基因克隆模块.ppt

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1、基因克隆模块基因克隆模块现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验现代分子生物学大实验凝胶回收或纯化目的基因序列测定质粒提取连接产物的转化目的基因插入载体植物体植 物 总 RNA或DNA 凝胶电泳RACE法合成目的基因RT-PCR或PCR合成目的基因A T TA 基因克隆实验流程基因克隆实验流程实验一实验一聚合酶链式反应技术（聚合酶链式反应技术（PCR）及琼脂糖）及琼脂糖凝胶检测凝胶检测DNA片段片段 1.PCR扩增扩增PCRPCR技术特点和应用：技术特点和应用：PCRPCR技术具有快速、简便、灵敏等特点，已被广泛地技术具有快速、简便、灵敏等特点，已被广泛地应用于分子生物学等

2、各个领域。应用于分子生物学等各个领域。以插入到质粒载体中的特异片段为目的片段，通过载以插入到质粒载体中的特异片段为目的片段，通过载体的序列设计引物，体的序列设计引物，PCRPCR反应后可以通过电泳检测特反应后可以通过电泳检测特异片段的扩增结果。异片段的扩增结果。PCR技术的原理与细胞内发生的技术的原理与细胞内发生的DNA复制复制过程十分过程十分类似。首先是双链类似。首先是双链DNA分子在临近沸点的温度下加分子在临近沸点的温度下加热会热会变性变性成两条单链的成两条单链的DNA分子，将对应于欲扩增分子，将对应于欲扩增区域的引物与区域的引物与DNA单链相辅结合的单链相辅结合的退火步骤退火步骤引导新引

3、导新链的合成，然后链的合成，然后DNA聚合酶以单链聚合酶以单链DNA为模板并利为模板并利用反应混合物中的用反应混合物中的dNTPs合成新生的合成新生的DNA互补链的互补链的延伸步骤延伸步骤。各个步骤间的转换需要通过热循环的方。各个步骤间的转换需要通过热循环的方式来完成，通过反复热循环，实现式来完成，通过反复热循环，实现DNA序列的扩增。序列的扩增。PCR技术原理技术原理PCR反应的最后结果是使特定的反应的最后结果是使特定的DNA区段得到了迅区段得到了迅速大量的扩增。速大量的扩增。PCR反应涉及多次重复进行的温度循环周期，而每反应涉及多次重复进行的温度循环周期，而每一个温度循环周期均是由一个温度

4、循环周期均是由高温变性、低温退火高温变性、低温退火及及中中温延伸温延伸三个步骤组成。三个步骤组成。PCR步骤步骤(c)(b)引物引物2533355(d)新引物新引物53靶靶DNA的扩增的扩增(a)53引物引物13 535引物引物2互补链互补链引物引物1互补链互补链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链5335引物引物1互补链互补链引物引物2互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)PCR技术PCR过程中靶序列的累积与循环数的函数关系过程中靶序列的累积与循环数的函数关系PCR反应的平台效应反应的平台

5、效应理论上，一个拷贝的基因通过一次循环增加到原来的两倍，而理论上，一个拷贝的基因通过一次循环增加到原来的两倍，而N次循环后就增加次循环后就增加到了原来的到了原来的2n倍。实际上，循环开始时效率较低，且随着循环的推进，会产生酶倍。实际上，循环开始时效率较低，且随着循环的推进，会产生酶的失活和底物的消耗，因此造成的失活和底物的消耗，因此造成PCR反应的平台效应（反应的平台效应（Plateau Effect），使得），使得扩增的复制倍数比理论值要低。扩增的复制倍数比理论值要低。实验步骤实验步骤1）在在0.25ml的的eppendorf 管中加入如下成分进行管中加入如下成分进行PCR反应（反应（所有的

6、所有的试剂和小管都应该放于冰上试剂和小管都应该放于冰上）ddH2O 37.5 ul；10PCR Buffer 5 ul；dNTPs(Taq酶酶)(5ul+0.5ul)5.5 ul；上游上游primer+下游下游primer (0.5 ul+0.5 ul)1 ul；质粒质粒DNA 模板模板 1 ul；总体积总体积50 ul2）加入所有成分之后，混匀，用离心机将混合液滴甩到管底。）加入所有成分之后，混匀，用离心机将混合液滴甩到管底。3）在）在PCR仪中按下述程序进行扩增：仪中按下述程序进行扩增：94 2min94 30s；40-60（由上下游引物的（由上下游引物的Tm值决定）值决定）30s；72

