真核生物基因组DNA提取、电泳.pptx

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1、1）取）取0.3ml抗凝血置于抗凝血置于1.5ml Eppendorf管中管中.2）加入）加入1ml STMT 溶液，充分混匀，静置溶液，充分混匀，静置5min，使，使其溶血。其溶血。3）9,000rpm,离心离心 3 分钟分钟(统一离心统一离心)。4）弃上清。弹管底重悬沉淀。弃上清。弹管底重悬沉淀。实验第一部分实验第一部分 裂解红细胞、蛋白酶裂解红细胞、蛋白酶K K消化消化注意事项：注意事项：离心时离心机内样品平衡后对称放置离心时离心机内样品平衡后对称放置加样器加样准确。加样器加样准确。第1页/共26页4）加）加 0.4ml生理盐水，悬浮细胞。生理盐水，悬浮细胞。5）9000rpm,离心离心

2、 3分钟分钟(统一离心统一离心)，弃上清，弹匀。，弃上清，弹匀。6）加）加460 l NE溶液，混匀。溶液，混匀。7）加）加30 l 10%SDS,迅速混匀。迅速混匀。8）加）加50 l 蛋白酶蛋白酶K(20mg/ml),混匀，混匀，置置50C水浴水浴1小时。小时。操作注意事项：操作注意事项：1、混匀时确认沉淀已被悬起。、混匀时确认沉淀已被悬起。2、注意、注意30ul、50ul加样体积准确。加样体积准确。实验第一部分实验第一部分 裂解红细胞、蛋白酶裂解红细胞、蛋白酶K K消化消化第2页/共26页核酸提取的主要步骤核酸提取的主要步骤课间介绍 真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步真核细胞基因组

3、在提取过程中一般有以下几步:1)1)破碎细胞破碎细胞2)2)去除蛋白质，糖类等等生物大分子去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞；由于真核细胞基因组较大，在纯化出的基因组较大，在纯化出的DNADNA的操作中应注意动作轻柔，的操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DNADNA的剪切，从而获得相对完整的的剪切，从而获得相对完整的DNADNA3)3)沉淀核酸沉淀核酸第3页/共26页乙醇沉淀SDS裂解蛋白酶K消化琼脂糖电泳PCRDNA提取步骤图解酚氯仿抽提第4页/共26页 二、各种试剂的作用二、各种试剂的作用 成分：

4、成分：S:Sugar 8%T:Triton X-100 1%M:MgCl2 0.5mM T:Tris-HCl 10mM(PH:8.0)作用：作用：用用Triton 细胞膜上打孔，裂解细胞。细胞膜上打孔，裂解细胞。从末梢血中提取从末梢血中提取DNA主要是从白细胞中提取。主要是从白细胞中提取。（而红细胞经过溶血处理后都已经裂解）。（而红细胞经过溶血处理后都已经裂解）。1、STMT 溶液：溶液：第5页/共26页作用：作用：a.阴离子型去污剂阴离子型去污剂阴离子型去污剂阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性使蛋白质变性 c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶

5、有抑制作用将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用成分：成分：N:NaCl 50mM E:EDTA.Na2 25mM(PH:8.0)作用：作用：金属离子螯合剂，抑制金属离子螯合剂，抑制DNase的活性的活性 (螯合螯合DNase发挥活性所需的发挥活性所需的2价阳离子价阳离子)。二、各种试剂的作用二、各种试剂的作用2、NE 溶液溶液：3、SDS：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 终浓度终浓度0.5%4、蛋白酶、蛋白酶K(或链霉蛋白酶或链霉蛋白酶)作用：作用：广谱蛋白酶，能在广谱蛋白酶，能在SDS和和EDTA的存在下保持很高的的存在下保持很高的活性，活性，降解蛋白质，将降解蛋白质，将降解蛋白质，将降解蛋

