河南科技大学大学生研究训练计划(SRTP)项目申请书-《RNbuka.pptx

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1、河科大大学生训练计划（SRTP）RNAi诱导tap mRNA降解对果蝇神经发育的影响成员：乔钰璐 丁劲峰 夏南飞 苏珂此项目意义何在？此项目意义何在？其研究对生命科学的研究有何作用？其研究对生命科学的研究有何作用？我们都知道原神经（proneural）基因表达催生并确定神经前体细胞，神经前体细胞经增殖分化才形成神经系统，因此原神经基因对神经发生有决定性作用。原神经基因最先从果蝇中发现，后被证实为bHLH基因。接着人们又在各类脊锥动物发现更多的bHLH基因，其neurogenin（ngn)基因就是其中的一种，而ngn果蝇直系同源蛋白Tap的功能至今未知。目前对ngn基因的研究组要集中在ngn基因

2、表达模式的检测，以及制备ngn突变体以及观察其突变表型，但对ngn基因本身的调控和被调控机制涉及甚少，因此对tap基因的功能及调控的研究将对ngn基因的相关研究具有重要的意义。一.tap基因克隆，制备相应RNAi构建PCR扩增五要素（一）引物（二）模板（三）Mg2+（四）taq聚合酶（五）四种dNTPPart1 引物的获得首先我们应该清楚，我们研究的是黑腹果蝇（drosophila melanogaster）的tap基因，所以我们应该在the website of pubmed上找出tap的完整基因序列。然后在the website of ORF finder上找出the sequence o

3、f ORF of tap上方为DNA序列，下方为其所对应的氨基酸。由于tap基因为bHLH模式基因，对比文献可得到该模式的基因序列。将得到的部分DNA序列放入primer3软件中得到该序列的引物Left primerLeft primer 5 5tcgatacgagcagcaatcac3tcgatacgagcagcaatcac3 Right primerRight primer 5 5atcttcaccacttgggttgg3atcttcaccacttgggttgg3正向GactagtCtcgatacgagcagcaatcacCtgatcaGagctat gctcgtcgttagtg atct

4、tcaccacttgggttggCTAgctagcTAGtagaagtggtgaacccaaccGATcgatcgATCatgtacttcaag:53SpeIAvrII反向atcttcaccacttgggttggGAGccatggGAGtcgatacgagcagcaatcacGCagatctCG GCagatctCG cactaacgacgagcatGAGcctaggGAGggttgggttcaccacttctacttgaagtacat:35NheIXbaItaptap knockdown by RNAi knockdown by RNAiExpressed in flyRNase machi

5、neryRNAi constructDouble stranded mRNA hairpinSmall interfering RNAs(siRNA)TranscriptionTarget genemRNADegradationNo translation Third:RNAiThird:RNAi构建构建首先在flybase网站上找了一个适合我们用的vector（pWIZ vector）在上面上有四个酶切位点（They are unique in pWIZ），分别为SpeI、AvrII、NheI、XbaI,由于我们所克隆的基因序列无这些酶的酶切位点，所以我们应该在引物上加上这些酶的酶切位点(P

6、WIZ vector如图）四种限制性内切酶的序列Spe AvrNhe Xba 引物加上酶切位点以及保护碱基以后引物加上酶切位点以及保护碱基以后：引物设计共两种：引物设计共两种：第一种：第一种：LP:LP:GactagtCGactagtCtcgatacgagcagcaatcactcgatacgagcagcaatcac RP:RP:ggatccggatccatcttcaccacttgggttgg(?)atcttcaccacttgggttgg(?)第二种：第二种：LP:LP:GCtctagaGCGCtctagaGCtcgatacgagcagcaatcactcgatacgagcagcaatcac RP

7、:RP:CTAgctagcTAGCTAgctagcTAGatcttcaccacttgggttggatcttcaccacttgggttggPart2.模板的获得 果蝇DNA的提取和纯化果蝇DNA的提取和纯化实验原理：使用消化缓冲液使DNA从细胞内释放出来，65度温育可以加速DNA溶解，酚氯仿异戊醇抽提可以将蛋白质与DNA分离，冷的异丙醇沉淀DNA，70的乙醇洗去DNA表面的残留有机溶剂。酚酚-氯仿抽提法氯仿抽提法提取组织提取组织组织匀浆组织匀浆水相水相(DNA,RNA)絮状沉淀絮状沉淀(DNA,少量蛋白质少量蛋白质,RNA)DNA消化缓冲液消化缓冲液苯酚苯酚-氯仿氯仿离心离心离心离心离心离心氯仿