7、X sec(一般一般1Kb/min，由目和片段长度决定，由目和片段长度决定)；重复重复-29次；次；72 5min。44）利用）利用DNA的琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，正常情况下产物，正常情况下PCR产物为一条单一清晰的条带产物为一条单一清晰的条带。实验步骤实验步骤一、实验目的一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术的方法和技术。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、实验原理二、实验原理uDNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时有分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时有电荷效应和分子筛效应。电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高分子在高于等电

8、点的于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子的迁移速度取决于DNA分子本分子本身的大小和构型。身的大小和构型。三、实验设备三、实验设备移液器，移液器，tip头，头，tip头盒、水头盒、水平凝胶电泳槽，平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶三角瓶四、实验试剂四、实验试剂u琼脂糖，琼脂糖，1TAE（Tris-乙酸乙酸 0.04M，EDTA 0.001M，pH值为值为8.2），），1mg/ml溴乙锭，载样缓冲液溴乙锭，载样缓冲液.u溴乙锭是一种荧光染料，这种

9、扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之溴乙锭是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，它与间，它与DNA的结合几乎没有碱基序列的特异性。在高离子强度的饱和的结合几乎没有碱基序列的特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每溶液中，大约每2.5个碱基插于一个溴乙锭分子。个碱基插于一个溴乙锭分子。u当染料分子插于后，其平面基团（菲啶环）与螺旋的轴线垂直并通过范当染料分子插于后，其平面基团（菲啶环）与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用，这个基团德华力与上下碱基相互作用，这个基团 固定位置及其与碱基的密切接近，固定位置及其与碱基的密切接近，导致与导致与DNA结合的染料呈现荧光。

10、结合的染料呈现荧光。uDNA吸收吸收254nm处的紫外线并传递给染料，而被结合的处的紫外线并传递给染料，而被结合的EB本身吸收本身吸收302nm和和366nm的光辐射，被吸收的能量在可见光谱红橙区的的光辐射，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处处重新被激发发出荧光，重新被激发发出荧光，uEB一般在凝胶或电泳缓冲液中的终浓度为一般在凝胶或电泳缓冲液中的终浓度为0.5g/ml，EB见光易分解，见光易分解，故应在棕色试剂瓶中于故应在棕色试剂瓶中于4条件下保存。条件下保存。u电泳缓冲液电泳缓冲液缓冲液缓冲液工作液工作液贮存液贮存液/L TAE 1:40mM(Tris-乙酸乙酸)1mM EDTA5

11、0:242gTris 57.1ml冰醋酸冰醋酸 100ml 0.5MEDTA(pH=8.0)TPE 1:90mM(Tris-磷酸磷酸)2mM EDTA10:108gTris 15.5ml磷酸（磷酸（85%，1.679g/ml）40ml 0.5MEDTA(pH=8.0)TBE 0.5:45mM(Tris-硼酸硼酸)1mM EDTA5:54gTris 27.5g硼酸硼酸 20ml 0.5MEDTA(pH=8.0)u增加样品的密度保证样品沉入加样孔内；增加样品的密度保证样品沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；使样品带有颜色便于简化上样过程；能明确显现样品在电泳胶上泳动位置。能明确显现样品在

12、电泳胶上泳动位置。u溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯氰迁移速率的溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯氰迁移速率的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。试剂试剂用量用量（m/v）溴酚蓝溴酚蓝0.25%二甲苯氰二甲苯氰0.25%甘油甘油30%u凝胶载样缓冲液：凝胶载样缓冲液：五、实验步骤五、实验步骤u1.用透明胶带将胶板的两端封好。用透明胶带将胶板的两端封好。u2.称取称取0.16g琼脂糖于琼脂糖于50ml三三角瓶中角瓶中，加入，加入1TAE buffer 20ml，配，配配制配制0.8%的琼脂糖凝胶，在微波炉的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。中加热至琼

13、脂糖溶解。u3.待溶液冷却至待溶液冷却至60左右，加入左右，加入2m ml溴化乙锭充分溴化乙锭充分混匀。混匀。u4.用透明胶封固玻璃板两头，在距底板用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.51.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在中，凝胶厚度在35 mm之间。之间。u5.在凝胶完全凝固后（在凝胶完全凝固后（室温下室温下3040 min），撕去透明胶，小心地），撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有将玻璃板移至装有1TAE buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约且使缓冲液没过胶面约

