蛋白质分子基础蛋白质制备.pptx

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1、蛋白质的电泳第1页/共45页蛋白质的电泳分离电泳分离的原理:蛋白质是两性电解质,在一定的pH下,可以解离为带电荷的离子。在电场中可以电泳移动。电泳迁移率：带电颗粒在溶液中迁移速度的快慢，用电泳迁移率(M)表示：M为迁移率；dL为颗粒移动的距离；L为通电的时间。E为两个电极之间的电势差。M=EtdL第2页/共45页影响蛋白质电泳迁移率的因素蛋白质分子的性质。分子的电荷、大小和形状。电场 与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度 缓冲液离子强度增大，样品所带电荷降低，样品的泳动速度会减缓。支持介质 纸的吸附作用最大，醋酸纤维素吸附作用较小。第3页/共45页电泳的类型自由界面电泳使用支持物的区带电泳。区

2、区带带电电泳泳是是在在半半固固相相或或胶胶状状介介质质上上加加一一个个点点或或一一薄薄层层样样品品溶溶液液，然然后后加加电电场场，分分子子在在支支持持介介质质上上或或支支持持介介质质中中迁迁移移。支支持持介介质质的的作作用用主主要要是是为为了了防防止止机机械械干干扰扰和和由由于于温温度度变变化化以以及及大大分分子子溶溶液液的的高高密密度度而而产产生生的的对对流。流。区区带带电电泳泳使使用用不不同同的的支支持持介介质质，早早期期有有滤滤纸纸、玻玻璃璃珠珠、淀淀粉粉粒粒、纤纤维维素素粉粉、海海砂砂、海海绵绵、聚聚氯氯乙乙烯烯树树脂脂；以以后后有有淀淀粉粉凝凝胶胶、琼琼脂脂凝凝胶胶、醋醋酸酸纤纤维维

3、素素膜膜，现现在在则则多多用聚丙烯酰胺（用聚丙烯酰胺（PAGEPAGE）和琼脂糖凝胶。）和琼脂糖凝胶。第4页/共45页聚丙烯凝胶电泳SDS-PAGE凝胶等电聚焦第5页/共45页SDS-PAGE电泳在蛋白质中加入摩尔比为1.4：1(SDS:蛋白质)的SDS(十二烷基硫酸钠)。使所有蛋白质都带上负电。SDS是阴离子去污剂，能与蛋白质的疏水部分结合，并且把大部分蛋白质拆成组成他的亚基形式。在上样缓冲液中加入巯基乙醇，可以使二硫键还原为巯基。使不同的蛋白质分子的短轴一致，长轴与蛋白质的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白质电泳的速度不再取决于蛋白质的电荷与形状，只与蛋白质的分子量有关。第6页/共45页

4、SDS-PAGE电泳当当分分子子量量在在15KD15KD到到200KD200KD之之间间时时，蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率和和分分子子量量的的对对数数呈呈线线性性关关系，符合下式：系，符合下式：logM=K-bXlogM=K-bX MM为为分分子子量量，X X为为迁迁移移率率，k k、b b均均为为常常数数，若若将将已已知知分分子子量量的的标标准准蛋蛋白白质质的的迁迁移移率率对对分分子子量量对对数数作作图图，可可获获得得一一条条标标准准曲曲线线，未未知知蛋蛋白白质质在在相相同同条条件件下下进进行行电电泳泳，根根据据它它的的电电泳泳迁迁移移率率即即可可在在标标准准曲曲线线上上求求得得分分子子量。

5、量。第7页/共45页SDS-PAGE电泳绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。第8页/共45页SDS-PAGE电泳PAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连连续续系系统统和和不不连连续续系系统统两两大大类类，连连续续系系统统电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同，带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下，主要靠电荷和分子筛效应。下，主要靠电荷和分子筛效应。不不连连续续系系统统中中由由于于

6、缓缓冲冲液液离离子子成成分分，pHpH，凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛筛效效应应，还还具具有有浓浓缩缩效效应应，因因而而其其分分离离条条带带清清晰晰度度及及分分辨辨率率均较前者佳。均较前者佳。第9页/共45页不连续不连续SDS-PAGE各部分凝胶配制各部分凝胶配制电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在定在10mA，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶，溴酚蓝距凝胶边缘约边缘约5mm时，停止电泳。时，

7、停止电泳。第10页/共45页第11页/共45页第12页/共45页fraction S1(SRA)兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B MW=97,400 MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200MW=66,200兔肌动蛋白兔肌动蛋白 MW=43,000MW=43,000牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000MW=31,000胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100MW=20,100鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400第13页/共45页SDS-PAGE应注意的几个问题制备凝胶时，TEMED要加胶之前再加。电泳之前蛋白质要溶解在含1%的SDS和1%