8、氯仿-异戊醇异戊醇5mol/L NaCl冰无水乙醇冰无水乙醇75%乙醇乙醇TE1.消化缓冲液消化缓冲液0.1mol/L NaCl1%SDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）10mmol/L Tris-HCl pH8.01mmol/L EDTA pH8.0阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。抑制抑制DNA酶活性酶活性pH值适宜值适宜DNA游离游离至水相，避免降解。至水相，避免降解。苯酚苯酚-氯仿（氯仿（3:1，V:V

9、）Tris-HCl 饱和饱和操操作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下层试剂作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下层试剂。苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除水溶液中的蛋白苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除水溶液中的蛋白质，使其变性后沉淀。质，使其变性后沉淀。氯仿氯仿-异戊醇（异戊醇（24:1，V:V）经酚氯仿试剂第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是经酚氯仿试剂第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性残余的蛋白质，同时一起将酚带走。互溶的，可用氯仿第二次变性残余的蛋白质，同时一起将酚带走。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡

10、沫产生。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定下层有机溶剂相维持稳定 75%乙醇乙醇洗涤作用，去除残余的金属离子。同时，保护洗涤作用，去除残余的金属离子。同时，保护DNA完整性，避免降解；完整性，避免降解；抑制核酸酶活性。抑制核酸酶活性。TE缓冲液缓冲液TE缓冲液是缓冲液是Tris+EDTA缓冲液，一般用作溶解剂或保持剂，主要是缓冲液，一般用作溶解剂或保持剂，主要是调控调控pH。TE缓冲液是弱碱性缓冲液是弱碱性,对对DNA的碱基有

11、保护性。的碱基有保护性。DNA在在TE提供的环境提供的环境中稳定性较好中稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂。包括提取好的不易破坏其完整性或产生开环及断裂。包括提取好的DNA也要放在也要放在TE缓冲液中保存。缓冲液中保存。实实验材验材料料 新新鲜存活的果蝇或鲜存活的果蝇或2020冻存冻存1h1h的果蝇个体的果蝇个体5 51010个。个。实实验仪器及用具验仪器及用具器具：玻璃棒、烧杯、离心管、量筒、器具：玻璃棒、烧杯、离心管、量筒、分析天平、水浴锅、台式高速离心机、分析天平、水浴锅、台式高速离心机、44冰箱、长玻璃吸管、微量加样器、枪冰箱、长玻璃吸管、微量加样器、枪头、紫外分析仪、琼脂糖

12、电泳装置。头、紫外分析仪、琼脂糖电泳装置。药药品和试品和试剂剂酚（酚（Tris饱和酚）、氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠饱和酚）、氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris 碱、乙二胺四乙酸（碱、乙二胺四乙酸（EDTA）、异丙醇。）、异丙醇。溶溶液配制液配制：消化缓冲液消化缓冲液：含含100mM100mM的的NaclNacl，10mM Tris.cl10mM Tris.cl（PH8.0PH8.0）,25mM,25mM的的EDTAEDTA（PH8.0PH8.0）,0.5,0.5的的SDSSDS。TETE缓冲液缓冲液（PH8.0PH8.0）：含）：含10mM Tris.cl10mM Tris.c

13、l（PH8.0PH8.0）,1mM,1mM的的EDTAEDTA（PH8.0PH8.0）。）。电泳缓冲液电泳缓冲液TAETAE：电泳缓冲液（电泳缓冲液（50TAE50TAE）：取）：取Tris24.2g Tris24.2g，冰醋酸，冰醋酸 5.7ml5.7ml，0.25mol/L EDTA 0.25mol/L EDTA(pH8.0)20ml(pH8.0)20ml，加蒸馏水至，加蒸馏水至 100ml100ml。1TAE 1TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。0.70.7琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶的配制：称取的配制：称取0.28g0.28g琼脂糖，加入琼脂糖

