抗菌药物敏感试验细菌耐药性检测精选PPT.ppt

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1、关于抗菌药物敏感试验细菌耐药性检测第1页，讲稿共75张，创作于星期一2敏感和耐药的概念敏感和耐药的概念n从从本本质上上讲：细菌菌对某某种种抗抗菌菌药物物是是敏敏感感还是是耐耐药，常常以以该抗菌抗菌药物的物的治疗浓度治疗浓度与与MIC的关系而定。的关系而定。常用剂量的抗菌药物通过常用途径常用剂量的抗菌药物通过常用途径所能达到的所能达到的血药浓度血药浓度第2页，讲稿共75张，创作于星期一3血药浓度与血药浓度与MIC之间的关系之间的关系敏感敏感中介耐药中介耐药耐药耐药上限上限下限下限第3页，讲稿共75张，创作于星期一4 抗菌药物的抗菌药物的治疗浓度治疗浓度与与MIC的关系：的关系：n若若MIC小于小

2、于治治疗浓度，度，则为“敏感敏感”（Sensitive,S），推荐使用。），推荐使用。n若若MIC大于大于治治疗浓度，度，则为“耐耐药”（Resistant,R）；）；n若若MIC介于治介于治疗浓度的上下限之度的上下限之间，则为“中度中度耐耐药”（Intermediate,I）或中度敏感）或中度敏感敏感和耐药的概念敏感和耐药的概念第4页，讲稿共75张，创作于星期一5第5页，讲稿共75张，创作于星期一6敏感敏感治疗浓度的上限治疗浓度的上限即表中的即表中的 R治疗浓度的下限治疗浓度的下限即表中的即表中的 S耐药耐药中介中介耐药耐药治疗浓度治疗浓度CLSI标准标准MIC第6页，讲稿共75张，创作于星

3、期一7 第一节、第一节、抗菌药物敏感性试验方法抗菌药物敏感性试验方法需氧和兼性厌氧菌需氧和兼性厌氧菌第7页，讲稿共75张，创作于星期一8n稀稀释法法 肉肉汤稀稀释法（法（试管稀管稀释法）法）琼脂稀脂稀释法（平板稀法（平板稀释法）法）n纸片片扩散法（散法（纸片法）片法）nE-试验n联合合药物敏感物敏感试验需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法第8页，讲稿共75张，创作于星期一9稀释法的特点稀释法的特点n定量定量的的药敏敏试验，测定定MIC、MBC。n方法比方法比较繁繁琐，手工操作一般不作，手工操作一般不作为常常规试验，常用于常用于调查罕罕见耐耐药。n自自动微生物微生物鉴定定

4、药敏分析系敏分析系统采用微量稀采用微量稀释法法检测MIC。第9页，讲稿共75张，创作于星期一10二、纸片扩散法（disc diffusion test)（Kirby-Bauer法）原理：原理：n将将浸有抗菌浸有抗菌药物的物的纸片片贴在涂有在涂有测试菌的菌的琼脂平脂平板上。抗菌板上。抗菌药物向物向琼脂四周脂四周扩散形成散形成递减的梯度减的梯度浓度度。n药物敏感物敏感细菌在菌在纸片周片周围一定距离内的生一定距离内的生长受到受到抑制，形成抑制，形成抑菌圈抑菌圈。n抑菌圈的大小反映抑菌圈的大小反映测试菌菌 对药物的敏感程度物的敏感程度。二者呈正相关。二者呈正相关。第10页，讲稿共75张，创作于星期一1

5、1抑菌圈边缘的药物浓度抑菌圈边缘的药物浓度 与与 MIC第11页，讲稿共75张，创作于星期一12 抑菌圈的大小与抑菌圈的大小与MICMIC：n二者呈二者呈负相关，即抑菌圈愈大，相关，即抑菌圈愈大，MICMIC愈小。愈小。第12页，讲稿共75张，创作于星期一13纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准抗菌药物与细菌抗菌药物与细菌 纸片含量纸片含量 抑菌圈直径抑菌圈直径：mm 相应相应MIC g/ml 耐药耐药 中介度中介度 敏感敏感 耐药耐药 敏感敏感丁胺卡那霉素丁胺卡那霉素 30g 14 15-16 17 32 16 氨苄青霉素氨苄青霉素 测肠杆菌测肠杆