6、白质，将DNADNA游离。游离。游离。游离。第6页/共26页重蒸酚:酚的作用是变性蛋白质，而对DNADNA结构没有影响。无色 酚的氧化产物(如醌等,粉红色)破坏磷酸二脂键。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。TETE溶液 :Tris-HCl 10mM(pH:8.0)Tris-HCl 10mM(pH:8.0)EDTA.Na EDTA.Na2 2 1mM (pH:8.0)1mM (pH:8.0)作用：提供略碱的pHpH值，保证DNADNA溶于水相。在酸性条件下，DNADNA分配于有机相。8-8-羟基喹啉：0.1%0.1%黄色酚相指示剂 抗氧化剂作作用用：去去除除蛋蛋白白等等杂杂质质。酚酚对对蛋蛋白白

7、有有强强烈烈的的变变性性作作用用，可可使使样样品品中中的的蛋蛋白白质质变变性性，通通过过离离心心去去除除。为为防防止止其其对对后后续续实实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。5 5、TETE饱和重蒸苯酚：饱和重蒸苯酚：成分：成分：第7页/共26页氯仿作用：氯仿作用：a.a.a.a.氯仿的变性作用不如酚好，氯仿的变性作用不如酚好，但与酚共同但与酚共同但与酚共同但与酚共同/交替使用可交替使用可交替使用可交替使用可增强去蛋白效果增强去蛋白效果增强去蛋白效果增强去蛋白效果；b.b.氯仿有加速有机相和水相的分离、氯仿有加速有机相和水相的分离、氯仿有加速有机相和水

8、相的分离、氯仿有加速有机相和水相的分离、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；6 6、酚、酚/氯仿氯仿 7 7、氯仿、氯仿/异戊醇异戊醇 (24:1)(24:1)氯仿的作用：氯仿的作用：去除去除DNADNA水溶液中残留的微量酚。水溶液中残留的微量酚。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。第8页/共26页在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可

9、以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNADNADNADNA发生沉淀发生沉淀发生沉淀发生沉淀。9 9、无水乙醇、无水乙醇 ：作用：提供作用：提供单价阳离子单价阳离子。8 8、醋酸钠：、醋酸钠：3 3M NaAc pH:5.2M NaAc pH:5.2v核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。被变性。v最常用沉淀剂为最常用沉淀剂为1 1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，

10、如醋酸钠、酸钠、NaClNaCl、氯化锂、氯化钾等氯化锂、氯化钾等v常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等第9页/共26页1 1、加入加入580ul(580ul(等体积等体积)TE)TE饱和酚饱和酚,混匀混匀1 1min.10000rpm,2minmin.10000rpm,2min。(注意抽取下层酚相注意抽取下层酚相;轻柔混匀，避免轻柔混匀，避免DNADNA链断裂链断裂;);)实验第二部分、酚氯仿抽提实验第二部分、酚氯仿抽提DNADNA及乙醇沉淀及乙醇沉淀5 5、加入、加入2-2.52-2.5倍体积无水乙醇（约倍体积无水乙醇（约1 1m

11、lml）混匀后置混匀后置-70-70 沉淀沉淀10min10min。4 4、加入、加入1/101/10体积（约体积（约30ul30ul）醋酸钠于上醋酸钠于上清中充分混匀。清中充分混匀。3 3、将上层水相移至一新管中。加入将上层水相移至一新管中。加入500ul(500ul(等体积等体积)氯仿氯仿-异异戊醇，戊醇，同上条件同上条件离心、取上清。离心、取上清。2 2、将、将上层水相上层水相移至一新管中，加入移至一新管中，加入500ul(500ul(等体积等体积)酚酚/氯仿，氯仿，同上条件同上条件混匀、离心。混匀、离心。(注意要尽量抽尽，又不可吸起酚相注意要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。第10页/共26

12、页 注意事项：注意事项：1 1）本实验将用到的本实验将用到的TETE饱和重蒸苯酚、氯仿饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而是有机试剂，比水的比重大，而DNADNA溶解在水里，我溶解在水里，我们们总是取上清。总是取上清。；2 2）在在抽取完苯酚、氯仿等抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，有机试剂，不能将加样器不能将加样器平放或倒置平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，以防液体导流损坏加样器，加完样后立加完样后立即弃掉加样器头。即弃掉加样器头。3 3）基因组基因组DNADNA由于太大，非常容易受机械剪切而断由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组裂，因此，为了得