14、1 mm。电泳槽中的缓冲液最好与制胶所电泳槽中的缓冲液最好与制胶所用的缓冲液是同一批次的，若两种缓冲液中的离子强度及用的缓冲液是同一批次的，若两种缓冲液中的离子强度及pHpH不一不一致，将影响核酸的迁移率。致，将影响核酸的迁移率。u6.DNA样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物样品与溴酚蓝混合后，用微量取样器慢慢将混合物加入上加入上样孔样孔中。中。u7.盖上电泳槽并通电，使盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极（红线）移动。采用向阳极（红线）移动。采用65V电电压进行电泳。压进行电泳。u8.当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断电流，当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约半小时），切断

15、电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。退火温度取决于两个引物的退火温度取决于两个引物的Tm值，在确定退火温度时，实际值，在确定退火温度时，实际的温度应该比较低的的温度应该比较低的Tm值低值低3-5度。度。PCR实验没有得到任何条带，应该考虑是否按照要求加入了实验没有得到任何条带，应该考虑是否按照要求加入了所有反应成分。所有反应成分。PCR实验得到的条带亮度弱，应该考虑加大模板实验得到的条带亮度弱，应该考虑加大模板DNA的量。的量。反应得到的不止是一条扩增条带，应当适当的提高退火温度反应得到的不止是一条扩增条带，应当适当的提高退火温度来增加扩增的特异性，或者是对模

16、板进一步稀释再进行扩增来增加扩增的特异性，或者是对模板进一步稀释再进行扩增反应。另外还可以利用回收的方法获得特异的条带。反应。另外还可以利用回收的方法获得特异的条带。结果与分析结果与分析反转录反转录PCR（reverse transcriptase-PCR，RT-PCR）是一种以）是一种以RNA为模板合成为模板合成cDNA的方法。的方法。RT-PCR可以克隆可以克隆mRNA的的5及及3末端序列，同时也末端序列，同时也可以利用此方法从少量的可以利用此方法从少量的mRNA样品构建大容量的样品构建大容量的cDNA文库。文库。RT-PCR还可以用于测定基因的表达强还可以用于测定基因的表达强度，尤其是在

17、度，尤其是在mRNA数量有限和目的基因表达水平数量有限和目的基因表达水平很低时也可用很低时也可用RT-PCR方法进行分析。方法进行分析。2.RT-PCR技术技术实验原理实验原理RT-PCR是以是以RNA为模板合成为模板合成cDNA的方法（如图的方法（如图1-2-3）。首先通过酶促反应利用）。首先通过酶促反应利用poly（T）引物或随）引物或随机引物使机引物使RNA反转录为反转录为cDNA的第一条链。然后以的第一条链。然后以cDNA为模板进行为模板进行PCR扩增。依据不同的实验目的，扩增。依据不同的实验目的，可以选用不同的与可以选用不同的与mRNA链结合的引物。链结合的引物。实验步骤实验步骤利用

18、利用TOYOBO Reverse Transcript试剂进行试剂进行RT-PCR（1）RT-PCR：按照下表在离心管中加入如下成份。：按照下表在离心管中加入如下成份。5 RT Buffer；dNTP；Rnase inhibitor；ReverTra ACE；Oligo（dT）primer；总；总RNA=1 g；ddH2O。（2）按照下列条件进行）按照下列条件进行RT-PCR反应。反应。30 10 min42 20 min99 5 min4 5 min图图1-2-3 RT-PCR原理示意图A A A A A A AT T T T T T TOligo（dT）引物 逆转录cDNAPCR特异引物

19、特异引物 mRNA 随机引物 逆转录cDNAPCR特异引物 特异引物 PCR反应：在离心管中加入如下成份，形成反应：在离心管中加入如下成份，形成PCR的反应体系。的反应体系。试剂名称试剂名称 使用量使用量10 Buffer 2.5 LdNTP（2mmol/L）2 LRT-PCR产物产物 5 LEx-Taq酶（酶（5 u/L）0.25 L上游引物（上游引物（20 mol/L）1 L下游引物（下游引物（20 mol/L）1 LddH2O up to 25 L按照下列条件进行按照下列条件进行PCR反应。反应。94 2 min94 30 sec 30循环循环50 30 sec72 90 sec72 7

