星期二A B C D EA B C D EA:Control;B:Drug 20 nmolL-1;C:Drug

42、 30 nmolL-1;D:Drug 40 nmolL-1;E:Drug 50 nmolL-1细胞运动能力实验细胞运动能力实验第66页，讲稿共105张，创作于星期二Transwell技术技术3）细胞迁移和侵袭实验）细胞迁移和侵袭实验第67页，讲稿共105张，创作于星期二原理：原理：肿瘤细胞在趋化因子的作用下可肿瘤细胞在趋化因子的作用下可 穿透聚碳酸酯膜，从上室穿透聚碳酸酯膜，从上室转移到下室，有些药物可抑制这种迁移。转移到下室，有些药物可抑制这种迁移。方法：方法：（1）Transwell小室的制备小室的制备 Matrix包被并水化基底膜包被并水化基底膜（2）制备细胞悬液）制备细胞悬液 110

43、x 105的细胞的细胞/200 uL（3）细胞接种）细胞接种 下室下室20%FBS的培养液，上室无血清培养液的培养液，上室无血清培养液（4）细胞培养）细胞培养24-48 h（5）细胞染色，拍照并计数）细胞染色，拍照并计数第68页，讲稿共105张，创作于星期二A:Control;B:Drug 20 nmolL-1;C:Drug 30 nmolL-1;D:Drug 40 nmolL-1;E:Drug 50 nmolL-1细胞迁移能力实验细胞迁移能力实验第69页，讲稿共105张，创作于星期二细胞侵袭能力实验细胞侵袭能力实验A:Control;B:Drug 20 nmolL-1;C:Drug 30 n

44、molL-1;D:Drug 40 nmolL-1;E:Drug 50 nmolL-1第70页，讲稿共105张，创作于星期二6.自噬实验自噬实验自噬：自噬：是以细胞器的自我消化和更新为特征生化过程是以细胞器的自我消化和更新为特征生化过程过程：过程：粗面内质网脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞粗面内质网脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。些细胞器的更新

45、。生物功能生物功能：一般认为自噬是保护细胞，但是也可以诱导细胞一般认为自噬是保护细胞，但是也可以诱导细胞 发生自噬性死亡。发生自噬性死亡。第71页，讲稿共105张，创作于星期二自噬过程自噬过程第72页，讲稿共105张，创作于星期二自噬的特征自噬的特征第73页，讲稿共105张，创作于星期二自噬的检测自噬的检测vMDC法法 原理：原理：自噬小泡呈偏酸性，绿色的荧光自噬小泡呈偏酸性，绿色的荧光 染料能选择性聚集染料能选择性聚集方法：方法：加入（）处理加入（）处理15min 后，后，激光共聚焦显微镜观察激光共聚焦显微镜观察第74页，讲稿共105张，创作于星期二LC3-GFP原理：原理：LC3-GFP绿

46、色荧光蛋白克隆细绿色荧光蛋白克隆细胞株，出现自噬时伴随胞株，出现自噬时伴随LC3高高表达，呈现绿色荧光染料表达，呈现绿色荧光染料方法：方法：药物处理预定时间后，激光药物处理预定时间后，激光共聚焦显微镜观察共聚焦显微镜观察第75页，讲稿共105张，创作于星期二相关蛋白表达相关蛋白表达vLC3vAtg5vBeclin 1vp62第76页，讲稿共105张，创作于星期二四、酶水平的筛选四、酶水平的筛选拓扑异构酶抑制剂筛选拓扑异构酶抑制剂筛选 端粒酶酶抑制剂筛选端粒酶酶抑制剂筛选 VEGFR 酪氨酸蛋白激酶酶抑制剂筛选酪氨酸蛋白激酶酶抑制剂筛选 组蛋白去乙酰酶抑制剂筛选组蛋白去乙酰酶抑制剂筛选基质金属蛋

47、白酶抑制剂筛选基质金属蛋白酶抑制剂筛选法基尼转移酶抑制剂筛选法基尼转移酶抑制剂筛选丝裂原活化蛋白激酶抑制剂筛选丝裂原活化蛋白激酶抑制剂筛选第77页，讲稿共105张，创作于星期二拓扑异构酶抑制剂筛选拓扑异构酶抑制剂筛选 DNA拓扑异构酶是一种重要的核酶，通过拓扑异构酶是一种重要的核酶，通过DNA链断链断裂和重接而改变裂和重接而改变DNA的拓扑结构，调节其空间构型变化，的拓扑结构，调节其空间构型变化，在细胞生长过程中起重要作用在细胞生长过程中起重要作用第78页，讲稿共105张，创作于星期二方法：方法：裂解细胞裂解细胞,提取拓扑异构酶提取拓扑异构酶,测定酶总量或酶活测定酶总量或酶活 性的变化性的变化

48、,在酶反应体系中，加入负超螺旋在酶反应体系中，加入负超螺旋 pBR322 pBR322 质粒质粒DNA,TOPO DNA,TOPO 酶提液及不同浓度的药酶提液及不同浓度的药 物，温育物，温育30 min30 min后，加入反应终止液，在琼脂糖后，加入反应终止液，在琼脂糖 凝胶中电泳凝胶中电泳,溴化乙锭染色紫外灯下观察。溴化乙锭染色紫外灯下观察。结果：结果：第79页，讲稿共105张，创作于星期二端粒酶抑制剂筛选端粒酶抑制剂筛选 端粒端粒是染色体特殊结构是染色体特殊结构,起着保护染色体的完整和起着保护染色体的完整和稳定性的作用稳定性的作用,端粒酶是一种核糖核蛋白反转录酶端粒酶是一种核糖核蛋白反转录

49、酶,可以自身可以自身RNA为模板合成端粒末端。正常细胞端粒酶活为模板合成端粒末端。正常细胞端粒酶活性是阴性性是阴性,而在肿瘤细胞株表达高活性。而在肿瘤细胞株表达高活性。第80页，讲稿共105张，创作于星期二方法：方法：裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白含量，裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白含量，扩增，凝胶电泳，银染色扩增，凝胶电泳，银染色结果：结果：端粒是由短端粒是由短DNA DNA 重复序列组成重复序列组成,而端粒酶的作而端粒酶的作 用是维持端粒末端的长度用是维持端粒末端的长度,因此因此PCR PCR 扩增产物扩增产物 间接反映端粒酶活性。间接反映端粒酶活性。第81页，讲稿共105张，创作于星期二药物

50、对肿瘤细胞端粒长度和端粒酶活性的影响药物对肿瘤细胞端粒长度和端粒酶活性的影响第82页，讲稿共105张，创作于星期二VEGFRVEGFR酪氨酸蛋白激酶抑制剂筛选酪氨酸蛋白激酶抑制剂筛选 VEGFR 受体酪氨酸蛋白激酶受体酪氨酸蛋白激酶能特异性地将磷酸根转移能特异性地将磷酸根转移到蛋白质的酪氨酸残基上使其磷酸化，酪氨酸激酶的异常到蛋白质的酪氨酸残基上使其磷酸化，酪氨酸激酶的异常表达还与表达还与肿瘤的侵袭和转移肿瘤的侵袭和转移，肿瘤新生血管的生成，肿，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的化疗抗性密切相关。瘤的化疗抗性密切相关。以以酪氨酸激酶为靶点酪氨酸激酶为靶点进行药物研发成为国际上抗肿进行药物研发成为国际上