14、，加入40ml 1TAE40ml 1TAE，于电炉上加热至沸，于电炉上加热至沸腾，待凝胶冷却至腾，待凝胶冷却至5050左右（手试微烫），加入左右（手试微烫），加入3l 3l GoldViewTWGoldViewTW荧光染料荧光染料，混匀后将，混匀后将胶倒入插好梳子的制胶板上，冷却后备用。胶倒入插好梳子的制胶板上，冷却后备用。实实验步验步骤骤1 1）取取6 6只麻醉的果蝇（让乙醚挥发干净）放入只麻醉的果蝇（让乙醚挥发干净）放入1.5ml1.5ml离心管中，加入消化离心管中，加入消化缓冲液缓冲液30l30l，用，用200l Tip200l Tip枪头迅速捣碎。枪头迅速捣碎。2 2）补加消化缓冲液补

15、加消化缓冲液400l400l，混匀，置，混匀，置6565温浴温浴3030分钟每分钟每1010分钟摇荡一次，分钟摇荡一次，以使样品被充分消化。以使样品被充分消化。3 3）取出离心管加入取出离心管加入400l400l酚，酚，400l400l氯仿：异戊醇（氯仿：异戊醇（2424：1 1）的混合物，）的混合物，盖紧管盖，上下颠倒充分混匀，抽提样品盖紧管盖，上下颠倒充分混匀，抽提样品5ml,12000rpm5ml,12000rpm离心离心5 5分钟。分钟。4 4）小心吸取上清转移至新的离心管中。加入小心吸取上清转移至新的离心管中。加入400l400l异丙醇，轻轻混匀异丙醇，轻轻混匀3min3min，此时

16、可见白色线团状物质出现，此时可见白色线团状物质出现。5 5）14000rpm14000rpm离心离心1010分钟，让线团状物质沉到管底或管壁，小心倒出液体。分钟，让线团状物质沉到管底或管壁，小心倒出液体。6 6）用用400l 75400l 75的乙醇洗涤沉淀，的乙醇洗涤沉淀，12000rpm12000rpm离心离心5min,5min,倒掉乙醇，倒置倒掉乙醇，倒置晾干至乙醇味道消失，沉淀用晾干至乙醇味道消失，沉淀用50l TE 50l TE 缓冲液溶解。（此时得到的白色缓冲液溶解。（此时得到的白色线状物即为线状物即为DNA.DNA.7)7)取完全溶解后的取完全溶解后的DNADNA原液进行原液进行

17、1:1001:100稀释，即稀释，即1 1l l原液原液 +99+99l l水，混水，混匀。匀。取完全溶解后的取完全溶解后的DNA原液进行原液进行1:100稀释，稀释，即即1l原液原液 +99l水，混匀。水，混匀。紫外分光光度计检测：紫外分光光度计检测：A260=?A280=?DNA纯度鉴定纯度鉴定A260/A280 1.6 1.8 2.0酚、蛋白质污染酚、蛋白质污染视为纯度较视为纯度较高的高的DNARNA污染污染注意事项l 组织抽提前应保存于液氮中，以免组织抽提前应保存于液氮中，以免DNA受到破坏；纯受到破坏；纯化时应时刻注意抑制核酸酶的污染，使用化时应时刻注意抑制核酸酶的污染，使用EDTA

18、等防止等防止DNA降解。降解。l 剧烈振荡可使剧烈振荡可使DNA断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢地颠倒混匀。地颠倒混匀。l 要获得高纯度要获得高纯度DNA，可加入蛋白酶，可加入蛋白酶K降解蛋白质。降解蛋白质。l DNA在在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有处有吸收峰。当纯度比值小于吸收峰。当纯度比值小于1.6时，应考虑进行再次纯化。时，应考虑进行再次纯化。l 整个实验须接触多种有毒、有腐蚀性试剂，故应注意操整个实验须接触多种有毒、有腐蚀性试剂，故应注意操作规范安全。作规范安全。Part3.PCR扩增及PCR产物的检测、纯化模板的