20、 min4 RT-PCR产率低的主要原因产率低的主要原因（1）反转录）反转录cDNA的合成效率低，更多情况下是因为的合成效率低，更多情况下是因为cDNA扩扩增效率低。可以使用一系列不同浓度的增效率低。可以使用一系列不同浓度的cDNA模板进行扩增，模板进行扩增，模板量非最适时产生许多弥散的扩增产物。模板量非最适时产生许多弥散的扩增产物。（2）确定了最佳）确定了最佳cDNA模板浓度后，可以通过改变模板浓度后，可以通过改变Mg2+浓度或浓度或Tm值，进一步进行反应体系的优化。值，进一步进行反应体系的优化。（3）必要时纯化）必要时纯化cDNA第一链。第一链。（4）有必要建立对照反应，以检测）有必要建立

21、对照反应，以检测cDNA的合成效率。的合成效率。实验二实验二特异扩增片段的回收、连接、转化特异扩增片段的回收、连接、转化及质粒及质粒DNA提取提取 对于对于PCR反应得到的多条条带，可以利用凝胶回收的反应得到的多条条带，可以利用凝胶回收的方法得到需要的特异条带。也可以利用纯化试剂盒纯方法得到需要的特异条带。也可以利用纯化试剂盒纯化具有单一条带的化具有单一条带的PCR产物。产物。在高盐状态下，树脂专一性地吸附在高盐状态下，树脂专一性地吸附DNA，去除多余的，去除多余的小片段和离子后，在低盐或水溶液状态下，小片段和离子后，在低盐或水溶液状态下，DNA被洗被洗脱下来。纯化后的脱下来。纯化后的PCR产

22、物便于和载体连接。产物便于和载体连接。利用小量利用小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收特异片段或纯片段快速胶回收试剂盒回收特异片段或纯化化PCR产物产物 采用特殊硅基质材料在一定采用特殊硅基质材料在一定高盐缓冲系统下高盐缓冲系统下高效、专一地高效、专一地吸附吸附DNA、RNA，在，在低盐缓冲液或水中洗脱低盐缓冲液或水中洗脱下来，同时去除各种蛋白下来，同时去除各种蛋白质、无机盐和许多有机物等杂质，配备设计独特的离心吸附柱式质、无机盐和许多有机物等杂质，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，分离片段。结构，使用常规台式高速离心机，分离片段。其机理可能为：高浓度的盐离子破坏硅基质水分

23、子结构，形成阳其机理可能为：高浓度的盐离子破坏硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化的硅质破坏了基质和离子桥，当盐被清除后，再水化的硅质破坏了基质和DNA之间的之间的吸引力，因此吸引力，因此DNA从硅基质上洗脱下来。从硅基质上洗脱下来。操作程序操作程序在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切条带切下，尽量切除不含除不含DNA的凝胶，得到胶的体积越小越好。的凝胶，得到胶的体积越小越好。DNA溶液溶液(50100l)或者含有或者含有DNA的凝胶的凝胶 加入加入300u1溶胶液溶胶液DD56度放置度放置10分钟（至胶完全溶解），

24、每分钟涡旋震荡一次加速分钟（至胶完全溶解），每分钟涡旋震荡一次加速溶解。溶解。将溶液加入吸附柱将溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），室温放置中（吸附柱放入收集管中），室温放置1分钟，分钟，12000 rpm，离心，离心3060秒；去掉收集管中的废液。秒；去掉收集管中的废液。加入加入700 l漂洗液漂洗液WB漂洗，漂洗，12000 rpm离心离心30秒。倒掉废液。秒。倒掉废液。加入加入500 l漂洗液漂洗一次，漂洗液漂洗一次，12000 rpm离心离心30秒秒,倒掉废液。倒掉废液。将吸附柱将吸附柱AC放回空收集管中，放回空收集管中，12000 rpm离心离心2 min。（空离，甩干。（空

25、离，甩干残余液体，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应）残余液体，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应）室温放置至无乙醇残留，否则会影响后续酶促反应。室温放置至无乙醇残留，否则会影响后续酶促反应。取出吸附柱取出吸附柱AC,放入一干净的离心管中，向柱子中间部位加入放入一干净的离心管中，向柱子中间部位加入30 l的的洗脱缓冲液洗脱缓冲液EB（Elution buffer），（要加在柱子中央，室温放置），（要加在柱子中央，室温放置12分钟）分钟）12000 rpm离心洗脱。离心洗脱。把扩增后的把扩增后的PCR溶液加到硅基质膜上时，目的片段就会特异溶液加到硅基质膜上时，目的片段就会特异的结合上去，而其它如的结

