薄层色谱法学习.pptx

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1、2023/3/3014.4.薄层色谱与高效液相色谱的差别（薄层色谱与高效液相色谱的差别（特点特点）固定相和流动相固定相和流动相 TLCTLC流动相流动靠毛细作用力，流动相流动靠毛细作用力，流动相选择较少受限制，固定流动相选择较少受限制，固定相不用再生。相不用再生。而而 HPLCHPLC是在封闭的系统内，流动相流量靠泵控制，是在封闭的系统内，流动相流量靠泵控制，溶剂选择受检测器限制，固定相需再生。溶剂选择受检测器限制，固定相需再生。样品处理样品处理 TLCTLC要求要求没有没有HPLCHPLC严格。严格。第1页/共65页2023/3/302色谱分离色谱分离 TLCTLC可可同时分离多个样品同时分

2、离多个样品，并可采用相同，并可采用相同或不同溶剂进行同向或双相或不同溶剂进行同向或双相多次展开多次展开，通，通常采用常采用正相正相色谱，色谱后色谱，色谱后衍生化方便衍生化方便。HPLCHPLC一次只能分离一个样品，通常采一次只能分离一个样品，通常采用用反相反相色谱，色谱后衍生化受限制。色谱，色谱后衍生化受限制。对污染物抗受力强对污染物抗受力强 TLCTLC颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均无影响。颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均无影响。HPLCHPLC 颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均有大的影响。颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均有大的影响。第2页/共65页2023/3/3

3、037.2 7.2 薄层色谱法的基本原理薄层色谱法的基本原理1.1.保留参数（保留参数（R Rf f值）值）用来表征斑点位置的基本参数是保留因用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作子，通常称作比移值比移值，用，用R Rf f表示。表示。R Rf f=L=Ls s/L/L。，原点SRWLsL。Lr原点参比样品前沿第3页/共65页2023/3/304 注意：注意：a.a.同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。b.b.在同样溶剂的重复在同样溶剂的重复n n次的多次展开后的比移值次的多次展开后的比移值(R(Rf f)n n=1-(1-R

4、=1-(1-Rf f)n n 。相对比移值（相对比移值（R Rx x）R Rf f测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置，因此，引入测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置，因此，引入相相对比移值对比移值（R Rx x）。）。R Rx x=L=Ls s/L/Lr r第4页/共65页2023/3/3052.2.分离效能参数分离效能参数 理论塔板数理论塔板数 n=16Ls/W n=16Ls/W 2 2 ，考虑静态扩散引起的起始斑点半峰，考虑静态扩散引起的起始斑点半峰宽的影响引入真实塔板数（宽的影响引入真实塔板数（n n真实真实 ）n n真实真实 =5.54Ls/=5.54Ls/（

5、b b0.50.5-b-b0 0）2 2b b0.50.5为样品斑点半峰宽，为样品斑点半峰宽，b b0 0样品起始斑样品起始斑点半峰宽。点半峰宽。塔板高度塔板高度h h真实真实=Ls/nLs/n真实真实 第5页/共65页2023/3/306 3.3.3.3.容量因子（容量因子（容量因子（容量因子（K K K K）容量因子容量因子容量因子容量因子:分配达到平衡后，组分在固定相的量分配达到平衡后，组分在固定相的量分配达到平衡后，组分在固定相的量分配达到平衡后，组分在固定相的量（W W W WS S S S)与流动相中的量（与流动相中的量（与流动相中的量（与流动相中的量（W W W Wm m m m

6、)之比。之比。之比。之比。K K K K =W=W=W=WS S S S/W/W/W/Wm m m m=(c=(c=(c=(cS S S S/c/c/c/cm m m m)（V V V Vs s s s/V/V/V/Vm m m m）=K=K=K=K（V V V Vs s s s/V/V/V/Vm m m m）其中其中其中其中K=cK=cK=cK=cS S S S/c/c/c/cm m m m ，表示，表示，表示，表示分配系数，即分离达到平衡分配系数，即分离达到平衡分配系数，即分离达到平衡分配系数，即分离达到平衡时，组分在固定相和流动相的浓度之比。时，组分在固定相和流动相的浓度之比。时，组分在

7、固定相和流动相的浓度之比。时，组分在固定相和流动相的浓度之比。4.4.4.4.分离度分离度分离度分离度第6页/共65页2023/3/307另有另有n=16Ln=16Ls s/W/W 2 2第7页/共65页2023/3/308 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 RfR1.000.750.50.250R Rf f=0.3,R=0.3,R最高最高R Rf f在在0.2-0.5,R0.2-0.5,R变化不大变化不大R Rf f0.10.1或或0.7,R0.7,R下降下降 第8页/共65页2023/3/3097.3 7.3 薄层色谱系统及其操作技术薄层色谱系统及其操作技术一一.薄层色谱系统组成薄层