19、浓度应控制在100ng/100 l 引物浓度应控制在0.1-0.5 mol/LTaqDNA聚合酶应控制在0.5-2.5U/50 mol四种dNTP的浓度应相等Mg离子的浓度应控制在0.5-2.5mmol/L配置成相应的PCR反应液。然后放入PCR仪中扩增，最后将克隆的基因序列保存起来。PCR扩增PCR检测制胶配制配制2%凝胶凝胶100ml：称取琼脂糖称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入于三角瓶中，加入100ml0.5TBE（四溴乙烷）液，微（四溴乙烷）液，微波炉加热波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至度下降至60时，加

20、入终浓度时，加入终浓度0.5g/ml的的EB（溴化乙锭）液，充分（溴化乙锭）液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。混匀后倒板（注意排除气体）。加样和电泳加样和电泳 取取PCR反应液反应液510l，加入加入3l溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5TBE液，液，接通电源，使样品由负极向正极移动。接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约恒压电泳约30-60分钟。分钟。结果检测结果检测 将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，将凝胶板放在紫外透

21、射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光产物与荧光染料染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。PCR纯化利用提纯试剂盒对PCR产物进行提纯Part4.质粒重组质粒的选择由于要构建RNAi重组质粒，故要选择含有多个特殊酶切位点的质粒。有红眼标记基因酶切质粒的去磷酸化酶切质粒的去

22、磷酸化酶切质粒的去磷酸化酶切质粒的去磷酸化为了防止发生自连，提高连接效率，单酶切后，需要进行去磷为了防止发生自连，提高连接效率，单酶切后，需要进行去磷酸化。酸化。去磷酸方法如下：去磷酸方法如下：1）微量离心管中加入下列反应液，定容至50l:质粒DNA片段 1-20 pmol 10 Alkaline Phosphatase buffer 5l CIAP(10-30U/l)2l 无菌水 至50l 2）50反应30min；3）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提2次，氯仿/异戊醇（24：1）抽提1次；4）加0.1倍体积的3M NaAc，2.5倍体积的冷无水乙醇，-20 下30min-60min；5

23、）12000rpm 离 心10min，弃上清液，沉淀用70%冷乙醇200l洗涤一次，晾干；6）10l TE buffer 溶解沉淀。质粒及目的基因酶切位点的暴露反应体系：第一次：A：SpeI B:AvrII 第二次：A：XheI B:XbaI反应条件：温度37，酶切1.5h琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果紫外线投射仪观察结果UVP凝胶成像系统记录结果A1LB1L10H Buffer2LPwizDNA10L12L1g无菌水6L 4L总体积20L（无菌水补至总体积）质粒及目的基因的连接将SpeI 内切酶、AvrII内切酶、质粒放入试管1将SpeI 内切酶、AvrII内切酶目的基因放入试管2.在37摄氏度

24、的条件下，酶切1.5小时。将上述两管双酶切产物经过纯化，在 T4 DNA 连接酶作用下 16连接过夜。同理将NheI内切酶及XbaI内切酶以同样方法处理质粒及目的基因并将酶切产物连接。实验步骤：1、在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：1)10l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为11-15），补足ddH2O 至8l。2)轻轻混匀，稍加离心，于45水浴分钟使重新退火的粘端解链，迅速将混合物转入冰浴。3)加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补至10l。2、盖上管盖，充

25、分混匀，台式离心扣上离心秒。3、下过夜连接反应。4、反应结束后于保存。tips：1、连接反应的温度：连接酶的最适反应温度为，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是过夜。重组质粒导入大肠杆菌细胞重组质粒导入大肠杆菌细胞实实 验验 原原 理理把把外外源源DNADNA分分子子导导入入到到某某一一宿宿主主细细菌菌细细胞胞的的过过程程称称为为转转化化（transformationtransformation）。当当细细菌菌处处于于容容易易吸吸收收外外源源DNADNA的的状状态态即即感感受态受态时，转化最易发生。时，转化最易发生。常常用用的的转转化化方方法法是是用用CaClCaCl2 2处处