6、菌 10g 11 12-13 14 32 8 测葡萄球菌测葡萄球菌 10g 28 29 测嗜血杆菌测嗜血杆菌 10g 19 20 4 0.25 测肠球菌测肠球菌 10g 16 16 2第13页，讲稿共75张，创作于星期一14 操作方法操作方法 ：1.制制备M-H琼脂平板，厚度脂平板，厚度4mm。2.制制备0.5麦氏麦氏比比浊管管浊度的菌液度的菌液（培养（培养1624h，45个菌落）。个菌落）。3.菌液均匀涂布于平板。（菌液均匀涂布于平板。（15分分钟接种完接种完毕）4.无菌无菌贴标准抗生素准抗生素纸片于片于M-H琼脂表面，脂表面，5.经过351624h孵育。孵育。6.量取抑菌量取抑菌环直径直径

7、，根据根据CLSI标准，准，报告告细菌菌对该抗生素敏感、抗生素敏感、耐耐药、中介、中介。第14页，讲稿共75张，创作于星期一15操作方法操作方法：1.将在约将在约56恒温的无菌恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为琼脂倾注直径为90mm 的平板，其厚度的平板，其厚度 4mm。第15页，讲稿共75张，创作于星期一162.无菌挑取孵育无菌挑取孵育1624h的血平板上的血平板上45个菌落。个菌落。第16页，讲稿共75张，创作于星期一173.将菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度于将菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度于0.5麦氏麦氏比浊管浊度的菌液。比浊管浊度的菌液。1.5108CFU/ml第17页，讲稿共75张，

8、创作于星期一184.用无菌棉签浸入细菌悬液用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉挤压以挤去过多的菌液。棉签在签在三个方向均匀抹三个方向均匀抹琼脂表面琼脂表面（每次转（每次转60）使菌液均匀）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹分布，最后沿平板内缘涂抹一周。一周。第18页，讲稿共75张，创作于星期一195.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置310分钟分钟后贴上标准抗生素纸片。后贴上标准抗生素纸片。第19页，讲稿共75张，创作于星期一206.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于用无菌镊子或纸片分配器将

9、抗菌纸片粘贴于M-HM-H琼脂的琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于心距离应大于24mm24mm，纸片距平板内缘应大于，纸片距平板内缘应大于15mm15mm。第20页，讲稿共75张，创作于星期一217.7.经过经过3516351624h24h孵育。孵育。8.8.取抑菌环直径，取抑菌环直径，根据根据CLSICLSI标准，报告细菌对该抗标准，报告细菌对该抗生素敏感、耐药、中介。生素敏感、耐药、中介。第21页，讲稿共75张，创作于星期一22纸片扩散法纸片扩散法质量控制质量控制n 培养基：培养基：M-H平板厚度，平板厚度，4 mm n

10、细菌菌悬液：液：0.5麦氏麦氏标准的准的细菌菌浓度度n药敏敏纸片的片的质量量n各抗菌各抗菌纸片中心距离片中心距离应大于大于24mm，纸片距平板内片距平板内缘应大于大于15mm。9cm的平板的平板贴6个个n培养培养时间n质控菌株控菌株 抑菌圈直径？抑菌圈直径？第22页，讲稿共75张，创作于星期一23第23页，讲稿共75张，创作于星期一24n根据抑菌圈的直径，依照根据抑菌圈的直径，依照CLSI标准，作出敏感、标准，作出敏感、耐药、和中介的判断。为耐药、和中介的判断。为 定性定性”结果。结果。nCLSI推荐的最简单的药敏试验。推荐的最简单的药敏试验。纸片扩散法的特点纸片扩散法的特点第24页，讲稿共7

11、5张，创作于星期一25三、三、E试验法试验法（浓度梯度法）（浓度梯度法）原理：原理：nE E试条是条是一条一条5mm50mm5mm50mm无孔无孔试剂载体体，一面固定有一系，一面固定有一系列列预先制先制备的的浓度呈度呈连续指数增指数增长的抗菌的抗菌药物物，另一面有判，另一面有判别的的刻度刻度。抗菌。抗菌药物的梯度可覆盖有物的梯度可覆盖有15-15-2020个个对倍稀倍稀释浓度度的的宽度范度范围。n将将E E试条放在条放在细菌接种菌接种过的的琼脂平板上，脂平板上，经孵育，孵育，围绕试条明条明显可可见椭圆形抑菌圈，形抑菌圈，圈的圈的边缘与与试条交点的刻度条交点的刻度浓度即度即为抗菌抗菌药物抑制物抑