8、色谱系统组成1.1.薄层板薄层板(1)(1)未改性固定相未改性固定相硅胶硅胶为使用最广泛的薄层材料为使用最广泛的薄层材料氧化铝氧化铝有碱性、中性、酸性有碱性、中性、酸性硅藻土硅藻土为化学中性吸附剂为化学中性吸附剂纤维素纤维素天然多糖类天然多糖类聚酰胺聚酰胺为特殊类型有机薄层材料，对为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性。能形成氢键的物质有特别的选择性。第9页/共65页2023/3/3010(2)(2)表面改性固定相表面改性固定相 疏水改性硅胶疏水改性硅胶化学键合烷基化学键合烷基 亲水改性硅胶亲水改性硅胶引入氨基、氰基、二羟基等，薄层板极性介于极性吸引入氨基、氰基、二羟基等，薄

9、层板极性介于极性吸附剂和疏水改性剂之间（附剂和疏水改性剂之间（极性次序：硅胶极性次序：硅胶氨基氨基氰基氰基二羟基二羟基 反反相相）。）。表面改性纤维素表面改性纤维素乙酰化纤维素乙酰化纤维素(3)(3)药典收载的固定相有药典收载的固定相有：硅胶类、硅藻土类、氧化铝类、微晶纤维素类等。：硅胶类、硅藻土类、氧化铝类、微晶纤维素类等。颗粒直径颗粒直径一般要求一般要求10 10 40 um 40 um。第10页/共65页2023/3/30112.2.载板载板玻璃板，放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻璃表面的油污。玻璃板，放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干净，干燥，置干

10、燥器中备用。要求光滑、平整、洗净后不附水然后充分漂洗干净，干燥，置干燥器中备用。要求光滑、平整、洗净后不附水珠。珠。3.3.黏结剂黏结剂(1)(1)无机黏结剂无机黏结剂石膏石膏（硫酸钙），添加石膏的吸附剂以字母（硫酸钙），添加石膏的吸附剂以字母“G G”表示。表示。没有黏结剂的吸附剂以字母没有黏结剂的吸附剂以字母“H H”表示。无机黏结剂的优点是：耐高温，耐表示。无机黏结剂的优点是：耐高温，耐酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固。薄层强度差。酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固。薄层强度差。第11页/共65页2023/3/3012(2)(2)有机黏结剂有机黏结剂羧甲基纤维素钠（羧甲基纤

11、维素钠（CMCCMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。(3)(3)荧光黏结剂荧光黏结剂在吸附剂中添加某种荧光指示剂，常用的荧光指示剂在吸附剂中添加某种荧光指示剂，常用的荧光指示剂 在在254nm254nm紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光素、硫化镉、阴极绿等。紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光素、硫化镉、阴极绿等。在在366nm366nm有荧光的指示剂如彩蓝等。有荧光的指示剂如彩蓝等。含有荧光指示剂的商品吸附剂以含有荧光指示剂的商品吸附剂以“F F”表示，并以下标

12、注明其激发光波长。例表示，并以下标注明其激发光波长。例 硅胶硅胶HFHF254254 第12页/共65页2023/3/30134.4.薄层板涂铺要求：薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂。例：。例：硅胶板（粒度硅胶板（粒度101040um40um）硅胶硅胶G G将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水加入比例量的水(一般为一般为1 1份固定相与份固定相与3 3份水份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。，迅速研磨均匀，立即涂铺。硅胶或硅胶硅胶或硅胶G G 以以CMCCM

13、C为黏合剂。配制为黏合剂。配制0.2%0.2%0.7%CMC0.7%CMC水溶液水溶液,放置放置过夜过夜,使悬浮的纤维沉降使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。取上层用来配制吸附剂匀浆。第13页/共65页2023/3/3014 反相薄层板制备反相薄层板制备以不同链长的正构烷烃为固定液以不同链长的正构烷烃为固定液,配制成适当浓度的溶液配制成适当浓度的溶液(如如5%5%硅酮油乙醚溶液硅酮油乙醚溶液),),浸渍硅胶板。浸渍硅胶板。5.5.薄层板活化薄层板活化 涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，

14、然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如：然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如：硅胶硅胶 110 1h110 1h 氧化铝氧化铝 110 30min110 30min第14页/共65页2023/3/30156.6.点样点样 要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，