26、理理受受体体菌菌，使使细细菌菌细细胞胞进进入入敏敏感感的的感感受受态态。当当细细菌菌处处于于冰冰冻冻（00）的的CaClCaCl2 2溶溶液液中中，细细菌菌细细胞胞膨膨胀胀成成球球形形，转转化化混混合合物物中中的的DNADNA形形成成抗抗DNaseDNase的的羧羧基基钙钙磷磷酸酸复复合合物物粘粘附附于于细细胞胞表表面面，经经4242短短时时间间热热冲冲击击处处理理，促促进进细细胞胞吸吸收收外外源源DNADNA。在在丰丰富富培培养养基基上上生生长长数数小小时时后后，球球状状细细胞胞复复原原并并分分裂裂增增殖殖，被被转转化化的的细细菌菌中中，载载体体中中抗抗抗抗生生素素基基因因得得到到表表达达，

27、在在选选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。择性培养基平板上，可选出所需的转化子。实实 验验 材材 料料一）仪器与器皿一）仪器与器皿 恒温振荡器，分光光度计，电动沉淀离心机，旋涡混合恒温振荡器，分光光度计，电动沉淀离心机，旋涡混合器，恒温培养箱，电热恒温水浴锅，恒温摇床，普通冰箱，器，恒温培养箱，电热恒温水浴锅，恒温摇床，普通冰箱，Eppendorf管，转液管，平皿，涂布棒，微量取样器，管，转液管，平皿，涂布棒，微量取样器，微波炉，三角烧瓶，试管，刻度离心管，保温瓶，酒精灯微波炉，三角烧瓶，试管，刻度离心管，保温瓶，酒精灯等。等。（二）菌种（二）菌种 大肠杆菌大肠杆菌Top10Top10或或

28、DH5DH5（三）培养基与试剂（三）培养基与试剂 1 1LBLB培养基：胰化蛋白胨培养基：胰化蛋白胨 10g10g，酵母提取物，酵母提取物 5g5g，NaCL NaCL 10g10g，调，调pH7.5pH7.5，定容至，定容至1000ml1000ml 2 2100mmol/L CaCl2100mmol/L CaCl2；3 3氨苄青霉素溶液（氨苄青霉素溶液（50 mg/ml50 mg/ml）；）；4 4质粒质粒DNA:pcDNA3.1-p38DNA:pcDNA3.1-p38 5 5含含Amp Amp 的的LB LB 固体培养板：将配好的固体培养板：将配好的LB LB 固体培养基高固体培养基高压灭

29、菌后冷却至压灭菌后冷却至6060左右，加入左右，加入Amp Amp 储存液，使终浓度为储存液，使终浓度为50g/ml50g/ml，摇匀后铺板。，摇匀后铺板。实实 验验 步步 骤骤（一）感受态菌制备（一）感受态菌制备1 1将受体大肠杆菌在平板上划线，置于恒温培养箱中将受体大肠杆菌在平板上划线，置于恒温培养箱中37 37 培养过夜，挑取一个单菌落培养过夜，挑取一个单菌落（直径（直径23mm23mm）接种于）接种于3 ml LB3 ml LB试管中，试管中，37 37 摇床培养（摇床培养（200300r/min200300r/min）过夜（约）过夜（约16 16 小时），必要时在显微镜下镜检菌细胞是

30、否形态一致，有无杂菌污染。小时），必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致，有无杂菌污染。2 2无菌条件下用加样器吸取过夜培养液无菌条件下用加样器吸取过夜培养液1 ml1 ml，接种于新鲜的，接种于新鲜的LB LB 中（中（100 ml LB/250 ml100 ml LB/250 ml三角瓶，接种量按菌液浓度而定，一般在三角瓶，接种量按菌液浓度而定，一般在1%1%左右），于左右），于3737恒温摇床培养培养恒温摇床培养培养2-3 2-3 小时。小时。3.3.分光光度计测分光光度计测OD550OD550的光密度值，待的光密度值，待ODOD值约为值约为0.20.5 0.20.5 左右时左右时,将将

31、3ml3ml培养液转入离心培养液转入离心管中，冰上放置管中，冰上放置2020分钟，分钟，3000 rpm 43000 rpm 4离心离心510510分钟。分钟。4 4弃上清，将管倒置于干滤纸上弃上清，将管倒置于干滤纸上1min1min，吸干残留的培养液。用预冷的，吸干残留的培养液。用预冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaCl2 CaCl2 溶液溶液30 ml30 ml轻轻悬浮细胞，冰上放置轻轻悬浮细胞，冰上放置15301530分钟后，分钟后，3000 rpm 4 3000 rpm 4 离心离心1010分钟。分钟。5 54 4，4000 rpm4000 rpm离心离心1010分钟，弃上清