12、制细菌的菌的MICMIC。n依照依照CLSICLSI标准判断其敏感、耐准判断其敏感、耐药、中介。、中介。256128 8016第25页，讲稿共75张，创作于星期一26无菌生长区无菌生长区有菌生长区有菌生长区第26页，讲稿共75张，创作于星期一27 椭圆形细菌生长椭圆形细菌生长抑制区抑制区256128 8016判读抑菌浓度判读抑菌浓度（MIC ug/ml)第27页，讲稿共75张，创作于星期一30E test 法法特点特点n优点点q连续浓度梯度，与度梯度，与琼脂稀脂稀释法相关性好（相法相关性好（相关系数关系数为0.9）.可可测MIC。q操作操作简单，影响因素少，影响因素少，稳定性高。定性高。n缺点

13、：缺点：E试条条较昂昂贵;不适用于生不适用于生长缓慢的苛养菌。慢的苛养菌。第30页，讲稿共75张，创作于星期一31n用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗疗,以扩大病原治疗的覆盖面以扩大病原治疗的覆盖面n治疗多种细菌所引起的混合感染治疗多种细菌所引起的混合感染n对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用n减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生n避免药物达到毒性剂量。避免药物达到毒性剂量。四、联合药物敏感试验四、联合药物敏感试验联合药物意义联合药物意义第31页，讲稿共75张，创作于星期一32n增增

14、强作用：作用：两种抗生素两种抗生素联用的效果用的效果大于大于它它们单独使独使用用时的效果之和；的效果之和；2025n相加作用相加作用：它：它们联用用时的效果的效果等于等于单用两种抗生素用两种抗生素效果之和；效果之和；6070n无关作用：无关作用：两种抗生素两种抗生素联用的效果，用的效果，仅相当于其中一相当于其中一种种具有具有较强作用的抗生素的效果；作用的抗生素的效果；n拮抗作用：拮抗作用：两种抗生素两种抗生素联用用时的效果的效果反而小于反而小于它它们分分别使用使用时的效果之和。的效果之和。1015两种药物的联合使用的效果两种药物的联合使用的效果第32页，讲稿共75张，创作于星期一33 两种抗菌

15、药物作用部位不同：两种抗菌药物作用部位不同：n内酰胺类抗生素（抑制细菌细胞壁合成）与氨基糖内酰胺类抗生素（抑制细菌细胞壁合成）与氨基糖苷类抗生素（干扰细菌的代谢）。苷类抗生素（干扰细菌的代谢）。增强作用：增强作用：增加了药物进入细菌细胞增加了药物进入细菌细胞n杆菌肽（降低细胞通透性）与氨基糖苷类药物（干扰细菌杆菌肽（降低细胞通透性）与氨基糖苷类药物（干扰细菌的代谢）。的代谢）。拮抗作用：拮抗作用：降低了药物进入细菌细胞降低了药物进入细菌细胞抗菌药物协同作用发生原理抗菌药物协同作用发生原理第33页，讲稿共75张，创作于星期一34n棋盘稀释法棋盘稀释法 利用肉利用肉汤稀稀释法原理，依据两种法原理，

16、依据两种药物的物的MICMIC，以棋以棋盘设计两种两种药物不同物不同浓度的度的组合。合。n计算抑菌浓度指数（计算抑菌浓度指数（fraction inhaibitory concentration,FIC)联合药物敏感试验方法联合药物敏感试验方法第34页，讲稿共75张，创作于星期一35棋盘稀释法棋盘稀释法n首先分首先分别测定定拟联合的抗菌合的抗菌药物物对检测菌的菌的MICMIC。n药物最高物最高浓度度为MICMIC的的2 2倍，倍，对倍稀倍稀释。n两种两种药物的稀物的稀释分分别在方在方阵的的纵列和横列列和横列进行，行，这样在每管（孔）中可得到不同在每管（孔）中可得到不同浓度度组合的两种合的两种药