15、以最小检测量的几倍倍几十倍为宜。几十倍为宜。手工点样工具：定容玻璃毛细管（手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 1 5 ul5 ul），微量注射器。），微量注射器。第15页/共65页2023/3/3016自动点样自动点样Limomat IV Limomat IV 喷样仪喷样仪样品溶液通过样品溶液通过气流成雾状喷向薄层，移动板台，使在气流成雾状喷向薄层，移动板台，使在薄层上流下样品条带。薄层上流下样品条带。特点特点：适合于大量稀样品溶液的喷加；：适合于大量稀样品溶液的喷加；条带宽度不超过条带宽度不超过2 mm2 mm，有利于改善，有利于改善分辨率；便于狭缝式光密度计扫描；分辨率；便于狭缝式光密度计扫

16、描；要求薄层板强度高。要求薄层板强度高。自动薄层色谱点样仪自动薄层色谱点样仪由计算机控制。由计算机控制。药典规定：点样基线距底边药典规定：点样基线距底边2.0 cm,2.0 cm,样点样点直径直径2-4mm,2-4mm,点间距离约为点间距离约为1.5-2.0 cm1.5-2.0 cm。第16页/共65页2023/3/30177.7.展开方式展开方式 多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以7575 为最佳。展开距离一般为为最佳。展开距离一般为10-15 cm10-15 cm。多次展开多次展开一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂一次展开

17、未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。展开，可重复多次，直到混合物分离为止。分步展开分步展开混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。同溶剂依次展开不同距离。第17页/共65页2023/3/3018连续展开连续展开使到达薄层上缘的溶剂不断使到达薄层上缘的溶剂不断蒸发，连续展开以增加展开距离。因无溶蒸发，连续展开以增加展开距离。因无溶剂前沿，需要有个参照物同时展开，以计剂前沿，需要有个参照物同时展开，以计算相对保留值。算相对保留值。二维展开二维展开在两个垂

18、直的方向上进行展在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成原展开方向成90 90 的方向进行展开。的方向进行展开。原点12第18页/共65页2023/3/3019离心展开离心展开薄层板以适当转速旋转时，流薄层板以适当转速旋转时，流动相以适当速率转移到薄层上。该技术主要用动相以适当速率转移到薄层上。该技术主要用于制备色谱。于制备色谱。锲尖技术锲尖技术圆形离心展开具有分辨率高的圆形离心展开具有分辨率高的优点，但需要有一定的仪器装置。采用锲尖技优点，但需要有一定的

19、仪器装置。采用锲尖技术可以在一般的展开室中进行类似展开。术可以在一般的展开室中进行类似展开。薄层被刮掉部分溶剂前沿 第19页/共65页2023/3/30208.8.检测检测物理方法物理方法紫外光下显示荧光或荧光淬灭紫外光下显示荧光或荧光淬灭化学方法化学方法加化学试剂显色，要求显色稳定、加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏、线性良好。持久、专属、灵敏、线性良好。斑点定位方法斑点定位方法碘蒸气法碘蒸气法灵敏、简便，为通用显色法。灵敏、简便，为通用显色法。将碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，将碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内充满紫色的碘蒸气。将展开后的板挥使缸内充满紫色的碘蒸气

20、。将展开后的板挥干溶剂置碘缸中至薄层色谱上出现棕色斑点。干溶剂置碘缸中至薄层色谱上出现棕色斑点。放置时间不宜太长，否则背景吸附剂也吸附放置时间不宜太长，否则背景吸附剂也吸附碘，使信噪比降低。用针头将斑点标记下来，碘，使信噪比降低。用针头将斑点标记下来，放在通风处使碘挥发。放在通风处使碘挥发。第20页/共65页2023/3/3021流动相与展开体系1.1.液液-固吸附固吸附 在该色谱中，溶质的保留和在该色谱中，溶质的保留和分离选择性决定于三个因素：分离选择性决定于三个因素：溶解能力流动相溶质吸附剂相互作用竞争一.展开体系:第21页/共65页2023/3/30222.2.液液-液分配液分配 基于组

21、分在互不相溶的两相间的溶解度不同而实现分离的一种展开系统。可在展开基于组分在互不相溶的两相间的溶解度不同而实现分离的一种展开系统。可在展开前，将薄层板浸入某种液体固定相。实际上在前，将薄层板浸入某种液体固定相。实际上在TLCTLC中，分配与吸附是并存的（大气中，分配与吸附是并存的（大气中水分也是一种固定相）。中水分也是一种固定相）。3.3.此外还有：化学键合相反相展开、化学键合相正相展开、离子交换、离子对色谱、此外还有：化学键合相反相展开、化学键合相正相展开、离子交换、离子对色谱、凝胶、胶束、手性展开。凝胶、胶束、手性展开。第22页/共65页2023/3/3023二二.溶剂强度参数和选择性溶剂

