毛细管电泳法精选PPT.ppt
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1、关于毛细管电泳法第1页,讲稿共54张,创作于星期二n第一节第一节 毛细管电泳概述毛细管电泳概述n第二节第二节 毛细管电泳基础理论毛细管电泳基础理论n第三节第三节 毛细管电泳仪毛细管电泳仪n第四节第四节 毛细管电泳类型毛细管电泳类型n第五节第五节 毛细管电泳的应用和进展毛细管电泳的应用和进展第2页,讲稿共54张,创作于星期二第一节第一节 毛细管电泳概述毛细管电泳概述n毛细管电泳(毛细管电泳(CECE),),又称高效毛细管电泳又称高效毛细管电泳,是近年来,是近年来发展最快的高效分离分析技术之一。发展最快的高效分离分析技术之一。该技术是现代微该技术是现代微柱分离技术和经典电泳技术结合的产物,柱分离技
2、术和经典电泳技术结合的产物,是气相色是气相色谱谱(GC)(GC)、高效液相色谱、高效液相色谱(HPLC)(HPLC)等常用分离技术的重等常用分离技术的重要补充,要补充,在诸多研究领域得到了人们广泛的接受和认在诸多研究领域得到了人们广泛的接受和认可。可。第3页,讲稿共54张,创作于星期二一、毛细管电泳发展历程n18081808年,俄国物理学家年,俄国物理学家 Pence Pence 发现电泳现象。发现电泳现象。n19371937年,瑞典年,瑞典TiseliusTiselius将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间,两端施以电压进行自由溶液电泳,发现样品的迁移之间,两端施
3、以电压进行自由溶液电泳,发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定速度和方向由其电荷和淌度决定,第一次从人血清提取的蛋第一次从人血清提取的蛋白质混合液中分离出白蛋白和白质混合液中分离出白蛋白和、球蛋白,但分离效球蛋白,但分离效率低;率低;n19811981年,年,JorgensonJorgenson在在75m75m毛细管内施加毛细管内施加300 V/cm300 V/cm的高强度电的高强度电场,获得了理论塔板数超过场,获得了理论塔板数超过400,000 plates/m400,000 plates/m的高分离效率,的高分离效率,轰动了整个分离界,成为轰动了整个分离界,成为CECE划时代里程碑划时
4、代里程碑n19891989年,毛细管电泳仪问世。年,毛细管电泳仪问世。n19891989年,第一届年,第一届CECE国际会议的召开,标志着一门新的分析技国际会议的召开,标志着一门新的分析技术的产生。术的产生。第4页,讲稿共54张,创作于星期二二、毛细管电泳的特点二、毛细管电泳的特点n(1)(1)高效:每米理论塔扳数低则十几万,高则几百万甚至上高效:每米理论塔扳数低则十几万,高则几百万甚至上千万;千万;n(2)(2)快速:可在十几分钟甚至几十秒内完成分离;快速:可在十几分钟甚至几十秒内完成分离;n(3)(3)低样品消耗:只需纳升甚至皮升级样品量;低样品消耗:只需纳升甚至皮升级样品量;n(4)(4
5、)低成本分析:只需低廉的分离毛细管和少量的运行缓低成本分析:只需低廉的分离毛细管和少量的运行缓冲液;冲液;CE是现代微柱分离和经典电泳技术有机结合的产物,具有较HPLC和平板凝胶电泳更多的优点:第5页,讲稿共54张,创作于星期二n(5)(5)高度自动化:高度自动化:CECE是目前自动化程度最高的分离分析方法之是目前自动化程度最高的分离分析方法之一;一;n(6)(6)洁净:通常用水溶性缓冲液,对人体和环境无害;洁净:通常用水溶性缓冲液,对人体和环境无害;n(7)(7)多分离模式:可根据需要在同一仪器上选用不同的样多分离模式:可根据需要在同一仪器上选用不同的样品分离模式;品分离模式;n(8)(8)
6、应用范围广:具有应用范围广:具有“万能万能”分析的功能和潜力,既可以分析的功能和潜力,既可以分析无机离子、氨基酸、药物等小分子,又可以分析蛋分析无机离子、氨基酸、药物等小分子,又可以分析蛋白质等生物大分子白质等生物大分子,甚至整个细胞和各种微粒。甚至整个细胞和各种微粒。第6页,讲稿共54张,创作于星期二第二节 毛细管电泳基础理论+第7页,讲稿共54张,创作于星期二一、电泳流一、电泳流n电泳电泳:在电解质溶液中,位于电场中的带电离子在电解质溶液中,位于电场中的带电离子在电场力的作用下,以不同的速度向其所带电荷在电场力的作用下,以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。相反的电极方向迁移的