17、物混合液。物混合液。n接种菌量接种菌量为5105105 5CUFCUFmlml，3535孵育孵育18h18h后后观察察结果。果。n计算部分抑菌算部分抑菌浓度（度（FICFIC）指数。）指数。第35页，讲稿共75张，创作于星期一36抑菌浓度指数（抑菌浓度指数（FICFIC）FIC FIC A药联合时的药联合时的MICA药单测的药单测的MICB药联合时的药联合时的MICB药单测的药单测的MIC FIC 0.5为协同作用；为协同作用；0.51为相加作用；为相加作用；12为无关作用；为无关作用；2 为拮抗作用为拮抗作用第36页，讲稿共75张，创作于星期一37A药：药：32 16 8 4B药药:16 8

18、 4 2生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长 生生 长长第37页，讲稿共75张，创作于星期一38药敏试验方法的比较药敏试验方法的比较nK-B法：法：WTO推荐使用的最推荐使用的最简单的的定性定性药敏敏试验。n稀稀释法：法：准确准确测定定MIC、MBC，比，比较繁繁琐，试管法一般不作管法一般不作为常常规试验。微生物自微生物自动分析系分析系统采用微量稀采用微量稀释法原理法原理。nE试验：可可测定定MIC。第38页，讲稿共75张，创作于星期一39第二节第二节 结核分枝杆菌的药敏试验结核分枝杆菌的药敏试验 （了解）（了解）n首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有

19、助于首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于合理用药和监测药物敏感性。合理用药和监测药物敏感性。n另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）。结核病和结核性脑膜炎）。n以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。药敏试验。第39页，讲稿共75张，创作于星期一40四种方法四种方法n比例法比例法n放射同位素法放射同位素法n绝对浓度法绝对浓度法n耐药率法耐药率法n直接法：直接采用图片阳直接法：直接采用图片阳性的体液标本。（须经充分

20、性的体液标本。（须经充分消化五杂菌）消化五杂菌）n间接法：经分离纯培养后的间接法：经分离纯培养后的次代培养菌。次代培养菌。第40页，讲稿共75张，创作于星期一41无药药2药3药1nMiddlebrook7H10琼脂琼脂n培养培养3周周间接比例法（间接比例法（WHO推荐）推荐）敏感：含药格无结核杆菌生长，敏感：含药格无结核杆菌生长，或菌落数或菌落数1%对照格对照格耐药：含药格菌落数耐药：含药格菌落数1%对照格。对照格。不含药的对照格菌落数应为不含药的对照格菌落数应为501504 格平板格平板第41页，讲稿共75张，创作于星期一42分枝杆菌微量直视分枝杆菌微量直视快速药敏试验法快速药敏试验法400

21、0 倍倍第42页，讲稿共75张，创作于星期一43培养培养72h72h观察结果观察结果INHINH敏感敏感RFPRFP耐耐药阳性阳性对照照阴性阴性对照照第43页，讲稿共75张，创作于星期一44第三节第三节 厌氧菌体外药敏试验厌氧菌体外药敏试验 （了解）（了解）n厌氧菌感染多为内源性感染，厌氧菌药物敏感性稳定，厌氧菌感染多为内源性感染，厌氧菌药物敏感性稳定，一般不做体外药敏试验。一般不做体外药敏试验。n下述情况应考虑药敏试验：下述情况应考虑药敏试验：明确厌氧菌引起的严重感染；明确厌氧菌引起的严重感染；已确证的厌氧菌感染，经验性选药治疗未能奏效；已确证的厌氧菌感染，经验性选药治疗未能奏效；需长期用药

22、的厌氧菌感染。需长期用药的厌氧菌感染。第44页，讲稿共75张，创作于星期一45n基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、操基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。n培养基为布氏血琼脂再加人补充剂培养基为布氏血琼脂再加人补充剂 5g/ml氯化氯化血红素，血红素，5脱纤维羊脱纤维羊,1g/ml Vit K。n厌氧孵育条件厌氧孵育条件n质控菌株为脆弱类杆菌质控菌株为脆弱类杆菌ATCC25285。厌氧菌体外药敏试验厌氧菌体外药敏试验第45页，讲稿共75张，创作于星期一46药敏试验结果的临床价值药敏试验结果