26、合上去，而其它如dNTP、引物二聚体、非特异性或小于、引物二聚体、非特异性或小于100 bp的片段等杂质会被过滤掉，通过后面的漂洗步骤可进的片段等杂质会被过滤掉，通过后面的漂洗步骤可进一步去掉多余的杂质，最后用水或者洗脱缓冲液就可以把目一步去掉多余的杂质，最后用水或者洗脱缓冲液就可以把目的片段洗脱下来。的片段洗脱下来。如果要回收溶液中多种如果要回收溶液中多种DNA片段中的一种，采用切胶纯化是片段中的一种，采用切胶纯化是最有效的方法。通过琼脂糖凝胶电泳分开特异性和非特异性最有效的方法。通过琼脂糖凝胶电泳分开特异性和非特异性条带，在紫外光照射下，快速、有效的切下目的片段所在位条带，在紫外光照射下，

27、快速、有效的切下目的片段所在位置的凝胶，纯化得到目的片段。置的凝胶，纯化得到目的片段。实验二实验二特异扩增片段的回收、连接、转特异扩增片段的回收、连接、转化及质粒化及质粒DNA提取提取 要利用或克隆特异的要利用或克隆特异的DNA片段，必须将其连接到特异的载体中，片段，必须将其连接到特异的载体中，然后进行转化，才能够长期保存。然后进行转化，才能够长期保存。大肠杆菌在特殊试剂的处理下，可以处于感受态，易于接受外大肠杆菌在特殊试剂的处理下，可以处于感受态，易于接受外源源DNA。经过热激和冷冻可以增加大肠杆菌细胞膜的通透性，。经过热激和冷冻可以增加大肠杆菌细胞膜的通透性，便于重组质粒便于重组质粒DNA

28、进入大肠杆菌。可以利用蓝白斑进行筛选，进入大肠杆菌。可以利用蓝白斑进行筛选，白斑是含有重组质粒的大肠杆菌菌落。白斑是含有重组质粒的大肠杆菌菌落。通过此实验学习转化的基本实验步骤和实验原理，知道通过转通过此实验学习转化的基本实验步骤和实验原理，知道通过转化可以鉴定连接的效率。化可以鉴定连接的效率。1.回收产物与载体的连接回收产物与载体的连接利用聚合酶扩增的产物两端序列的利用聚合酶扩增的产物两端序列的3端都具有腺苷酸的特点，而端都具有腺苷酸的特点，而T-载体在线性载体在线性3末端都含有胸腺嘧啶核苷酸，将末端都含有胸腺嘧啶核苷酸，将PCR产物可以直产物可以直接连接到接连接到T-载体中。载体中。克隆基

29、因片断克隆基因片断-A A-T-载体载体 T-T重组载体重组载体16连接16h 实验流程实验流程质粒载体上的质粒载体上的lacZ位点与位点与Amp位点位点实验步骤实验步骤1、利用、利用T-载体试剂盒进行连接反应。载体试剂盒进行连接反应。H2O 5l10Buffer 1lDNA 2 l载载体体 1lT4连连接接酶酶 1l2、将反、将反应应体系混匀，离心后，放于体系混匀，离心后，放于16低温水浴中低温水浴中连接接1616个小个小时。2.连接产物的转化连接产物的转化即受体菌在低温下即受体菌在低温下(0)被置于低渗的被置于低渗的CaCl2溶液中，细菌在低溶液中，细菌在低渗环境中菌体膨胀成球形。渗环境中

30、菌体膨胀成球形。转化体系中的转化体系中的DNA与与Ca 2+形成羟基钙磷酸复合物黏附于细胞形成羟基钙磷酸复合物黏附于细胞表面，之后使细菌经表面，之后使细菌经42短时间热冲击处理短时间热冲击处理(热休克热休克)，此时受，此时受体菌可大量吸收其表面黏附的体菌可大量吸收其表面黏附的DNA复合物，完成转化。复合物，完成转化。继而在培养基上生长一定时间继而在培养基上生长一定时间(数小时数小时)后，菌体恢复原状，并后，菌体恢复原状，并可以分裂增殖。可以分裂增殖。由于载体上含有氨苄青霉素抗性基因和由于载体上含有氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因的部分片段，基因的部分片段，所以可以利用抗性和蓝白斑进行含有重组质

