植物基因工程技术及应用精选PPT.ppt
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1、关于植物基因工程技术及应用第1页,讲稿共65张,创作于星期二转基因植物 种植的转基因植物种类主要有大豆(占54)、玉米(占28)、棉花(占9)、油菜(占9),马铃薯、西葫芦和木瓜的比例都小于1。按转基因植物的性状划分,抗除草剂占71,抗虫占22,抗虫兼抗除草剂占7,抗病毒和其他性状转基因植物的比例小于1。至1999年,农业部批准可进行商业化生产的国内研制的转基因植物有5种,它们分别是:抗虫棉花、改变花色的矮牵牛、延熟番茄、抗病毒的甜椒和番茄。第2页,讲稿共65张,创作于星期二(一)转基因植物发展进程与规模(一)转基因植物发展进程与规模v19831983年,首批转基因作物(烟草、马铃薯)问世。年
2、,首批转基因作物(烟草、马铃薯)问世。v19861986年,首批转基因作物(抗虫、抗除草剂)进入田间实验,年,首批转基因作物(抗虫、抗除草剂)进入田间实验,美国和法国同时对抗除草剂转基美国和法国同时对抗除草剂转基因烟草进行了田间试验因烟草进行了田间试验v1992年,中国首先在大田种植转基因抗病毒烟草,揭开了全球转基因作物商业化的序幕。年,中国首先在大田种植转基因抗病毒烟草,揭开了全球转基因作物商业化的序幕。v19941994年,美国转基因作物产品(耐储存番茄年,美国转基因作物产品(耐储存番茄Flavor Savor)进入市场。)进入市场。v1994年,商品化种植抗黄瓜花叶病毒(年,商品化种植抗
3、黄瓜花叶病毒(CMV)和抗烟草花叶病毒()和抗烟草花叶病毒(TMV)双价的转基因烟草)双价的转基因烟草v19961996年后,转基因作物的产业化得到迅速发展。年后,转基因作物的产业化得到迅速发展。v同时带有八种基因代码的转基因玉米将于同时带有八种基因代码的转基因玉米将于20102010年在美国问世。年在美国问世。第3页,讲稿共65张,创作于星期二v19981998年,全世界共有年,全世界共有 70007000万英亩大万英亩大田种植转基因作物。田种植转基因作物。v19991999年又增至年又增至 98609860万英亩,年增长率万英亩,年增长率超过超过 40%40%。v20002000年年增长率
4、突降至年年增长率突降至 10.8%10.8%,其中美,其中美国的降幅最大。国的降幅最大。2009年2月24日统计种植面积排名前三位的国家分别为,美国(6250万公顷)、阿根廷(2100万公顷)和巴西(1580万公顷)。中国全国生物技术作物种植面积达380万公顷,在全球生物技术作物种植面积超过100万公顷的八个国家中排名第六种植面积排名前十的国家,依次是美国、阿根廷、巴西、加拿大、印度、中国、巴拉圭、南非、乌拉圭、菲律宾。第4页,讲稿共65张,创作于星期二商业化种植转基因作物的国家数商业化种植转基因作物的国家数商业化种植转基因作物的国家数商业化种植转基因作物的国家数年份国家数第5页,讲稿共65张
5、,创作于星期二(亿亿美美元元)国际农业生物技术应用跟踪调查服务处(国际农业生物技术应用跟踪调查服务处(ISAAA)的估计,全球)的估计,全球转基因产品的市场:转基因产品的市场:转基因产品市场现状与展望转基因产品市场现状与展望转基因产品市场现状与展望转基因产品市场现状与展望第6页,讲稿共65张,创作于星期二美国是转基因食品的发源地,也是当今世界转基因食品生产和出口最多的国家。1983年,全球第一个转基因农作物马铃薯就诞生在美国。据估计,目前美国的零售食品中有60%以上含有转基因成分,90%以上的大豆、50%以上的玉米、小麦是转基因的。第7页,讲稿共65张,创作于星期二采用现代生物技术手段,培育出
6、一批优质、专用、高产、多抗农作物新品种。转基因技术与产业化快速发展,我国已成为世界第五大转基因植物种植国家,2006年,我国棉花种植面积8095万亩,其中生物技术棉花种植面积已超过总面积的75%,河北、山东、河南、安徽等棉花主产省的国产生物技术棉花种植率已达到100%,棉花单产达到80千克/亩的历史高水平,增幅为6.3%-7.0%,棉花总产量达650万吨,创历史新高,且棉花品质普遍看好。通过数字农业技术的应用,大幅度提高了示范区农业信息化和现代化管理水平,加速了利用高新技术改造传统农业的步伐。第8页,讲稿共65张,创作于星期二1.提取DNA(二)转基因技术有SDS法和CTAB法,常采用CTAB