23、的临床价值 n影响抗菌药物临床疗效的因素很多，据报道药影响抗菌药物临床疗效的因素很多，据报道药敏试验结果与临床疗效的敏试验结果与临床疗效的符合率约为符合率约为70%70%，n因此细菌培养及药敏试验报告只能作为临床用因此细菌培养及药敏试验报告只能作为临床用药的参考，应根据患者用药后的治疗反应和临药的参考，应根据患者用药后的治疗反应和临床病情及时调整用药。床病情及时调整用药。n医学检验的灵魂是与临床沟通。医学检验的灵魂是与临床沟通。第46页，讲稿共75张，创作于星期一47新的药敏试验方法探索新的药敏试验方法探索n流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度n分枝杆菌药物最低抑菌

24、浓度的快速测定分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定方法研究方法研究第47页，讲稿共75张，创作于星期一48细菌耐药性的发生过程：细菌耐药性的发生过程：细菌菌获得与耐得与耐药相关的基因相关的基因编码与耐与耐药有关的蛋白有关的蛋白表表现出出对某种抗生素的耐某种抗生素的耐药 基因：基因：537表型：书表型：书533页页敏感性敏感性第48页，讲稿共75张，创作于星期一49第第3535章第三章第三节细菌耐菌耐药性性检测第49页，讲稿共75张，创作于星期一50n生物化学技生物化学技术检测酶的等的等电点点(等等电聚焦聚焦电泳泳)n头孢哨哨噻吩吩滤纸片法片法n碘淀粉碘淀粉测定法定法n分析分析酶的底物的底物谱及抑

25、制物及抑制物谱 纸片法和稀片法和稀释法法 1、-内酰胺酶检测内酰胺酶检测临床意义：产临床意义：产ESBL克雷伯菌和大肠埃希菌对克雷伯菌和大肠埃希菌对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无效。青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无效。一、耐药表型检测一、耐药表型检测第50页，讲稿共75张，创作于星期一51G-菌产生的头孢菌素酶检测菌产生的头孢菌素酶检测 -头孢哨噻吩滤纸片法头孢哨噻吩滤纸片法 n用接种用接种环挑取受挑取受试菌于菌于头孢哨哨噻吩（吩（产色色头孢菌素）菌素）滤纸片上片上(商品化商品化)，n1010分分钟内由浅黄色内由浅黄色转变为粉粉红色即阳性色即阳性结果，果，表示表示头孢菌素的菌素的-内内酰胺胺环被

26、被酶打开。打开。n临床意床意义：产生生该酶的的细菌菌对头孢菌素菌素类抗生抗生素耐素耐药。第51页，讲稿共75张，创作于星期一52G+菌产生的菌产生的青霉素酶检测青霉素酶检测 -碘淀粉测定法碘淀粉测定法 n 受受试菌混于青霉素溶液，振菌混于青霉素溶液，振摇3030分分钟。加入淀粉液。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液后，再加入碘液，溶液变蓝，继续振振摇。1010分分钟之之内内蓝色消失者色消失者为产酶株。株。青霉素酶青霉素酶青霉素青霉素青霉素噻唑酸青霉素噻唑酸碘碘碘淀粉复合物变碘淀粉复合物变为无色为无色n 多为金黄色葡萄球菌产生，对青霉素多为金黄色葡萄球菌产生，对青霉素G G耐药。耐药。第52页，讲稿

27、共75张，创作于星期一53超广超广谱-内内酰胺胺酶Extended-Spectyum-Lactamase，ESBL ESBLsn能水解青霉素能水解青霉素类，头孢菌素和氨曲南。菌素和氨曲南。不能水解碳青不能水解碳青烯酶类，如，如亚胺培南胺培南n多数可被多数可被内内酰胺胺酶抑制抑制剂（如克拉（如克拉维酸，三酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。巴坦及舒巴坦）所抑制。n如如为ESBLESBL阳性，阳性，则对青霉素青霉素类，头孢菌素和氨菌素和氨曲南均曲南均报告告耐耐药，不考，不考虑体外体外药敏敏结果。果。第53页，讲稿共75张，创作于星期一54常常见产产ESBLs菌株菌株n最常最常见是是肠杆菌科杆菌科细菌（菌