22、强度参数和选择性1.1.溶剂的强度参数溶剂的强度参数 定义：溶剂强度参数用定义：溶剂强度参数用表示。表示。流动相强度越高，表示它与吸附剂相互流动相强度越高，表示它与吸附剂相互作用力强作用力强。溶质的溶质的R Rf f值就越大值就越大,但选择性越小。但选择性越小。为得到满意的分离，选为得到满意的分离，选用的流动相使溶质的用的流动相使溶质的R Rf f值在值在0.25 0.25 0.75 0.75之间为宜。之间为宜。溶剂强度也可用其在水中的溶解度参数溶剂强度也可用其在水中的溶解度参数 来表示。来表示。第23页/共65页2023/3/3024一些常用溶剂的溶剂强度与溶解度参数一些常用溶剂的溶剂强度与

23、溶解度参数溶剂溶剂 溶剂溶剂 正己烷正己烷 0.01 7.3 0.01 7.3 环己烷环己烷 0.04 0.04 8.28.2苯苯 0.32 9.2 0.32 9.2 乙醚乙醚 0.38 7.40.38 7.4二氯甲烷二氯甲烷 0.42 9.6 0.42 9.6 正丙醇正丙醇 0.82 0.82 10.210.2正丁醇正丁醇 0.70 /0.70 /四氢呋喃四氢呋喃 0.57 0.57 9.19.1乙酸乙酯乙酸乙酯 0.58 8.6 0.58 8.6 氯仿氯仿 0.40 0.40 9.19.1甲乙酮甲乙酮 0.51 /0.51 /二氧六环二氧六环 0.56 0.56 9.89.8吡啶吡啶 0.

24、71 10.4 0.71 10.4 丙酮丙酮 0.50 0.50 9.49.4乙醇乙醇 0.88 /0.88 /乙酸乙酸 1.00 12.41.00 12.4二甲亚砜二甲亚砜 0.75 12.8 0.75 12.8 甲醇甲醇 0.95 0.95 12.912.9乙二醇乙二醇 1.11 14.7 1.11 14.7 甲酰胺甲酰胺 /17.9 17.9 第24页/共65页2023/3/30252.2.溶剂优化规则：溶剂优化规则：增加溶剂强度增加溶剂强度，使，使R Rf f值增大，但也可能降低值增大，但也可能降低分离能力。分离能力。流动相中较强组分的流动相中较强组分的体积比体积比小于小于5%5%或大

25、于或大于50%50%，选择性最大，此时最有利于溶质与流动相，选择性最大，此时最有利于溶质与流动相组分的选择性相互作用。组分的选择性相互作用。用乙醚或甲醇代替流动相中的一种较强组分，用乙醚或甲醇代替流动相中的一种较强组分，由于形成由于形成氢键氢键可改善选择性。可改善选择性。若出现斑点拖尾，可向流动相中加少量水，若出现斑点拖尾，可向流动相中加少量水，或或降低薄层活性降低薄层活性，有利于改善分离。，有利于改善分离。也可采用两种强溶剂与一种弱溶剂组成的三也可采用两种强溶剂与一种弱溶剂组成的三元元混合流动相混合流动相，此时，溶剂强度由弱溶剂控，此时，溶剂强度由弱溶剂控制，而溶剂选择性则由两强溶剂控制。制

26、，而溶剂选择性则由两强溶剂控制。第25页/共65页2023/3/30263.3.斑点的扩散与形状斑点的扩散与形状 在在TLCTLC中斑点的移动与扩散是二维的，因为斑点在展开方向和与之垂直方向上的中斑点的移动与扩散是二维的，因为斑点在展开方向和与之垂直方向上的扩散速度是不相等的，展开剂的移动速度也是不等的，在单位体积或单位质量薄扩散速度是不相等的，展开剂的移动速度也是不等的，在单位体积或单位质量薄层内所含的溶剂量越接近溶剂前沿减少得越明显，直至溶剂前沿时为零，这一现层内所含的溶剂量越接近溶剂前沿减少得越明显，直至溶剂前沿时为零，这一现象称为象称为“溶剂的体积梯度溶剂的体积梯度”，在各种展开形式中

27、均存在。当然，对于这一问题实，在各种展开形式中均存在。当然，对于这一问题实际上只是在定量斑点浓度时才需要考虑。际上只是在定量斑点浓度时才需要考虑。第26页/共65页2023/3/3027 同时同时一种成分的色谱行为会受到混合物中其他成分的影响一种成分的色谱行为会受到混合物中其他成分的影响，这种影响的大小取决于混，这种影响的大小取决于混合成分的种类、浓度、以及斑点间的距离等。这种影响一般使分配系数变小。如两个合成分的种类、浓度、以及斑点间的距离等。这种影响一般使分配系数变小。如两个相邻斑点中后面的一个展开速度较其单独展开时为大。相邻斑点中后面的一个展开速度较其单独展开时为大。第27页/共65页2