7、法提取方法基因组DNA。并用分光光度计测定浓度和质量。然后用去离子水将其稀释至50nguL-1备用叶片加液氮,快速研磨成粉末DNA提取缓冲液2CTAB,充分混匀60水浴45-60min,其间轻柔摇匀2-3次冷却至室温,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)轻柔且充分混匀,静置10min12000rpm离心10min取上清,加入0.7倍体积的冷异丙醇,轻柔摇动离心管充分混匀,室温放置10-20min10000rpm离心10min小心弃去上清,加入70%的乙醇洗涤2次沉淀,室温下微干,溶于适量TE缓冲液DNA检测用0.8%的琼脂糖胶第9页,讲稿共65张,创作于星期二15000bp1000bp250bp
8、第10页,讲稿共65张,创作于星期二(1)获得目的基因方法从生物基因组群体中分离目的基因采用限制性内切酶切割2.获得目的基因第11页,讲稿共65张,创作于星期二DNA 1g缓冲液缓冲液 2L重蒸水重蒸水酶液酶液+用手指轻弹管壁使溶液混匀,使溶液集中在管底用手指轻弹管壁使溶液混匀,使溶液集中在管底混匀反应体系后,混匀反应体系后,37水浴保温水浴保温2-3h电泳检测电泳检测EP管编号管编号,加样加样操作步骤操作步骤第12页,讲稿共65张,创作于星期二化学合成目的基因DNA片段采用DNA合成仪PCR(聚合酶链式反应)合成DNA常用的方法第13页,讲稿共65张,创作于星期二PCR过程示意图第14页,讲
9、稿共65张,创作于星期二第15页,讲稿共65张,创作于星期二第16页,讲稿共65张,创作于星期二mRNA差异显示法获得目的基因基因在细胞中的特异表达与否,决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期的调节、细胞衰老和死亡等。用于分离特异表达的基因。用机械的方法如超声波把基因组打成片段。(2)PCR获得目的基因 设计引物 在NCBI(美国国立生物技术信息中心)http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/引物设计软件Primerprimer5.0设计引物,然后合成引物。第17页,讲稿共65张,创作于星期二PCR反应混合液反应混合液扩增条件:扩增条件:9460s,3760s,72120s,共
10、共2530个循环。个循环。PCR第18页,讲稿共65张,创作于星期二特异片段的回收、连接与转化将扩增产物用1%琼脂糖凝胶(EB染色)在100V电压的电泳液中电泳40min在紫外灯下用刀片切取带有特异带的胶块,并把该胶块转移到1.5ml离心管中回收片段按照胶回收试剂盒进行目的片段与克隆载体的连接(pGEMTeasyvector或pMD18-T)在4条件下连接12h-16h采用热激法,将连接产物的转化转化至大肠杆菌的感受态细胞E.coliJM109将全部菌液涂于含Amp(X-gal为40l,IPTG为4l)的LB平板上,半小时后倒置37培养8-12h左右,可出现菌落第19页,讲稿共65张,创作于星
11、期二克隆的筛选与鉴定蓝白斑筛选重组子的PCR鉴定质粒的提取及质粒的酶切鉴定测序送生物技术公司,用DNA测序仪测序仪测序。序列比对在NCBI或者DNAman上进行比对,确认基因是否正确。第20页,讲稿共65张,创作于星期二第21页,讲稿共65张,创作于星期二3.构建植物表达载体(1)载体在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。按用途分为:克隆载体,表达型载体,克隆载体,表达型载体,克隆载体,表达型载体,克隆载体,表达型载体,分泌型载分泌型载分泌型载分泌型载体,穿梭载体等。体,穿梭载体等。体,穿梭