28、（大大肠埃希氏菌、肺炎埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌）克雷伯氏菌）；n其次，阴沟其次，阴沟肠杆菌、粘杆菌、粘质沙雷氏菌、弗沙雷氏菌、弗劳地枸地枸橼酸菌、酸菌、铜绿假假单胞菌、胞菌、奈瑟菌等奈瑟菌等。第54页，讲稿共75张，创作于星期一55ESBLs的临床意义的临床意义n对产对产ESBLs菌株，目前最有效的抗生素为碳青菌株，目前最有效的抗生素为碳青霉烯类（泰能），其次，头孢西丁及含酶抑制霉烯类（泰能），其次，头孢西丁及含酶抑制剂的复合剂、氨基糖甙类部分有效。剂的复合剂、氨基糖甙类部分有效。n若临床出现产若临床出现产ESBLs菌株，会在病人和医院之菌株，会在病人和医院之间及不同菌株间相互传播，应引起充分

29、的重视。间及不同菌株间相互传播，应引起充分的重视。第55页，讲稿共75张，创作于星期一56纸片初片初筛：n培养基：培养基：Muller-HintonMuller-Hinton琼脂脂n药敏敏纸片片n接种：按接种：按标准准纸片片扩散法散法n孵育：孵育：3535大气大气环境，境，16-1816-18小小时n结果：果：头孢泊泊肟（10ug10ug片）抑菌片）抑菌环22mm 22mm 头孢他他啶（10ug10ug片）抑菌片）抑菌环22mm22mm 氨曲南氨曲南 （30ug30ug片）抑菌片）抑菌环27mm27mm 头孢噻肟（30ug30ug片）抑菌片）抑菌环27mm27mm 头孢曲松（曲松（30ug30

30、ug片）抑菌片）抑菌环25mm 25mm 超超-内酰胺酶检测内酰胺酶检测纸片片扩散法散法ESBLs的的底物底物可能产生可能产生ESBLs第56页，讲稿共75张，创作于星期一57 n培养基：培养基：Muller-HintonMuller-Hinton琼脂脂n药敏敏纸片片浓度：度：头孢噻肟30ug30ug、头孢噻肟/克拉克拉维酸酸30ug/10ug30ug/10ug 头孢他他啶30ug30ug、头孢他他啶/克拉克拉维酸酸30ug/10ug30ug/10ugn接种：按接种：按标准准纸片片扩散法散法n孵育：孵育：3535大气大气环境，境，16-1816-18小小时 n结果：果：复合制复合制剂药物物纸片

31、的抑菌圈直径片的抑菌圈直径 比非复合制比非复合制剂药物物纸片的直径片的直径 5mm5mm 以上者以上者为产ESBLsESBLs菌。菌。ESBLs的底物的底物ESBLs的抑制剂的抑制剂(1)纸片确证试验：纸片确证试验：第57页，讲稿共75张，创作于星期一58混合克拉维酸药物纸片混合克拉维酸药物纸片无无克拉维酸克拉维酸药物纸片药物纸片的直径的直径直径差直径差5 mm：ESBL第58页，讲稿共75张，创作于星期一59 筛选试验：n选用用头孢泊泊肟、头孢他他啶、氨曲南、氨曲南、头孢噻肟或或头孢曲曲松至少松至少2种以上，种以上，n用用标准肉准肉汤稀稀释法稀法稀释至至1g/ml,n凡被凡被测菌在上述各管中

32、能菌在上述各管中能够生生长(MIC2g/ml)，高，高度度怀疑疑为ESBLs，应进一步作确一步作确认试验来加以确来加以确诊。（2）液体稀释法）液体稀释法第59页，讲稿共75张，创作于星期一60 确确认试验：n用用标准肉准肉汤稀稀释法法测定定MIC的方法的方法,n头孢噻肟单独稀独稀释(0.2564g/ml)及及 头孢噻肟(稀稀释范范围相同相同)加克拉加克拉维酸酸(每管每管4g/ml);头孢他他啶单独稀独稀释(0.25128g/ml)及及 头孢他他啶加克拉加克拉维酸酸(每管每管4g/ml),上述上述2种种药物必物必须同同时进行行试验,n结果加克拉果加克拉维酸和不加克拉酸和不加克拉维酸的酸的 MIC

