组织化学技术酶组化.pptx

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1、22后偶联法Post-coupling（ACP）3合成法4底物膜法 设计半透膜 切片/孵育法 影响酶组化实验的关键因素 酶活性的保存a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不 同的酶适用不同的固定剂 抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金 属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。慎用醛 第1页/共33页3b）取材：快捷，实验准备充分。冰结切片应先备液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定（丙酮氯仿=11）4，510分钟，但脂溶性蛋白脱落。底物浓度 A）量要足够120 V/V B）孵育法只能用一次，配制 时要适量（节俭）PH和渗透压 应以缓冲液调节 温度控制与时间：室温37（40min）4（510min）

2、第2页/共33页4 捕获剂 亦要求一定浓度，要以反应原位瞬 时沉淀。激活剂与抑制剂（对照）a）两者的选择都应具有特异性。b）要有适当的浓度范围 时间：通过实验自行摸索。任何配方都是一 个很大的范围（指时间），受多种因 素的影响，因药品的质量、环境因素 的变化而变化。故不可轻信之。扩散：控制反应速度，避免扩散（冰冻 切片孵育尤应注意）第3页/共33页5 对照：必须设立对照，以防非特异反应。这对结果的解释非常重要。对结果的分析，应考虑如下几个问题：经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟 能保留多少？酶是否在原位？反应中多少酶起了作用？酶的活性是否代表细胞生活时的活性？沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时

3、间延 长，会不会改变？是否有扩散移位第4页/共33页6 一、钙钴法显示碱性磷酸酶 Alkaline Phosphatase（ALP）原理以天然存在的甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为 磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。反应式如下：第5页/共33页7第6页/共33页方法标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片）厚6微米。固定：丙酮氯仿（11）混合液。4 25切片标本入下列孵育液中，37，5分钟 孵育液：3甘油磷酸钠 6ml 底物 保 2巴比妥钠 6ml 调PH 证 2氯化钙（无水）9ml 沉淀剂 新 2硫酸镁 6ml 激活剂 鲜 蒸馏水 3ml

4、 30ml 将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4。第7页/共33页 流水流水洗2分钟后入蒸馏水 入2硝酸钴，5分钟（小肠可3分钟）置换 流水洗5分钟，入蒸馏水。入0.5硫化胺，2分钟。置换 流水洗10分钟，入蒸馏水。入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟 流水洗5分钟蒸馏水。甘油明胶或Apathy糖胶封固。第8页/共33页结果：肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛 纹状缘和 血管内皮出现黑色的硫化钴沉 淀，显示ALP活性强。ALP为一种膜酶，广泛存在于肾小管、小肠 绒毛、膀胱、肾上腺、包曼氏囊、肝、脾、乳腺及 卵巢等细胞膜，与细胞的吸收有关。对照 无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中的3 甘

5、油磷酸钠，其余各步进行同上。第9页/共33页 加热灭活酶活性。加抑制剂，左旋咪唑0.11.0mmol/L注意事项Ca2+要足量 硫化钠（NH4）S 配置成淡黄色，可提供 S2-滴23滴 用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性。有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色 素）出现，可影响结果。本法可用显示：5核苷酸酶、肌蛋白 ATPase、ALP第10页/共33页 二、铅法显示酸性磷酸酶 （Gomori，1950 Lojda，1979）原理 以甘油磷酸钠为底物，在酸性PH下，被ACP水解，释放出磷酸盐，遇铅离子则生成磷酸铅沉淀。在被S2-置换，最终生成硫酸铅棕色沉淀。反应式如下：酸性磷酸酶Acid Phos

6、phatas（ACP）第11页/共33页第12页/共33页 ACP的特性 PH 4.55.5适宜 激活剂：Mn2+抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石 酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。ACP定位 溶酶体（颗粒状）内；溶酶体外ACP存在于ER和胞液。该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、肾上腺。第13页/共33页方法标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6 微米。固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可 用甲醛，但影响活性。本实验不固定或固定于丙酮氯仿（11）混合液，4，25min步骤：将标本放于下列孵育液中 37，1015 孵育液：0.1M醋酸缓冲液，PH5.2 15ml 0.24硝酸铅 15

7、ml第14页/共33页 3甘油磷酸钠 3ml 33ml 混匀，置37水浴中1530分钟后，过滤。于37蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温 蒸馏水洗）入5硫化胺，12分钟。流水冲洗35分钟后，换蒸馏水。（可用Mayer苏木素复染核）用甘油明胶或Apathy氏糖胶封固。第15页/共33页结果酶活性部位棕黑色硫化铅沉淀。分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细 胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒。对照孵育液内加0.01M NaF（13.9mg/33ml）（）注意事项 铅离子的浓度 关键问题，没有底物，有 些组织吸附铅离子（+），因此必须用NaF 抑制酶活性排除假阳性反应。孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。第1