28、023/3/30284.4.固定相的活度及其调节固定相的活度及其调节 在其他因素一定时，固定相活度增加，在其他因素一定时，固定相活度增加，R Rf f值减少，值减少，反之亦然。可通过预吸附溶剂分子，调节其表面反之亦然。可通过预吸附溶剂分子，调节其表面活性。例如可将活化薄层板放在相对湿度恒定的活性。例如可将活化薄层板放在相对湿度恒定的空间里来达到调节活度的目的。空间里来达到调节活度的目的。实际工作中常常使固定相预吸附一定量单一或混实际工作中常常使固定相预吸附一定量单一或混合溶剂蒸气，预吸附量越大，溶剂前沿运动速度合溶剂蒸气，预吸附量越大，溶剂前沿运动速度越快，物质斑点的越快，物质斑点的R Rf

29、f值越小。值越小。预吸附还可能影响预吸附还可能影响R Rf f在在0.6-1.00.6-1.0之间的斑点的分离。之间的斑点的分离。第28页/共65页2023/3/3029在层析过程中发生的在层析过程中发生的边缘效应边缘效应就是由于这种因素就是由于这种因素引起的。尤其是使用混合溶剂时，极性较弱和沸引起的。尤其是使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，分的展开剂中极性溶剂的比例增大，R Rf f相对增大。相对增大。同一物质在同一薄层板上出现中间部分的同一物质在同一薄层板上出现中间部分的R Rf

30、f值比值比边缘的边缘的R Rf f值小值小，即边缘效应，若在展开前先将展，即边缘效应，若在展开前先将展开槽与薄层板用开槽与薄层板用展开剂蒸气饱和后再展开展开剂蒸气饱和后再展开，边缘，边缘效应可消失。采用双槽层析缸尤为有利。效应可消失。采用双槽层析缸尤为有利。第29页/共65页2023/3/3030预吸附中展开中展开过程中用不同于展开剂的溶剂调节槽内气氛第30页/共65页2023/3/30317.4 7.4 薄层色谱法定性、定量方法薄层色谱法定性、定量方法一一.定性方法定性方法 利用保留值利用保留值 测定测定R Rf f值值 测定相对测定相对R Rf f值，即值，即R Rx x值。值。利用二维色

31、谱（改变色谱条件，比较利用二维色谱（改变色谱条件，比较R Rf f值是否一致）值是否一致）sb1b2b2sb1sb1b2点样第一次展开第二次展开第31页/共65页2023/3/3032 通过板上光谱图定性通过板上光谱图定性 直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光谱图，与平行点加的标准斑直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。点的图谱对照。可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用计算机检索定性。可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用计算机检索定性。与其他技术连用与其他技术连用 TLC-TLC-付里叶变换付里叶变换IRIR联用联用 TLC-MSTLC-MS联用联用

32、第32页/共65页2023/3/3033二二.定量方法定量方法1.1.间接定量间接定量将薄层分离后物质斑点定量地将薄层分离后物质斑点定量地洗脱下来，再对洗脱液定量。洗脱下来，再对洗脱液定量。分光光度法、分光光度法、HPLCHPLC法、法、GCGC法、质谱法法、质谱法2.2.直接定量直接定量斑点面积测量斑点面积测量用透明纸覆盖在薄层表用透明纸覆盖在薄层表面，描出斑点界限，然后测量其面积。面，描出斑点界限，然后测量其面积。目测法目测法比较系列标准与样品的斑点面比较系列标准与样品的斑点面积大小、颜色深浅，得到样品的含量范围。积大小、颜色深浅，得到样品的含量范围。3.3.薄层仪扫描定量薄层仪扫描定量第

33、33页/共65页2023/3/3034定量计算定量计算外标法：此法是薄层定量最常用的方法。外标法：此法是薄层定量最常用的方法。定量时，点样量必须准确，样品与对照品定量时，点样量必须准确，样品与对照品应点在同一块薄层板上。用已知含量的对应点在同一块薄层板上。用已知含量的对照品得出样品含量的一种方法。照品得出样品含量的一种方法。内标法内标法:选一个纯度高、化学性质稳定、选一个纯度高、化学性质稳定、在薄层上能与对照品分开的物质作内标物在薄层上能与对照品分开的物质作内标物，并准确称取加到被测物中，根据内标物的并准确称取加到被测物中，根据内标物的质量算出被测物的含量。质量算出被测物的含量。第34页/共6