33、差差值8倍倍(3个稀个稀释度度)，可确，可确认为ESBLs菌株。菌株。（2）液体稀释法）液体稀释法第60页，讲稿共75张，创作于星期一61二、细菌耐药基因检测二、细菌耐药基因检测n基因基因检测方法方法检测细菌耐菌耐药性的性的优缺点缺点n抗生素耐抗生素耐药性的基因性的基因检测方法方法n基因基因检测方法的方法的应用用第61页，讲稿共75张，创作于星期一62基因检测细菌耐药性的优点：基因检测细菌耐药性的优点：n能早期指能早期指导临床医生治床医生治疗用用药。分子分子遗传学方法可以直接从学方法可以直接从临床床标本入手，无需菌株本入手，无需菌株的培养，极大地的培养，极大地节省省时间，减减轻实验室生物危室生

34、物危险性。性。n有助有助鉴别那些那些处于中介水平或常于中介水平或常规药敏敏结果模棱两可的果模棱两可的结果。果。分子生物学方法被分子生物学方法被认为是是“金金标准准”。n在在细菌耐菌耐药性的流行病追踪性的流行病追踪调研中，耐研中，耐药基因基因检测比抗生素敏感方法更准确。比抗生素敏感方法更准确。n发现新的耐新的耐药基因。基因。第62页，讲稿共75张，创作于星期一63基因检测方法检测抗生素耐药性的缺点：基因检测方法检测抗生素耐药性的缺点：n当当样品中菌量很少品中菌量很少时，其敏感性会大大降低。，其敏感性会大大降低。n对每一个每一个测试的抗菌的抗菌药物，均需要物，均需要设计相相应的分子的分子检测方法，

35、一次只能方法，一次只能检测一种耐一种耐药机制。机制。n目前仍有目前仍有许多耐多耐药机制是未知的，无法机制是未知的，无法进行分子行分子检测。n耐耐药基因的基因的检测也会存在假阳性也会存在假阳性问题。n对许多耐多耐药基因的基因的检测方法，方法，目前目前还缺乏缺乏临床床对照研究以照研究以评价其准确性、重复性及价其准确性、重复性及临床床应用价用价值。第63页，讲稿共75张，创作于星期一64常见的细菌耐药相关基因举例常见的细菌耐药相关基因举例基基 因因耐药抗生素耐药抗生素细菌种类细菌种类基因大小基因大小bpbpAnt(4Ant(4）氨基糖苷类氨基糖苷类金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌473473antant

36、（6 6)-la )-la 氨基糖苷类氨基糖苷类粪肠球菌粪肠球菌470470mec Amec A内酰胺类内酰胺类金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌400400blaTEM blaTEM 一内酰胺类一内酰胺类大肠埃希菌大肠埃希菌424 424 cat Dcat D氯霉素氯霉素艰难杆菌艰难杆菌270270第64页，讲稿共75张，创作于星期一65耐药基因检测方法：耐药基因检测方法：n分子方法分子方法检测耐耐药基因的基基因的基础是是 PCR。n在在 PCR基基础上上发展的方法：展的方法：分子分子杂交、交、DNA序列分析，序列分析，基因微振列技基因微振列技术等。等。第65页，讲稿共75张，创作于星期一66PC

37、R-序列特异性引物扩增序列特异性引物扩增耐药基因耐药基因标标标标 本本本本提取提取提取提取DNADNAPCRPCR扩增目的扩增目的扩增目的扩增目的基因基因基因基因DNADNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳结果分析结果分析结果分析结果分析 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 耐药基因的的特耐药基因的的特异性引物异性引物n理想的靶序列理想的靶序列应当是耐当是耐药基因的基因的编码区域，而非区域，而非编码区外的区外的基因基因(如插入序列或启如插入序列或启动子序列子序列)。n特异性高，需要特异性高，需要设立阴性立阴性对照。照。第66页，讲稿共75张，