8、6页/共33页应用范围 “铅法”适用于：ACP，5-核苷酸酶G6P酶;膜ATPase MitoATPase TTPase（硫胺素焦磷酸酶）三、偶氮偶联法显示ACP原理 以奈酚的衍生物磷酸脂Naphthol ASBL Phosphate为底物，在酸性PH（5.2）下，经酸性磷酸酶水解释放出Naphol ASBI，立即与六氮化对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。第17页/共33页方法标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚 6 微米。不固定或固定于丙酮氯仿（11）混 合液内，4，25min 标本入下列孵育液，37，3060分钟。孵育液：磷酸奈酚ASBI 15 mg 溶于二甲基亚砜

9、 0.6 ml 六氮化对品红 缓冲液 30 ml 30.6 ml 第18页/共33页 充分混匀并过滤 蒸馏水洗 入Mayer苏木精内染1分钟。流水冲5分钟后入蒸馏水。用Apathy糖胶或甘油明胶封固。结果 酶的活性部位呈红色，核兰色。分布于肾近端小管核周，肝毛细 胆管周围。ACP是溶酶体的标志酶。六氮化对品红液的配制（30ml）第19页/共33页 4对品红盐酸溶液 碱性品红 400mg 浓盐酸 2 ml 蒸馏水 8ml 4NaNO3配好后于冰箱保存用时取1ml。+等量混匀（各取1ml），盖严并置室 温静止一分钟，待混合液变为淡黄色 倒入28ml 2.72醋酸钠溶液，用1N NaOH调PH至5

10、5.5即成。第20页/共33页 四、四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶对照用抑制剂NaF浓度为10mmol/L Ca2+浓度为10mmol/L注意事项 六氮盐浓度不能太高 背景会略带黄色应用范围 本法用于ALP、ACP、非特 异性脂酶。第21页/共33页原理利用 利用H受体的H2，使四唑还 原成甲 月替：反应式如下：第22页/共33页第23页/共33页本实验：以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作 用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（nitro BT）为受H体，其接受H后被还原成甲月替 呈紫色以代表琥珀酸脱氢酶的活性。琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。抑制物：丙二酸盐（竞争抑制），磷酸 盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸

11、 （竞争抑制）凡与-SH基化合的 作用剂皆抑制其活性。方法第24页/共33页 标本：大白鼠肝、肾或心肌。横冷箱切片，后 6微米不固定。步骤：将标本放入下列孵育液中，37，约5分钟。孵育液：nitro BT 10mg 0.1MPBS，PH7.8 10ml PMS（吩嗪硫酸甲酯）1mg 徐徐加温，使其溶解，冷却过滤。再加入琥珀酸钠 80mg 蒸馏水洗净第25页/共33页 Apathy氏液糖胶封固结果 酶活性部位成蓝紫色沉淀。此标本内 所见蓝紫色颗粒即线粒体。对照 孵育液去底物，加入等量蒸馏水，同 时孵育（）注意 甲月替易溶于脂，反应扩散时组织内脂滴被染。加入PMS（中间递氢体）定位更加准确。如果聚

12、乙烯醇PVA，可以保护线粒体膜，使 反应局限在线粒体内。应用范围 适用于：甲胺氧化酶、乳酸脱氢 酶、琥珀酸脱氢酶。第26页/共33页 五 、DAB法 显示过氧化物酶原理 过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物、的酶底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。第27页/共33页光镜显示方法（1）孵育液的配置：预孵育液：DAB 4HCL 10mg 溶于蒸馏水 5ml 0.2M磷酸缓冲液（PH6

13、.5）5ml Fahimi孵育液:DAB 4HCL 10ml 溶于蒸馏水 5ml 0.2M磷酸缓冲液（PH6.57.0）5ml第28页/共33页 0.3H2O2 0.1ml GrahamK孵育液：DAB 4HCL 5mg 0.05M TH缓冲液（PH7.6）10ml 1H2O2 10ml Lojda 孵育液：0.1N苯基对次甲苯二胺 25ml 0.1-萘酚 25ml0.3H2O2（新配）1ml第29页/共33页方法 固定：温度4，30分钟（3戊二醛固 定液：20戊二醛15ml，或25 戊二 醛12ml 0.2 M磷酸缓冲 液50 ml，蒸 馏水加至100ml止）；洗涤：洗涤三次以上，每次15分

14、钟，或 过滤。切片：Cryostat制成切片（510m）染色步骤 切片入下列孵育液中第30页/共33页 a预孵液：室温下1030分钟 b后孵液：Fahimi孵育液，室温560分钟 Gropam-Karnovsky液，室温，310分钟 洗涤：蒸馏水漂洗 染核：亚甲蓝染核 封固：甘油明胶封固 髓性过氧化物酶显示法。固定与切片：用冷的2.5戊二醛固定30 60分钟，然后用Cryostat制成20微米切片。第31页/共33页 孵育：Lojda孵育液，室温，310分钟。洗涤：蒸馏水洗。染核：卡红矾染核。封固：甘油明胶封固。结果 酶活性阳性部位呈茶褐色。髓性 过氧化物酶蓝色对照 一般DAB法：去掉H2O2；将2050mM的3氨基1，2，4三唑加进预 孵育液和DAB反应液内。髓性过氧化物酶的显示法：用50mM KCN处理。第32页/共33页感谢您的观看！第33页/共33页