7、现象。n电泳时,不同离子在电场中具有不同的定向迁移电泳时,不同离子在电场中具有不同的定向迁移速度,速度,迁移速度与哪些因素有关?迁移速度与哪些因素有关?淌度淌度():单位电场下的电泳速度。:单位电场下的电泳速度。绝对淌度绝对淌度:在无限稀释溶液中测得的淌度。:在无限稀释溶液中测得的淌度。有效电泳淌度有效电泳淌度:在实际溶液中测得的淌度。:在实际溶液中测得的淌度。+第8页,讲稿共54张,创作于星期二n电场强度电场强度:与所施加的电压成正比,与两电极间的距离(与所施加的电压成正比,与两电极间的距离(L)成反比)成反比 E=V/Ln电场力电场力:在溶液中,电场对带电离子作用力(在溶液中,电场对带电离
8、子作用力(F F)的大小等于带电离子所带的净电荷)的大小等于带电离子所带的净电荷(q q)与电场强度的乘积:)与电场强度的乘积:F=qEn在电泳迁移过程中,介质粘滞力在电泳迁移过程中,介质粘滞力(F F)必然会阻碍离子的迁移。必然会阻碍离子的迁移。n粘滞力的大小与离子大小、形状、缓冲液粘度、甚至电泳介质孔径均有关系,与带电离子的粘滞力的大小与离子大小、形状、缓冲液粘度、甚至电泳介质孔径均有关系,与带电离子的移动速度更是直接相关。移动速度更是直接相关。对于对于球形分子球形分子F的大小服从的大小服从Stokes定律:定律:F=6ref :缓冲液粘度;:缓冲液粘度;r:球形分子的半径;:球形分子的半
9、径;ef:离子在电场中的迁移速度。:离子在电场中的迁移速度。第9页,讲稿共54张,创作于星期二当带电离子以速度当带电离子以速度 在电场中移动时,受到大小相等、方向相反的电场驱动力在电场中移动时,受到大小相等、方向相反的电场驱动力和平动摩擦阻力的作用,此时和平动摩擦阻力的作用,此时F=F故:qE=6ref则离子在电场中的迁移速度:则离子在电场中的迁移速度:即带电离子的电泳迁移速率(或称电泳淌度)即带电离子的电泳迁移速率(或称电泳淌度):由此可知,球形带电离子的迁移率,主要取决于自身状态,即与其所带电量成由此可知,球形带电离子的迁移率,主要取决于自身状态,即与其所带电量成正比,与其半径及介质粘度成
10、反比。正比,与其半径及介质粘度成反比。电泳过程中正是利用带电离子电泳迁移速电泳过程中正是利用带电离子电泳迁移速度或迁移速率的差异来实现分离的。度或迁移速率的差异来实现分离的。第10页,讲稿共54张,创作于星期二二、电渗流二、电渗流n在高电场的作用下,带正在高电场的作用下,带正电荷的溶液表面及扩散层电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动,由于这些向阴极移动,由于这些阳阳离子实际上是溶剂化的离子实际上是溶剂化的,故将引起柱中的溶液整故将引起柱中的溶液整体向负极移动,形成电体向负极移动,形成电渗流。渗流。n n石英毛细管柱,内壁大约有石英毛细管柱,内壁大约有石英毛细管柱,内壁大约有石英毛细管柱,内壁大约有
11、8.31 mol/m2 2的硅醇基(的硅醇基(Si-Si-OHOH),其),其),其),其等电点约为等电点约为等电点约为等电点约为1.5,内充液,内充液pH3时,表面电离成时,表面电离成SiO-,管内壁带负电荷,形成双电层。管内壁带负电荷,形成双电层。第11页,讲稿共54张,创作于星期二1.CE1.CE中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向 电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度表示。电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度表示。(1 1)电渗流的大小)电渗流的大小n电渗流的大小与电场强度、电渗流的大小与电场强度、ZataZata电势及缓冲液介电常数电势及缓冲液介电常数有关,某一电泳体系内电渗流的具体