13、到完整的基因组DNADNA，尽量不要多尽量不要多次进行物理性操作。次进行物理性操作。第11页/共26页一定要充分充分溶解沉淀7、加入、加入10 l双蒸水，溶解沉淀，进行酶切电泳。双蒸水，溶解沉淀，进行酶切电泳。6、10,000 r/min离心离心5min，吸弃上清、滤纸条吸干内壁液体吸弃上清、滤纸条吸干内壁液体(勿触及勿触及勿触及勿触及DNADNA沉淀沉淀沉淀沉淀)，37孵箱干燥至沉淀变透明。孵箱干燥至沉淀变透明。蓝头蓝头黄头黄头滤纸条滤纸条(吸干内壁液体吸干内壁液体)观察观察DNA沉淀的颜色。沉淀的颜色。第12页/共26页实验第三部分、基因组实验第三部分、基因组DNA的酶切的酶切基因组基因组

14、DNA的酶切：的酶切：基因组基因组DNA 8 ul 10 x Buffer H 1 ul EcoR I(最后加入最后加入)0.6 ul 置置 37 保温保温 45 min。第13页/共26页酶切相关知识1、酶活性单位、酶活性单位 Unit（U）：）：1U:是指在是指在1小时小时内，适当温度下内，适当温度下(37C)，在，在50ul 反应体系中，反应体系中，将将1ug of lambda DNA(底物底物DNA)完全消化所需的酶量。完全消化所需的酶量。2、酶切体系：、酶切体系：10反应缓冲液反应缓冲液：提供内切酶反应最适提供内切酶反应最适 pH值及所需离子。值及所需离子。双蒸水：无细菌和其他酶类

15、污染。双蒸水：无细菌和其他酶类污染。BSA：100-200ug/ml，保护酶蛋白不失活。保护酶蛋白不失活。内切酶：含内切酶：含50%甘油，甘油，-20保存。保存。反应体积：一般根据底物反应体积：一般根据底物DNA的量来计算。反应体系中甘油浓度的量来计算。反应体系中甘油浓度应应5%。第14页/共26页1.Southern blot DNA水平基因结构分析的重要策略之一水平基因结构分析的重要策略之一.基因组基因组DNA酶切电泳后可以直接用于酶切电泳后可以直接用于Southern blot 转膜。转膜。2.构建基因组文库构建基因组文库3.PCR的模板的模板克隆表达基因克隆表达基因 分析基因一级结构的

16、变化分析基因一级结构的变化基因组基因组PCR产物的酶切电泳可以分析基因多态性；产物的酶切电泳可以分析基因多态性；利用内参法可以相对定量分析特定基因在基因组上的拷贝数。利用内参法可以相对定量分析特定基因在基因组上的拷贝数。提取模板提取模板DNADNA的常见目的的常见目的第15页/共26页实验第四部分、基因组实验第四部分、基因组DNADNA琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定 一、琼脂糖凝胶电泳原理一、琼脂糖凝胶电泳原理 DNA DNA分子在分子在 pH 8.0 pH 8.0 的电泳环境中，带负电荷，的电泳环境中，带负电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。在一定强度电场力的作用下，从负

17、极向正极迁移。电电泳泳样样品品载载体体琼琼脂脂糖糖是是一一种种线线性性多多糖糖聚聚合合物物，煮煮沸沸冷冷却却后后形形成成网网格格样样结结构构，电电泳泳中中起起分分子子筛筛作作用用。通通常常情情况况下下，分分子子量量大大的的DNADNA电电泳泳过过程程中中由由于于受受到到的的阻阻力力较较大大，泳泳动动速速率率较较慢慢，反反之之，分分子子量量较小的较小的DNADNA片段跑在前面。片段跑在前面。第16页/共26页二、二、琼脂糖凝胶电泳实验操作琼脂糖凝胶电泳实验操作1.1.制备琼脂糖凝胶电泳（制备琼脂糖凝胶电泳（制备琼脂糖凝胶电泳（制备琼脂糖凝胶电泳（1%1%1%1%）实验老师准备实验老师准备实验老师