31、粒的大肠杆菌菌落所以可以利用抗性和蓝白斑进行含有重组质粒的大肠杆菌菌落的筛选。的筛选。显色反应原理显色反应原理互补：指互补：指E.coli -半乳糖苷酶的两个无活性的片段组合而成为半乳糖苷酶的两个无活性的片段组合而成为功能完整的酶的过程。功能完整的酶的过程。pGEM-T载体上的载体上的T位点位于可产生位点位于可产生肽段的基因片段之内。若肽段的基因片段之内。若有外源基因插入此则破坏编码读框产生没有活性的有外源基因插入此则破坏编码读框产生没有活性的肽段。肽段。宿主菌为缺失产生宿主菌为缺失产生肽段的突变体，但能产生酶的其它肽段（肽段的突变体，但能产生酶的其它肽段（肽段）。肽段）。载体与宿主菌两者之间

32、进行基因内互补就产生有活性的载体与宿主菌两者之间进行基因内互补就产生有活性的-半乳糖半乳糖苷酶。在苷酶。在IPTG的诱导下，载体产生的的诱导下，载体产生的肽段与宿主菌产生的肽段与宿主菌产生的肽肽段结合成有活性的段结合成有活性的-半乳糖苷酶，此酶能使显色底物半乳糖苷酶，此酶能使显色底物X-gal分解分解成不溶于水的蓝色化合物，从而使菌落变蓝。若有外源片段插成不溶于水的蓝色化合物，从而使菌落变蓝。若有外源片段插入此位点，则使载体的入此位点，则使载体的-半乳糖苷酶基因失活，不能产生半乳糖苷酶基因失活，不能产生肽，肽，也就不能形成有活性的也就不能形成有活性的-半乳糖苷全酶，半乳糖苷全酶，X-gal不能

33、被分解，菌不能被分解，菌落为白色。落为白色。转化的实验步骤转化的实验步骤1）从）从-80冰箱中取出感受态细胞放于冰上，使其缓慢融化。冰箱中取出感受态细胞放于冰上，使其缓慢融化。2）分装感受态细胞，每个小管）分装感受态细胞，每个小管30l。分别加入连接产物。分别加入连接产物3l，轻轻，轻轻混匀，冰上混匀，冰上30分钟。分钟。3）42 1分钟。分钟。4）冰上）冰上2.5分钟，加入分钟，加入SOC培养基培养基470l。5）37摇床摇动摇床摇动1小时。小时。6）LB固体培养基灭菌后，自然凉至固体培养基灭菌后，自然凉至60时，加入氨苄青霉素时，加入氨苄青霉素（终浓度是（终浓度是50g/ml）,倒平板。倒

34、平板。7）等到培养基凝固后，在其上涂）等到培养基凝固后，在其上涂X-gal和和IPTG的混合物（两种物的混合物（两种物质各质各30l，在离心管中混合好后取，在离心管中混合好后取60 l混合物涂扳混合物涂扳)。8）将培养液分成等份后涂于）将培养液分成等份后涂于7中的培养基上，液体全干后，将平中的培养基上，液体全干后，将平板过夜、倒置培养于板过夜、倒置培养于37恒温箱中。恒温箱中。9）第二天早上观察培养结果。）第二天早上观察培养结果。转化后蓝白斑筛选转化后蓝白斑筛选（1）受体菌应事先培养至对数生长期或对数生长前期（菌液）受体菌应事先培养至对数生长期或对数生长前期（菌液的的OD值应在值应在0.2-0

35、.4之间），静止期的细胞不能被转化。之间），静止期的细胞不能被转化。（2）环状）环状DNA比线状比线状DNA的转化率高。小的环状的转化率高。小的环状DNA要比要比大的环状大的环状DNA转化率高。转化率高。（3）严格按照实验程序制备感受态细胞，否则会降低转化效）严格按照实验程序制备感受态细胞，否则会降低转化效率。率。（4）转化过程中严格控制热激时间。）转化过程中严格控制热激时间。（5）外源质粒）外源质粒DNA的浓度也会影响转化效率。的浓度也会影响转化效率。（6）通过蓝白斑的比例可以确定转化效率。）通过蓝白斑的比例可以确定转化效率。感受态制备过程中应该注意的问题感受态制备过程中应该注意的问题转化过