34、5页2023/3/3035 精密度精密度 重复性重复性当待测组分的含量达当待测组分的含量达0.5 ug/0.5 ug/斑点时斑点时,方法的重复性方法的重复性 (RSD)(RSD)应在应在3.0%3.0%以内。以内。中间精密度中间精密度多数情况下，多数情况下，RSDRSD应在应在5.0%5.0%以内。以内。再现性再现性RSDRSD一般应在一般应在10%10%以内。以内。方法认证 选择性选择性以分离度表示，待测组分的以分离度表示，待测组分的R Rf f值在值在0.3 0.3 0.7 0.7之间之间 稳定性稳定性考察在采样、样品预处理、贮存、展开，展开后处理等过考察在采样、样品预处理、贮存、展开，展

35、开后处理等过程中的样品稳定性。程中的样品稳定性。线性与范围线性与范围相应于待测组分检出量的相应于待测组分检出量的20%-120%20%-120%范围。范围。灵敏度灵敏度通常以标准曲线的斜率表示。通常以标准曲线的斜率表示。第35页/共65页2023/3/3036三.薄层扫描1.1.薄层定量方法薄层定量方法:直接法直接法测定光照射色谱后，因被测物测定光照射色谱后，因被测物斑点的存在引起的透射光和反射光的变化。斑点的存在引起的透射光和反射光的变化。并通过随行标准比较待测斑点的量。并通过随行标准比较待测斑点的量。间接法间接法将部分照射光的能量转换成较将部分照射光的能量转换成较长波长的荧光，即长波长的荧

36、光，即荧光荧光测量。测量。薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄层空白处光学响应信号的差值。斑点和薄层空白处光学响应信号的差值。第36页/共65页2023/3/3037透射光法透射光法测定组分对应的斑点测定组分对应的斑点对特定波长光的吸收对特定波长光的吸收度来确定含量。将薄度来确定含量。将薄层板从左至右移动，层板从左至右移动，对斑点扫描，单色光对斑点扫描，单色光透过薄层板后被记录透过薄层板后被记录下来，将测得的吸收下来，将测得的吸收度对度对R Rf f值绘制扫描曲值绘制扫描曲线，得薄层色谱图线，得薄层色谱图光源单色器第37页/共65页2023/3/30

37、38反射光法反射光法一定波长的光照射一定波长的光照射薄层，穿进薄层内薄层，穿进薄层内的光部分被薄层吸的光部分被薄层吸收，部分经过漫反收，部分经过漫反射又折回表面成为射又折回表面成为反射光。当对薄层反射光。当对薄层进行扫描时，测量进行扫描时，测量其反射吸收度，可其反射吸收度，可得到反射光谱。反得到反射光谱。反射吸收度与物质含射吸收度与物质含量有确定关系，可量有确定关系，可进行定量。进行定量。光源单色器第38页/共65页2023/3/3039扫描方式扫描方式直线式扫描直线式扫描照照射在薄层板上的光束射在薄层板上的光束与薄层板作直线相对与薄层板作直线相对运动。光束固定，扫运动。光束固定，扫描板台运动

38、。光束落描板台运动。光束落在薄层上的截面为一在薄层上的截面为一长方形带。长方形带。锯齿式扫描锯齿式扫描照照射在薄层板上的光束射在薄层板上的光束与薄层板的相对运动与薄层板的相对运动轨迹呈锯齿形或矩形。轨迹呈锯齿形或矩形。直线扫描锯齿扫描轮廓曲线积分曲线第39页/共65页2023/3/3040斑点斑点A B CABCCAB对于不规则斑点，两种扫描结果不一样。同一斑点从A、B、C三个不同方向扫描，锯齿扫描所得积分值变动小，而直线扫描所得积分值变动大。第40页/共65页2023/3/30412.2.光学系统光学系统单光束单波长单光束单波长受光源稳定性和薄层质受光源稳定性和薄层质量影响严重。量影响严重。

39、单光束双波长单光束双波长对背景不均匀引起的干对背景不均匀引起的干扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。双光束单波长双光束单波长可补偿光源不稳引起的可补偿光源不稳引起的误差，但对板层不均匀无作用。误差，但对板层不均匀无作用。光单色器检测器光波长1波长2检测器斩波器光单色器分光镜检测器检测器第41页/共65页2023/3/3042测量方式测量方式吸光度测量吸光度测量测定的是测定的是漫反射光漫反射光。适合。适合于本身有颜色或有紫外吸收的物质。于本身有颜色或有紫外吸收的物质。I0IR 检 测 器第42页/共65页2023/3/3043荧光测量荧光测量灵敏度较吸光度