12、载体等。体,穿梭载体等。一是用它作为运载工具;利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制(称为克隆)。在宿主细胞中能保存下来并能大量复制;有多个限制酶切点,而且每种酶的切点最好只有一个,可适于多种限制酶切割的DNA插入;含有复制起始位点ori,能够独立复制;有一定的标记基因,便于进行筛选。载载体体必必须须具具有有四四个个条条件件第22页,讲稿共65张,创作于星期二能独立复制并稳定传能独立复制并稳定传代代:复制起始点复制起始点ori或自或自主复制序列主复制序列ARS和着和着丝粒丝粒,端粒端粒方便插入外源片段方便插入外源片段:酶酶切位点切位点选择标记选择标记:药物抗性药物抗性报告基因报告基因:插入
13、筛选插入筛选标记标记易分离提取易分离提取高产率(多拷贝)高产率(多拷贝)强启动子强启动子多宿主多宿主第23页,讲稿共65张,创作于星期二第24页,讲稿共65张,创作于星期二Transform+report gene substrates第25页,讲稿共65张,创作于星期二(1)转化方式根据所用载体类型以及转化对象不同一般有以下主要转化方式:(1)基因枪转化基因枪转化 (2)电转化电转化 (3)融合法)融合法 (4)花粉管转化)花粉管转化 (5)农杆菌介导)农杆菌介导4.高等植物基因的转化与植株再生第26页,讲稿共65张,创作于星期二(1 1)基因枪转化法基因枪转化法基因枪转化法基因枪转化法利用
14、基因枪的装置,将钨粉或金粉与利用基因枪的装置,将钨粉或金粉与DNADNA吸附制成吸附制成“子弹子弹”通过高压放电将通过高压放电将“子子弹弹”加速到加速到482m/s482m/s,在这种速度下,金属粒子能穿透植物细胞壁,击发一次可将,在这种速度下,金属粒子能穿透植物细胞壁,击发一次可将成千上万个带有外源成千上万个带有外源DNADNA的金属粒子同时射入完整的细胞或器官。的金属粒子同时射入完整的细胞或器官。优点:单子叶和双子叶都可使用优点:单子叶和双子叶都可使用缺点:成本高,操作麻烦,缺点:成本高,操作麻烦,的的DNADNA片段整合效率极低片段整合效率极低。通常只应用于单子叶。通常只应用于单子叶。第
15、27页,讲稿共65张,创作于星期二(2 2)电击法电击法电击法电击法 用用电电转转化化仪仪将将高高浓浓度度的的质质粒粒DNADNA加加入入到到植植物物细细胞胞的的原原生生质质体体悬悬浮浮液液中中,混混合合物物在在 200 200-600 600 V V/cm cm 的的电电场场中中处处理理若若干干秒秒钟钟,然然后后将将原生质体在组织培养基中生长原生质体在组织培养基中生长 1-2 1-2 周,再生出整株植物。周,再生出整株植物。第28页,讲稿共65张,创作于星期二(3 3)融合法融合法融合法融合法 将将外外源源DNADNA与与特特殊殊的的疏疏水水性性高高分分子子化化合合物物混混合合,在在水水中中
16、这这些些疏疏水水性性化化合合物物分分子子形形成成球球状状的的脂脂质质体体,后后者者与与植植物物细细胞胞原原生生质质体体融融合合,筛筛选选融融合合子,再生植物细胞壁。子,再生植物细胞壁。原生质体很难再生出整株植物。原生质体很难再生出整株植物。第29页,讲稿共65张,创作于星期二(4 4)花粉管导入法花粉管导入法花粉管导入法花粉管导入法 使使用用显显微微注注射射器器,将将外外源源DNADNA沿沿着着花花粉粉管管经经过过珠珠心心进进入入尚尚未未形形成成正正常常细细胞胞壁壁的的卵卵、合合子子或或早早期期胚胚胎胎细细胞胞中中,实实现现基基因因的的转转移移。是是由由我我国国科科学学家家周周光光宇宇首首先先
17、提提出出设设计计的的,目目前前已已应应用用于于水水稻稻、小小麦麦、棉棉花花、大大豆豆、花花生生、蔬蔬菜菜等等作作物的转基因研究,物的转基因研究,花花粉粉管管导导入入法法的的特特点点是是直直接接、简简便便。它它的的受受体体材材料料为为植植株株整整体体,省省略略了了细细胞胞组组织织培培养养的的诱诱导导和和传传代代过过程程,排排除除了了植植株株再再生生的的障障碍碍,特特别别适适合合于于难难以以建建立立有有效效再再生生系系统统的的植植物物。由由于于转转化化的的是是完完整整植植株株的的卵卵细细胞胞、受受精精卵卵或或早早期期胚胎细胞,导入的胚胎细胞,导入的DNADNA分子整合效率较高。分子整合效率较高。第