12、数值可以用有关,某一电泳体系内电渗流的具体数值可以用Helmholtz-Smoluchowski 公式计算:公式计算:式中,为电渗速度;为电渗淌度(EOF mobility);为双电层的Zeta电位;为缓冲液介电常数;为电解液粘度;V为所施加的电压;为毛细管总长度。第12页,讲稿共54张,创作于星期二n在具体实验中在具体实验中,可根据需要选用不同的中性组分作为标记物,可根据需要选用不同的中性组分作为标记物(N,N-N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、苯酚、丙酮等二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、苯酚、丙酮等),),测定不同缓冲条件下中性标记物的迁移时间,按下述公式测定不同缓冲条件下中性标记物
13、的迁移时间,按下述公式计算出电渗率:计算出电渗率:其中,t:中性标记物的迁移时间,ldet为毛细管电泳有效长度,ltot为毛细管电泳有效长度。第13页,讲稿共54张,创作于星期二(2 2)CECE中电渗流的方向中电渗流的方向n石英毛细管带负电荷,溶液带正电荷,电渗流石英毛细管带负电荷,溶液带正电荷,电渗流流向阴极;流向阴极;n改变电渗流方向的方法:改变电渗流方向的方法:毛细管改性:毛细管改性:表面键合阳离子基团;表面键合阳离子基团;加电渗流反转剂加电渗流反转剂:内充液中加入大量的阳离子表面活性剂,将使石英毛细管壁带正电荷,溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。第14页,讲稿共54张,创作于星期二2
14、 2.CECE中电渗流的流形中电渗流的流形n n液相色谱中的溶液流动为层流,液相色谱中的溶液流动为层流,抛物线流型抛物线流型抛物线流型抛物线流型,管壁处流管壁处流管壁处流管壁处流速最慢,管中心处的速度为平均速度的速最慢,管中心处的速度为平均速度的速最慢,管中心处的速度为平均速度的速最慢,管中心处的速度为平均速度的2 2倍(引起谱带展宽倍(引起谱带展宽倍(引起谱带展宽倍(引起谱带展宽较大)。较大)。较大)。较大)。n n在毛细管电泳中,电荷均匀分布,整体移动,在毛细管电泳中,电荷均匀分布,整体移动,电渗流的电渗流的电渗流的电渗流的流动为平流流动为平流流动为平流流动为平流,塞式流动塞式流动(谱带展
15、宽很小),故柱效较高。(谱带展宽很小),故柱效较高。(谱带展宽很小),故柱效较高。(谱带展宽很小),故柱效较高。第15页,讲稿共54张,创作于星期二3 3.CECE中电渗流的作用中电渗流的作用n电渗流的速度一般约等于离子电泳速度的电渗流的速度一般约等于离子电泳速度的5 57 7倍;倍;n各种电性粒子在毛细管柱中的迁移速度为:各种电性粒子在毛细管柱中的迁移速度为:阳离子迁移速度阳离子迁移速度 =电渗流电渗流+电泳流,阳离子运动速度快于电渗流;电泳流,阳离子运动速度快于电渗流;阴离子迁移速度阴离子迁移速度 =电渗流电渗流电泳流,阴离子运动速度慢于电渗流;电泳流,阴离子运动速度慢于电渗流;中性粒子迁
16、移速度中性粒子迁移速度 =电渗流,中性粒子运动速度与电渗流一致。电渗流,中性粒子运动速度与电渗流一致。nCECE中电渗流的作用:中电渗流的作用:可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离;可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离;改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性电渗流的微小变化影响结果的重现性;电渗流的微小变化影响结果的重现性;在在CECE中,控制电渗流非常重要中,控制电渗流非常重要。+第16页,讲稿共54张,创作于星期二4.CE4.CE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素(1 1)电场强度的影响)电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比
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