36、程中经常出现的问题转化过程中经常出现的问题（1）转化效率偏低，平板上只有少数蓝白菌斑出现：应该考）转化效率偏低，平板上只有少数蓝白菌斑出现：应该考虑的影响因素包括感受态细胞的质量，转化的具体条件等。虑的影响因素包括感受态细胞的质量，转化的具体条件等。（2）转化平板上蓝斑过多：出现这种现象的原因是连接产物）转化平板上蓝斑过多：出现这种现象的原因是连接产物的质量偏低，绝大多数的外源的质量偏低，绝大多数的外源DNA是是T-载体而重组质粒的含量载体而重组质粒的含量过低。过低。（3）转化的平板上没有蓝斑：可能是）转化的平板上没有蓝斑：可能是X-gal和和IPTG的质量存在的质量存在问题。问题。实验二实验

37、二特异扩增片段的回收、连接、转化及质粒特异扩增片段的回收、连接、转化及质粒DNA提取提取 实验原理实验原理碱裂解法是利用宿主菌染色体碱裂解法是利用宿主菌染色体DNA与质粒与质粒DNA结构的大小差结构的大小差异来分离提取质粒异来分离提取质粒DNA。在碱性在碱性(pH12.012.5)条件下，破坏碱基配对，可使宿主和质条件下，破坏碱基配对，可使宿主和质粒粒DNA的氢键被破坏。当条件恢复正常时的氢键被破坏。当条件恢复正常时(加入酸性试剂中和加入酸性试剂中和)，共价闭合环状质粒，共价闭合环状质粒DNA链会迅速准确配对，重新形成完全天链会迅速准确配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体然的

38、超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，然后用异丙则留在上清液中，然后用异丙醇沉淀、醇沉淀、70%乙醇后洗涤即可得到质粒乙醇后洗涤即可得到质粒DNA。质粒双链质粒双链DNA变性变性单链单链DNA复性复性强碱强碱中性中性闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNADNA，在变性后在变性后互相盘绕互相盘绕，紧密结合在紧密结合在一起，一起，复性快；复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离

39、，难以复性形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性变性各种试剂的功能各种试剂的功能溶液溶液：葡萄糖是为了增加溶液的粘度，防止染色体：葡萄糖是为了增加溶液的粘度，防止染色体DNA受机受机械剪切力作用而降解，污染质粒；械剪切力作用而降解，污染质粒；Tris是为了维持渗透压；是为了维持渗透压；EDTA可以螯合二价金属离子，抑制可以螯合二价金属离子，抑制Dnase的活性。的活性。溶液溶液：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒DNA和染和染色体色体DNA；在高；在高pH（12.012.5）条件下，破坏碱基配对，使）条件下，破坏碱基配

40、对，使细菌染色体细菌染色体DNA双链分离，此时质粒双链分离，此时质粒DNA分子的双链由于拓扑分子的双链由于拓扑缠绕而不能完全分离。缠绕而不能完全分离。如果曝露在强碱环境中的时间过长，共价闭环状的质粒分子也可如果曝露在强碱环境中的时间过长，共价闭环状的质粒分子也可以发生不可逆的变性。所以应当适当的缩短变性时间。以发生不可逆的变性。所以应当适当的缩短变性时间。溶液溶液：使：使DNA分子复性，染色体分子复性，染色体DNA复性速度慢，聚集成复性速度慢，聚集成不可溶的网络状聚合物，而质粒不可溶的网络状聚合物，而质粒DNA得以完全复性。同时高得以完全复性。同时高浓度的醋酸钾会引起蛋白质浓度的醋酸钾会引起蛋

41、白质-SDS复合物和高分子质量的复合物和高分子质量的RNA分子发生沉淀。分子发生沉淀。氨苄青霉素氨苄青霉素：干扰肽聚糖交联而抑制细胞壁的合成。干扰肽聚糖交联而抑制细胞壁的合成。氯仿氯仿/异戊醇异戊醇：蛋白质变性剂，氯仿有强烈的溶脂：蛋白质变性剂，氯仿有强烈的溶脂倾向。倾向。RNase（10mg/ml）：将大分子）：将大分子RNA降解成以降解成以3嘧啶核苷酸结尾的最终产物，小分子嘧啶核苷酸结尾的最终产物，小分子RNA可以通可以通过沉淀和离心处理去除。过沉淀和离心处理去除。实验步骤实验步骤（一）细菌的生长与收获（一）细菌的生长与收获接菌接菌分装分装LB培养基和氨苄青霉素（培养基和氨苄青霉素（50