8、的巯基乙醇的磷酸缓冲液(0.01 mol/L,pH 7.2),1000C加热25分钟。如凝胶中含有杂质，可以在加入样品前先预电泳0.51小时。SDS与蛋白质分子结合后，蛋白质分子的构象发生变化，解离为亚单位，电泳结果显示的只是亚单位的大小，同时蛋白质也会失去原来的活性。已发现有些蛋白质不能用已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGESDS-PAGE测定分测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白糖蛋白）以及一些）以及一些结结构蛋白，如胶原蛋白等构蛋白，如胶原蛋白等。第14页/共45页等电聚焦电泳 蛋白质是

9、带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。第15页/共45页等电聚焦电泳根据要分离的蛋白质的pI的不同，订购不同pH梯度的凝胶，可以对蛋白质样品进行分离。如3.59.5、2.56.0、5.08

10、.5、7.510等。凝胶的pH值范围越窄，分辨力越高。可分离等电点相差0.01个pH单位的蛋白质，最高可以分辨0.0025个pH单位的蛋白质。等电凝胶可以抵消扩散作用，蛋白质可以富集在很窄的区带上。适用于少量蛋白质样品的分析鉴定，不适用于大量制备。要求用无盐的溶液，而蛋白质在无盐溶液中容易沉淀；在等电点发生沉淀和变性的蛋白质也不适合用次方法分离。第16页/共45页第17页/共45页第18页/共45页pI的测定可以用染色法观察蛋白质，然后用表面电极直接测量pH值。或将凝胶切成小块，加蒸馏水，再捣碎凝胶块并且测量pH。第19页/共45页双向电泳双向电泳:由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS

11、-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。19751975年，O OFarrellFarrell首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出11001100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白质组学的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。第20页/共45页第21页/共45页第22页/共45页PAGE电泳分离的大分子的检测考马斯亮蓝染色法 可检出0.31ug的蛋白质。银染色法 银离子与蛋白质以盐或配价络盐的形式结合，用甲醛将银离子还原为可见的银

12、颗粒。可检测ng水平的蛋白质。荧光染色技术 荧光合成物质与PAGE上的蛋白质发生反应，发出强烈的荧光，可检测到PAGE中的蛋白质。第23页/共45页免疫印迹法蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。具体操作为经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放

13、射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。第24页/共45页免疫印迹法抗原包被的实验膜条抗原包被的实验膜条 特异性人抗体特异性人抗体标记的二抗标记的二抗标记标记第25页/共45页免疫印迹法第26页/共45页蛋白质的结晶第27页/共45页蛋白质的结晶可以作为蛋白质提纯的方法之一。蛋白质纯度达到一定值时可以结晶。通过反复重结晶可以除去其中的杂质，使蛋白质得到更大程度的纯化。蛋白质结晶体是比较稳定的结构，所以结晶可以作为一个稳定的储存的方法。在蛋白质结晶之后，可以提供作X射线衍射分析用的材料，来分析蛋白质的结构等数据。第28页/共45页蛋白质结晶的原

14、理蛋白质溶液在合适的过饱和状态，溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形式，可以形成晶核。溶质分子以相互碰撞的作用方式有序而反复地堆砌在晶核上，直到晶核成长到晶体，最后从溶液中析出。第29页/共45页晶体结晶的条件蛋白质纯度越高，结晶越容易，至少要在50%以上。蛋白质浓度。浓度越高，结晶机会越大。但过大会因杂质存在而导致晶形不好。一般结晶的蛋白质浓度在1050 mg/mL。温度。蛋白质结晶温度在0400C。一般在40C冷室或250C温箱中进行。pH。一般在蛋白质的等电点的pH附近结晶。金属离子和离子强度。一些二价离子可以引起或有利于蛋白质的结晶过程。沉淀剂。沉淀剂(如盐类和各种有机溶剂)可改变蛋白

15、质的溶解度。理想的沉淀剂有：聚乙二醇(PEG)和2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。第30页/共45页蛋白质结晶方法盐析法 在蛋白质溶液中加入盐，使蛋白质溶解度降低，之后以结晶形式从溶液中析出。有机溶剂法 有机溶剂可以使蛋白质介电常数降低，导致蛋白质结晶析出。等电点结晶。蛋白质在等电点时溶解度最小，可以形成结晶。脱盐结晶。一些球蛋白溶于盐而几乎不溶于水，可将溶于盐溶液的蛋白质结晶而出，然后透析除盐。温差除盐。适用于一些对温度敏感的蛋白质，不同温度溶解度变化大。可运用此法。金属离子。在某些蛋白质溶液中加入金属离子，可以促进晶体的形成。第31页/共45页蛋白质提纯过程中的定量第32页/共45页蛋白