40、测量高，板层灵敏度较吸光度测量高，板层不吸收发射光，测量噪音小，基线稳定。为不吸收发射光，测量噪音小，基线稳定。为消除激发光的影响，在板层和检测器之间必消除激发光的影响，在板层和检测器之间必须加一块滤光片，以截去反射激发光，只让须加一块滤光片，以截去反射激发光，只让发射的荧光抵达检测器。发射的荧光抵达检测器。滤光片荧光 检 测 器第43页/共65页2023/3/3044荧光淬灭测量荧光淬灭测量吸附剂有荧光，样品斑点无吸附剂有荧光，样品斑点无荧光，在紫外光照射下，被测物在荧光背景上荧光，在紫外光照射下，被测物在荧光背景上显示出暗灰斑点。本法适合于本身无颜色，又显示出暗灰斑点。本法适合于本身无颜色

41、，又无特征紫外吸收或荧光的物质。该测量技术有无特征紫外吸收或荧光的物质。该测量技术有三种形式：三种形式：测荧光测紫外光测紫外和荧光第44页/共65页2023/3/3045 扫描定量中的标准曲线校正扫描定量中的标准曲线校正 薄层板上由于光被吸附剂散射，不能得到象通常溶液测定时的吸光度和薄层板上由于光被吸附剂散射，不能得到象通常溶液测定时的吸光度和浓度之间的简单直线关系。即物质浓度越大，薄层试样板上测定的反射浓度之间的简单直线关系。即物质浓度越大，薄层试样板上测定的反射吸光度比直线关系所示值越低。扫描仪系统设计时考虑到这一问题，采吸光度比直线关系所示值越低。扫描仪系统设计时考虑到这一问题，采用微机

42、处理使标准曲线直线化。在理论曲线上选择吸光度用微机处理使标准曲线直线化。在理论曲线上选择吸光度0 10 1之间的之间的7 7个点，将各吸光度值转换为直线上的值，得到一条通过原点的直线。个点，将各吸光度值转换为直线上的值，得到一条通过原点的直线。第45页/共65页2023/3/3046吸光度1.00物质量经变换后的直线理论曲线直线化方法示意图校正过度校正适当校正不足未校正试样量积分值校正情况判断第46页/共65页2023/3/3047使用直线化功能时的注意事项使用直线化功能时的注意事项发色试样发色试样的测定的测定对于没有吸收的试样进行对于没有吸收的试样进行发色测定时，一般不使用直线化功能就可以得

43、发色测定时，一般不使用直线化功能就可以得到近似的直线关系。到近似的直线关系。试样变质试样变质时时试样展开后，应马上进行测定，试样展开后，应马上进行测定，如果放置一星期后再测定。即使近似地呈直线如果放置一星期后再测定。即使近似地呈直线状也往往不能通过原点，认为是试样变质所引状也往往不能通过原点，认为是试样变质所引起的。起的。展开距离展开距离同一试样等量点样，同样展开，同一试样等量点样，同样展开，展开距离不同将引起误差。展开距离不同将引起误差。展开方法展开方法使用直线化功能定量时，为避免使用直线化功能定量时，为避免展开距离不同产生的误差，实际定量时，将已展开距离不同产生的误差，实际定量时，将已知浓

44、度的标准品在同一块板上展开是较理想的。知浓度的标准品在同一块板上展开是较理想的。第47页/共65页2023/3/30487.5 7.5 薄层色谱法的应用薄层色谱法的应用 药物鉴别药物鉴别药物鉴别采用标准对照法采用标准对照法采用标准对照法 杂质检查杂质检查杂质检查 杂质对照品法杂质对照品法杂质对照品法 高低浓度法高低浓度法高低浓度法 药物标准品对照法药物标准品对照法药物标准品对照法 不允许有杂质斑点存在，即以方法灵敏度不允许有杂质斑点存在，即以方法灵敏度不允许有杂质斑点存在，即以方法灵敏度来控制杂质量。来控制杂质量。来控制杂质量。含量测定含量测定含量测定主要用于中药有效成分的分析主要用于中药有效

45、成分的分析主要用于中药有效成分的分析第48页/共65页2023/3/30491.药方面的应用2.生物样品与毒物分析3.环境有害物质的分析4.食品分析5.其他方面的应用与展望第49页/共65页2023/3/3050应用薄层扫描即薄层色谱与紫外分光光度或荧光光度分析联用，可进行各种药物的定量分析。应用硅胶GF 色谱板，杜迎翔等分离了合成药物铋甲西林片中的阿莫西林甲硝唑，谢苏婧等分离了尼美舒利胶囊中的尼美舒利，黄劲梅分离了施保利通口服液中的马卡因、月桂仑中的氮酮，分离后不必洗脱即可直接在薄层扫描仪上用双波长反射法锯齿扫描，准确测定各合成药物制剂中药物成分的含量。第50页/共65页2023/3/305