18、30页,讲稿共65张,创作于星期二(5 5)农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导农杆菌介导几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤,这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌根瘤,这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌(A.tumefaciensA.tumefaciens)感染所致,其致瘤特性是由该菌细胞内的野生)感染所致,其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒型质粒 TiTi介导的。介导的。第31页,讲稿共65张,创作于星期二二元整合转化程二元整合转化程二元整合转化程二元整合转化程序序序序将将外外源源基基因因克克
19、隆隆在在大大肠肠杆杆菌菌-农农杆杆菌菌穿穿梭梭质质粒粒的的T-DNAT-DNA区内;区内;重重组组质质粒粒直直接接转转化化农农杆杆菌菌株株,该该菌菌株株携携带带只只含含virvir区区不不含含T-DNAT-DNA区区的的TiTi辅辅助助质质粒;粒;第32页,讲稿共65张,创作于星期二(2)农杆菌介导外源基因转移技术的一般操作将表面消毒的叶片切成小块小块在过夜培养并稀释到一定浓度的含外源基因的根癌农杆菌液中共培养几分钟,使让根癌农杆菌感染叶片切块的伤口。从菌液中捞出小叶块,培养基中培养2天。在含头孢霉素选择培养基中筛选转化细胞。继续培养,转化的细胞分化出芽。将芽转入含有抗生素的生根培养基上,诱导
20、生根。将完整的转基因植株移栽到土壤中。第33页,讲稿共65张,创作于星期二abcd 第34页,讲稿共65张,创作于星期二分子鉴定:nPCRnSouthernblotnNorthernblotnWesternblotn蛋白质电泳5.转基因植株的鉴定及分析第35页,讲稿共65张,创作于星期二Southernblot第36页,讲稿共65张,创作于星期二Northernblot第37页,讲稿共65张,创作于星期二Westernblot和蛋白质电泳第38页,讲稿共65张,创作于星期二(三)转基因生物商业化的一般流程1.实验室试验环节:通过了实验室的试验,技术成熟之后才开始进行中间试验环节。2.中间试验环
21、节:这个环节在田间进行,一般需要两年左右的时间。田间的管理评价包括具体位置、与人群的距离、面积、隔离等多项具体规定。3.环境释放评价:需要两年。在这个环节试验可以再扩大一些面积,但也有很多要求,也必须在相对封闭的环境下进行。4.生产试验:生产试验的规模可以进一步扩大。本阶段的评价主要是评估转基因生物对环境是否有影响和压力。5.如果要做食品,需要再对独立性、致敏性、抗营养因子等进行评价,还需要提交综合性评价。”按照中国现行的批准流程,转基因商业化的批准有年限控制,一般时限是4年。4年到期后,需要重新报批。第39页,讲稿共65张,创作于星期二(四)种植转基因植物的风险性(四)种植转基因植物的风险性
22、 破坏生态环境和影响人类的健康。1.安全性问题转基因植物存在的用于选择性标记的抗生素,以及导入植物的DNA序列在加工过程中可能出现的改变。2.环境及生态问题导入植物的目的基因是否转入其他植物,是否会破坏生态平衡。第40页,讲稿共65张,创作于星期二首先是毒性问题。一些研究学者认为,对于基因的人工提炼和添加,可能在达到某些人们想达到的效果的同时,也增加和积聚了食物中原有的微量毒素。其次是过敏反应问题。对于一种食物过敏的人有时还会对一种以前他们不过敏的食物产生过敏,比如:科学家将玉米的某一段基因加入到核桃、小麦和贝类动物的基因中,蛋白质也随基因加了进去,那么,以前吃玉米过敏的人就可能对这些核桃、小
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