32、，将管倒置于干滤纸上分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min1min，吸干残留的培养，吸干残留的培养液，加入含液，加入含10%10%甘油的甘油的4 ml4 ml预冷预冷0.1 mol/L CaCl2 0.1 mol/L CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5 5分钟，即成感受态细胞悬液。分钟，即成感受态细胞悬液。6 6感受态细胞分装成感受态细胞分装成100 l100 l的小份，至的小份，至4 4 保存备用，保存备用，24-4824-48小时内使用效果较好。小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于如果暂时不用，可再保存于-70-70的低温冰箱中。的低温冰箱中。

33、注意事项：整个过程在冰上，轻柔操作。注意事项：整个过程在冰上，轻柔操作。（二）大肠杆菌转化（二）大肠杆菌转化 实验步骤：实验步骤：1 1从从-70-70冰箱中取出一管感受态细胞，放置冰箱中取出一管感受态细胞，放置冰上冰上缓慢溶化，放置缓慢溶化，放置10 10 minmin。2 2分别取分别取2 2管管100l100l感受态细胞悬液，第一组为转化实验组：感受态细胞悬液，第一组为转化实验组：10 l10 l重重组质粒组质粒DNA+100lDNA+100l感受态细胞；第二组为阴性对照组；加入同体积感受态细胞；第二组为阴性对照组；加入同体积无菌水无菌水+100l+100l感受态细胞悬液；轻轻摇匀，冰上

34、放置感受态细胞悬液；轻轻摇匀，冰上放置3030分钟。分钟。3 3将管放入将管放入42 42 恒温水浴中恒温水浴中9090秒，迅速将秒，迅速将eppendorfeppendorf管移到冰浴上，管移到冰浴上，冷却冷却2 min2 min。4 4向上述向上述eppendorfeppendorf管中加入管中加入0.8 ml LB0.8 ml LB液体培养基（不含液体培养基（不含AmpAmp），混），混匀后匀后37 37 振荡培养振荡培养4560min4560min，使细菌恢复正常生长状态，并表达，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)(Ampr)。5

35、 5将上述菌液摇匀后取将上述菌液摇匀后取100200l 100200l 涂布于含涂布于含AmpAmp的筛选平板上，正的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，3737培养培养12161216小时小时。即形成菌落。即形成菌落。重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒DNA DNA 的提取和纯化的提取和纯化的提取和纯化的提取和纯化基因重组后,需重组质粒DNA的提取要从转化的细菌中提取重组质粒DNA重组质粒DNA的提取重组质粒DNA的纯化（氯化锂沉淀法）重组基因的转化第二天取出培养皿，观察菌落生长情况，我们会看到一个个小的白色

36、菌落，说明这些菌落，已经被注入重组的质粒，但我们还要进一步筛选。将上述菌落分别培养，然后取出质粒，然后分别用SpeI酶，XbaI酶对其进行酶切，对其进行电泳观察其片段长度，与理论长度相符的既是我们所要的重组质粒。将其微注射到果蝇的生殖细胞中，然后与野生型果蝇杂交，后代表现红眼的即为所得的tapRNAi构建品系果蝇。(所选的vector含有white基因）购买不同的driver品系的果蝇与制备品系进行杂交。用显微镜在杂交产生的后代中筛选发育异常的果蝇。对发育异常的果蝇分析，推论tap基因可能的功能。总结实验结果，撰写论文。2.显微注射、微注射、筛选出出UAS品系的果品系的果蝇:1）提取重组的）提取重组的DNA，并显微注射到，并显微注射到W1118品系的果蝇卵尾部的极细胞处，品系的果蝇卵尾部的极细胞处，注射后的卵放在盛有琼脂培养基的大培注射后的卵放在盛有琼脂培养基的大培养皿中，用油覆盖整个玻片，养皿中，用油覆盖整个玻片，18摄氏度摄氏度放置放置72h等待孵化；等待孵化；4.对后代果后代果蝇发育情况育情况进行行观察、分析，察、分析，得出得出结论，撰写，撰写论文。文。