46、1 此法更广泛应用于中草药与中成药主要有效成分定此法更广泛应用于中草药与中成药主要有效成分定量分析，如应用各种改性硅胶量分析，如应用各种改性硅胶G G薄层色谱，马柏林等薄层色谱，马柏林等分离了杜仲叶中桃叶珊瑚甙，张尊听等分离了葛根、分离了杜仲叶中桃叶珊瑚甙，张尊听等分离了葛根、葛根注射液、玉泉丸中的葛根素葛根注射液、玉泉丸中的葛根素;李多伟等分离了芦李多伟等分离了芦荟中的芦荟甙、银杏外种皮中的白果酸荟中的芦荟甙、银杏外种皮中的白果酸;陈代贤等分陈代贤等分离了真伪土茯苓中的土茯苓，葛早川等分离了黄连、离了真伪土茯苓中的土茯苓，葛早川等分离了黄连、香连丸、加味左金丸中的小檗碱、巴马汀和药根碱，香连

47、丸、加味左金丸中的小檗碱、巴马汀和药根碱，然后用双波长反射锯齿薄层扫描定量分析各有效成然后用双波长反射锯齿薄层扫描定量分析各有效成分。康纯等用聚酰胺薄层色谱板分离了槐花米、黄分。康纯等用聚酰胺薄层色谱板分离了槐花米、黄芩复方芦丁片、双黄连口服液中的黄酮类化合物，芩复方芦丁片、双黄连口服液中的黄酮类化合物，并直接进行薄层扫描定量分析。李素琴应用硅胶并直接进行薄层扫描定量分析。李素琴应用硅胶6060色谱板分离了蟾酥中的哇巴因，将哇巴因斑点洗脱色谱板分离了蟾酥中的哇巴因，将哇巴因斑点洗脱液进行反向高效液相色谱定量分析。液进行反向高效液相色谱定量分析。第51页/共65页2023/3/3052薄层色谱法

48、分析的生物样品多为血清、血浆或尿液等，用来进行药物生物利用度的分析，检测临床用药的血药浓度，以利于诊断临床疾病等。毒物分析的内容比较广泛，包括植物毒素、真菌毒素、兴奋剂、药物中毒、走私毒品、农药以及尸检、刑侦破案等方面的样品分析。第52页/共65页2023/3/3053 在生物样品分析领域，应用高效硅胶在生物样品分析领域，应用高效硅胶G G薄层板薄层板分析了尿样中生物样品氯硝西泮代谢物分析了尿样中生物样品氯硝西泮代谢物7 7一氨基一氨基氯硝西泮；氯硝西泮；UchikobaUchikoba等应用硅胶等应用硅胶GF GF 薄层板分薄层板分析了血红素中类胰岛素酶；应用经析了血红素中类胰岛素酶；应用经

49、0.27mol0.27molL L、pH=7pH=7的的EDTAEDTA溶液修饰的硅胶溶液修饰的硅胶G G薄层扫描；定量薄层扫描；定量分析了血样、尿样中的氟罗沙星和司帕沙星。分析了血样、尿样中的氟罗沙星和司帕沙星。在毒物分析方面在毒物分析方面,应用硅胶应用硅胶GFGF薄层板分析了咖薄层板分析了咖啡因、安替比林、吗啡、安定等啡因、安替比林、吗啡、安定等5050种毒物。种毒物。第53页/共65页2023/3/3054 3.3.环境有害物质的分析环境有害物质的分析 主要包括农药及农药残留分析、有毒金属测定和多环芳烃测定等。Nemergut等应用单波长反射薄层扫描定量分析了土壤中多环芳香烃苯并a芘，殷

50、少元等应用硅胶GF 薄层色谱与CGMS联用分析了水中残存农药灭多威，应用硅胶GF 薄层板定性分析了有机磷农药甲胺磷，Mahammad应用硅胶G+氧化铝G+微晶纤维素+硅藻土G自制板。第54页/共65页2023/3/3055 4.4.4.4.食品分析食品分析食品分析食品分析薄层色谱法还应用于分离测定食品中所含有的碳水薄层色谱法还应用于分离测定食品中所含有的碳水化合物、维生素、有机酸、氨基酸等天然营养成分，化合物、维生素、有机酸、氨基酸等天然营养成分，也用于食品添加剂如色素、防腐剂等，以及某些真也用于食品添加剂如色素、防腐剂等，以及某些真菌毒素如黄曲霉毒素的分析。应用硅胶菌毒素如黄曲霉毒素的分析。