16、质的定量(1)定氮法测量蛋白质含量测量蛋白质含量蛋白质含量（克蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数每克生物样品中含氮的克数 6.256.25第33页/共45页蛋白质的定量(2)双缩脲法 第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。双缩脲试剂的成分是质量浓度为0.1 g/mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.01 g/mL的硫酸铜溶液。在碱性溶液(NaOH)中,双缩脲(H2NOCNHCONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键,因此,含两个或亮个以上的肽键化合物尤其是蛋白质都可与双缩脲试剂发生颜色反应。第34页/共45

17、页双缩脲反应产物可在540 nm处进行比色测定可以测定蛋白质的含量，可测定范围为0.11.0 mg/mL。！此反应为肽及蛋白质特有的，而为氨基酸所没有的！此反应为肽及蛋白质特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。一个颜色反应。第35页/共45页蛋白质的定量(3)福林福林-酚试剂法：酚试剂法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，在酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，在600 600 nm nm 下测光下测光吸收。吸收。可根据测得的标准曲线计算可根据测得的标准曲线计算出蛋白质的含量。出蛋白质的含量。灵敏度较高灵敏度较高，可

18、达，可达2525 g-g-250 250 g/mlg/ml。灵敏度比。灵敏度比280 nm 280 nm 处的紫外吸收法处的紫外吸收法灵敏灵敏1010倍，比双缩脲法灵敏倍，比双缩脲法灵敏100100倍。倍。第36页/共45页蛋白质的定量(4)紫外吸收法紫外吸收法A.280nmA.280nm光吸收法光吸收法 根据得到的根据得到的280 nm280 nm的光吸收值与蛋白质的浓度正比，的光吸收值与蛋白质的浓度正比，可以测量蛋白质溶液中的浓度。可以测量蛋白质溶液中的浓度。B.280nmB.280nm和和260nm260nm的吸收差法的吸收差法 用用280nm280nm下的紫外吸收减去下的紫外吸收减去2

19、60nm260nm下的紫外吸收，可以下的紫外吸收，可以排除排除260nm260nm下由于核酸吸光带来的干扰。下由于核酸吸光带来的干扰。蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/mL)=1.45*A(mg/mL)=1.45*A280nm280nm-0.74*A-0.74*A260nm260nmC.215nmC.215nm和和225nm225nm的吸收差法的吸收差法 蛋白质的肽键在蛋白质的肽键在230nm230nm下有强吸收，下有强吸收，215nm215nm可以减少干可以减少干扰与光散射，再减去扰与光散射，再减去225nm225nm的光吸收可以减少非蛋白质的光吸收可以减少非蛋白质成分的误差。成分的误差。蛋白质浓

20、度蛋白质浓度(mg/mL)=0.144*(A(mg/mL)=0.144*(A215nm215nm-A-A225nm225nm)第37页/共45页蛋白质的定量(4)考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-25(G-25(Bradford法)在酸性溶液中,考马斯亮蓝和蛋白质通过疏水作用结合之后,由棕红色变为蓝色。可以在595nm进行比色测定，在0.011.0mg/mL的范围内，蛋白质浓度与光吸收呈直线关系。在直线上可以计算出蛋白质的浓度。第38页/共45页第39页/共45页蛋白质的纯度标准第40页/共45页蛋白质的纯度标准的检测A.电泳法（SDS-PAGE、等电聚焦等）第41页/共45页蛋白质的纯度标准的检测B.

21、层析性质的考察第42页/共45页蛋白质的纯度标准的检测C.蛋白质化学结构分析法将蛋白质进行N-端测序，如果每摩尔蛋白质能得到相同摩尔数的N-末端的氨基酸，则说明纯度较高。或者对样品进行总的氨基酸的测序分析，如果所有的氨基酸是成整数比，则说明得到的是纯的蛋白质。第43页/共45页蛋白质的纯度标准的检测.其他方法纯蛋白质的280/A260为1.75。酶活力的测定：随着蛋白质中杂质逐渐被除去，酶中不再含杂质时。在一定的反应体系中，酶的比活会达到一个恒定的最大值。也可以作为蛋白质纯度的一个指标。蛋白质含金属或其他紧密结合的辅助因子，其在纯化过程中会逐渐增加，当它到达一个恒定的最大的比例时，可以认为蛋白质已经纯化了。第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页