18、准备实验老师准备第17页/共26页2.2.2.2.上样：上样：上样：上样：在样品中加在样品中加在样品中加在样品中加 2 2 2 23ul 63ul 63ul 63ul 6上样液，混匀，上样液，混匀，上样液，混匀，上样液，混匀，将样品将样品将样品将样品缓慢缓慢缓慢缓慢加入上样孔内加入上样孔内加入上样孔内加入上样孔内第18页/共26页三、琼脂糖凝胶电泳常用试剂三、琼脂糖凝胶电泳常用试剂上样液成份：上样液成份：1 10.25%0.25%溴酚蓝或溴酚蓝或/和和0.25%0.25%二甲苯青（样品指示剂）二甲苯青（样品指示剂）2 240%40%蔗糖蔗糖 或或 30%30%甘油（增加样品比重利于加样）甘油（

19、增加样品比重利于加样）电泳缓冲液：电泳缓冲液：TAE TAE 为例为例 T:Tris T:Tris碱碱 A:A:冰醋酸冰醋酸 E:EDTAE:EDTA 提供有一定缓冲能力的提供有一定缓冲能力的pHpH值值(8.0),(8.0),EDTAEDTA可抑制可抑制DNaseDNase 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）：染色剂）：染色剂 一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNADNA或或RNARNA 的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。致癌剂致癌剂致癌剂致癌剂第19页/共26页 线性线性DNADNA片断大小（片断大小

20、（kbkb）琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（%）5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0思考：思考：凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？四、四、琼脂糖凝胶的浓度琼脂糖凝胶的浓度第20页/共26页五、五、电泳仪的使用方法电泳仪的使用方法稳压稳压:电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。如箭头所示。如箭头所示。第21页/共26页六、预期结果六、预期结果 用内切酶酶切基因组，电泳结果用内切酶酶切基因组，电泳结果用内切酶酶切基因组，电泳结果用内切酶酶切基因

21、组，电泳结果可出现连续的、弥漫云雾状带，可出现连续的、弥漫云雾状带，可出现连续的、弥漫云雾状带，可出现连续的、弥漫云雾状带，称称称称 Smear Smear 带。带。带。带。识别识别识别识别 6bp6bp序列的内切酶，平序列的内切酶，平序列的内切酶，平序列的内切酶，平均每均每均每均每4096 4096 bpbp长度出现一次切割长度出现一次切割长度出现一次切割长度出现一次切割概率。概率。概率。概率。如果如果如果如果SmearSmear带密度比较均匀，说明酶切效果比较带密度比较均匀，说明酶切效果比较带密度比较均匀，说明酶切效果比较带密度比较均匀，说明酶切效果比较好，可用于好，可用于好，可用于好，可

22、用于Southern Blot Southern Blot 实验。实验。实验。实验。第22页/共26页1 2 3 4 5 Marker总DNA未酶切的基因组未酶切的基因组未酶切的基因组未酶切的基因组第23页/共26页思考题：思考题：思考题：思考题：1.1.1.1.本实验中所用到的各试剂的作用是什么本实验中所用到的各试剂的作用是什么本实验中所用到的各试剂的作用是什么本实验中所用到的各试剂的作用是什么?蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K,SDS,TE K,SDS,TE 饱和酚，氯仿饱和酚，氯仿饱和酚，氯仿饱和酚，氯仿,乙醇乙醇乙醇乙醇,EDTA,EDTA2.2.DNADNA提取过程中有哪些注意事项？提取过程中有哪些注意事项？提取过程中有哪些注意事项？提取过程中有哪些注意事项？第24页/共26页实验结束后整理实验台实验结束后整理实验台,值日生值日值日生值日!第25页/共26页感谢您的观看！第26页/共26页