42、mg/ml）于玻）于玻璃试管中，用灭菌牙签挑取一白色单克隆，放入管内，璃试管中，用灭菌牙签挑取一白色单克隆，放入管内，37培养到培养到OD600=1.4。收集细菌收集细菌取菌液取菌液1.2 ml 于于1.5 ml的的Eppendorf管中，管中，4000 rpm、4 离心离心5 min以收集细菌。弃上清，倒置于以收集细菌。弃上清，倒置于吸水纸上，沥干残液。吸水纸上，沥干残液。（二）质粒（二）质粒DNA的获得的获得u每管加入冰上预冷的溶液每管加入冰上预冷的溶液，振荡器剧烈震荡至菌完全悬浮。，振荡器剧烈震荡至菌完全悬浮。u加入新配制的溶液加入新配制的溶液，温和翻转，温和翻转10次（保证离心管的整个

43、内表面均与溶次（保证离心管的整个内表面均与溶液接触，不要振荡），然后置于冰上。液接触，不要振荡），然后置于冰上。u冰浴冰浴3min内迅速加入溶液内迅速加入溶液，温和的翻转，温和的翻转10 次，冰浴次，冰浴10min。离心。离心。u 取上清液于新管中，取上清液于新管中，同时加入同时加入同时加入同时加入RNaseRNase ，混匀，混匀，混匀，混匀，37 37 金属浴金属浴金属浴金属浴4 h4 h。加入加入等等体积的氯仿体积的氯仿/异戊醇，摇床震荡，离心。异戊醇，摇床震荡，离心。u取上清液于新管中（记住上清液的体积），加入等体积的氯仿取上清液于新管中（记住上清液的体积），加入等体积的氯仿/异戊醇异

44、戊醇（24:1），摇匀，离心。重复一次。），摇匀，离心。重复一次。u弃上清。加入弃上清。加入70%的酒精轻振洗涤沉淀，的酒精轻振洗涤沉淀，离心。离心。u弃上清，倒置于吸水纸上，室温干燥，然后加入无菌水。电泳检测。弃上清，倒置于吸水纸上，室温干燥，然后加入无菌水。电泳检测。提取质粒提取质粒DNA过程中应该注意的问题过程中应该注意的问题（1）细胞的裂解是分离质粒）细胞的裂解是分离质粒DNA的关键步骤。通常加入溶菌酶的关键步骤。通常加入溶菌酶或或SDS促使大肠杆菌细胞裂解。如果寄主细胞没有完全裂解，促使大肠杆菌细胞裂解。如果寄主细胞没有完全裂解，会显著降低质粒会显著降低质粒DNA的回收率。的回收率。

45、（2）提取过程中，除规定的实验条件外，操作中手法要温和，尽）提取过程中，除规定的实验条件外，操作中手法要温和，尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA的降解和破坏。的降解和破坏。（3）电泳时上样孔中如果有白色物质，是由于蛋白质没有去除干）电泳时上样孔中如果有白色物质，是由于蛋白质没有去除干净。净。质粒质粒DNA共价闭合环形共价闭合环形DNA（cccDNA）：其两条多核苷酸链均保持）：其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，这样的着完整的环形结构，这样的DNA通常呈现超螺旋的通常呈现超螺旋的SC构型；构型；开环开环DNA（ocDNA）：两条多核苷酸链中只有一条保持着完）：

46、两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口，此即整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口，此即OC构型；构型；线性分子（线性分子（DNA）：质粒）：质粒DNA经过适当的核酸限制内切酶经过适当的核酸限制内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性切割之后，发生双链断裂而形成线性DNA分子，通称分子，通称L构型。构型。相同分子质量的三种构型在正常情况下电泳时，迁移速率分相同分子质量的三种构型在正常情况下电泳时，迁移速率分别是：超螺旋别是：超螺旋DNA比线性的比线性的DNA迁移率大，线性迁移率大，线性DNA比开环比开环DNA迁移率大。迁移率大。质粒共有三种构型质粒共有三种构型