38、创作于星期一67基因芯片技术基因芯片技术n芯片制芯片制备：以玻璃片或硅片：以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡的方法将寡核苷酸片段或核苷酸片段或cDNAcDNA作作为探探针按按顺序排列在序排列在载体上。体上。n样品制品制备：生物：生物样品往往是复品往往是复杂的生物分子混合体，的生物分子混合体，须将将样品品进行提取、行提取、扩增，增，获取其中的蛋白取其中的蛋白质或或DNADNA、RNARNA，然后用，然后用荧光光标记，以提高以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。的灵敏度和使用者的安全性。n杂交反交反应：即：即荧光光标记的的样品与芯片上的探品与芯片上的探针进行反

39、行反应产生一系列生一系列信息的信息的过程。程。n信号信号检测和和结果分析：果分析：杂交反交反应后的芯片上各个反后的芯片上各个反应点的点的荧光光位置、位置、荧光光强弱弱经过芯片芯片扫描描仪和相关和相关软件可以分析件可以分析图像，将像，将荧光光转换成数据，即可以成数据，即可以获得有关生物信息。得有关生物信息。第67页，讲稿共75张，创作于星期一68结核菌耐药基因突变检测液芯结核菌耐药基因突变检测液芯第68页，讲稿共75张，创作于星期一69“细菌耐菌耐药监测网网”简介介n监测从住院、从住院、门诊病人分离的病人分离的细菌耐菌耐药状况。状况。n分析住院病人抗菌分析住院病人抗菌药物的使用情况和物的使用情况

40、和门诊药品的使品的使用情况。用情况。n系系统、连续地收集地收集资料，定量分析、料，定量分析、报告告抗菌抗菌药物敏感性、物敏感性、耐耐药性的性的发生和分布生和分布，为制定、制定、评估估诊疗指南，如指南，如经验性治性治疗方案、感染控制措施等，提供有用信息。方案、感染控制措施等，提供有用信息。第69页，讲稿共75张，创作于星期一70第70页，讲稿共75张，创作于星期一71网上细菌耐药检测检索网上细菌耐药检测检索第71页，讲稿共75张，创作于星期一72广东医学院附属医院细菌耐药性分析广东医学院附属医院细菌耐药性分析n2009年上半年我院细菌培养耐药性分析年上半年我院细菌培养耐药性分析n2009年上半年

41、全院各类标本主要病原菌的耐药年上半年全院各类标本主要病原菌的耐药性性 痰标本主要病原菌的耐药性痰标本主要病原菌的耐药性 尿标本主要病原菌的耐药性尿标本主要病原菌的耐药性 血液标本主要病原菌的耐药性血液标本主要病原菌的耐药性n多重耐药菌株医院感染监控制度多重耐药菌株医院感染监控制度？临床科室更加直观地对自己科室感染细菌？临床科室更加直观地对自己科室感染细菌的耐药性情况有直接的了解。的耐药性情况有直接的了解。某一科室某一科室 主要病原菌的耐药性主要病原菌的耐药性 某某类标本主要病原菌的耐药性类标本主要病原菌的耐药性 某一细菌的耐药情况某一细菌的耐药情况 细菌耐药性分析趋势细菌耐药性分析趋势第72页

42、，讲稿共75张，创作于星期一73细菌耐药细菌耐药 小结小结n举例说明抗菌药物的作用机制。举例说明抗菌药物的作用机制。n举例说明细菌耐药的生化机制。举例说明细菌耐药的生化机制。分析抗菌药物的作用及细菌对抗菌药物分析抗菌药物的作用及细菌对抗菌药物耐药的相关性。耐药的相关性。n简述简述内酰胺类抗生素的杀菌机制及细菌内酰胺类抗生素的杀菌机制及细菌对该类药物的耐药机制。对该类药物的耐药机制。BPPESBLs第73页，讲稿共75张，创作于星期一74n细菌细菌获得性耐药产生的机制获得性耐药产生的机制 基因突变，获得外源基因（，）基因突变，获得外源基因（，）n说明质粒、整合子、转座子在细菌耐药播散中说明质粒、整合子、转座子在细菌耐药播散中的作用。的作用。n药物敏感试验的意义、方法及特点。药物敏感试验的意义、方法及特点。n联合用药可能出现的结果联合用药可能出现的结果n质量控制质量控制n解释名词：解释名词：AST，MIC，MBC，S，R，I，Tn第74页，讲稿共75张，创作于星期一感感谢谢大大家家观观看看第75页，讲稿共75张，创作于星期一