药物分析甾体激素类药物分析.pptx

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1、第一节第一节 基本结构和分类基本结构和分类一、基本结构：一、基本结构：环戊烷并多氢菲母核环戊烷并多氢菲母核第1页/共47页二、分类与结构特征二、分类与结构特征分类分类 两大类两大类 肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素 性激素性激素 简称简称皮质激素皮质激素 雄性激素与蛋白同化激素雄性激素与蛋白同化激素 雌激素、孕激雌激素、孕激素素第2页/共47页（一）肾上腺皮质激素（一）肾上腺皮质激素本类药物均可视作本类药物均可视作皮质酮皮质酮的的衍生物衍生物 （I）皮质酮皮质酮 （II）氢化可的松氢化可的松 corticosterone hydrocortisone第3页/共47页 （III）地塞米松磷酸钠地塞米

2、松磷酸钠 （IV）醋酸氟轻松醋酸氟轻松第4页/共47页主要结构特征主要结构特征（1）A环环的的C3上有上有酮基酮基；C4/C5间有间有双键双键，并与，并与C3酮基共轭酮基共轭，称为，称为，-不饱和酮不饱和酮，标记为标记为 4-3-酮酮。（2）D环环的的C17上有上有-醇酮基醇酮基（-ketol）侧链（）侧链（）。）。（3）合成甾体合成甾体抗炎药在结构上多具有抗炎药在结构上多具有C1/C2间间双键双键；C6-、C9-卤素卤素；C16-羟基羟基、甲甲基基；C17-羟基羟基等取代基。等取代基。如：地塞米松磷酸钠、醋酸氟轻松。如：地塞米松磷酸钠、醋酸氟轻松。第5页/共47页（二）雄性激素与蛋白同化激素

3、（二）雄性激素与蛋白同化激素睾酮睾酮（睾丸素睾丸素）衍生物衍生物某些蛋白同化激素在某些蛋白同化激素在C10上上无无19-角甲基角甲基，如，如苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙。中国药典收载的原料与制剂：丙酸睾酮、十一酸睾酮、甲睾酮、硫酸中国药典收载的原料与制剂：丙酸睾酮、十一酸睾酮、甲睾酮、硫酸普拉睾酮钠。普拉睾酮钠。（V）睾丸素睾丸素 （VI）苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙 testosterone nandrolone phenylpropionate 可供分析主要结构特征可供分析主要结构特征：A环的环的 4-3-酮酮结构结构第6页/共47页（三）雌激素（三）雌激素雌二醇雌二醇及其及其C17-羧酸酯类羧酸酯类：戊

4、酸雌二醇、苯甲酸雌二戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇醇 C17-乙炔基衍生物乙炔基衍生物：炔雌醇、炔雌醚、尼尔雌醇炔雌醇、炔雌醚、尼尔雌醇 （VII）雌二醇雌二醇 estradiol （VIII）炔雌醇炔雌醇ethinylestradiol可供分析结构特征可供分析结构特征（1）A环环苯环苯环，具有，具有C3-酚羟基酚羟基；（2）D环的环的C17上具有上具有-乙炔基乙炔基。第7页/共47页（四）孕激素（四）孕激素（黄体激素）（黄体激素）黄体酮黄体酮及其及其衍生物衍生物如：己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮如：己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮 （IX）黄体酮黄体酮 p

5、rogesterone可供分析结构特征：可供分析结构特征：（1）A环具有环具有 4-3-酮酮结构结构 （2）D环的环的C17上有上有甲酮基甲酮基（ketone）侧链（）侧链（）第8页/共47页（五）其它（五）其它中国药典收载的口服避孕药：中国药典收载的口服避孕药：炔诺酮炔诺酮及及衍生物衍生物如：如：炔孕酮炔孕酮、炔诺孕酮炔诺孕酮、左炔诺孕酮左炔诺孕酮 （X）炔诺酮炔诺酮 norethisterone结构特征：在结构上具有上述各类性激素的结构特征：在结构上具有上述各类性激素的特征特征 （1）A环具有环具有 4-3-酮酮结构（皮质激素、雄性激素、孕激素类）结构（皮质激素、雄性激素、孕激素类）（2）

6、D环的环的C17上多具有上多具有-炔基炔基（雌激素类）（雌激素类）（3）C10上多上多无无19-角甲基角甲基（雌激素类）（雌激素类）第9页/共47页 炔诺孕酮炔诺孕酮 炔孕酮炔孕酮 （norgestrel）（ethisterone）第10页/共47页第二节第二节 鉴别试验鉴别试验与强酸的呈色反应与强酸的呈色反应官能团的反应官能团的反应测定衍生物熔点测定衍生物熔点酯类的反应酯类的反应紫外分光光度法紫外分光光度法红外分光光度法红外分光光度法薄层色谱法薄层色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法第11页/共47页一、与强酸的呈色反应一、与强酸的呈色反应甾体激素甾体激素 硫酸硫酸（硫酸（硫酸-乙醇）、磷酸、

7、高氯酸、盐酸乙醇）、磷酸、高氯酸、盐酸 呈色呈色反应机理：反应机理：4-3-酮酮 浓硫酸浓硫酸 质子化质子化 正碳离子正碳离子（共轭体系共轭体系）显色显色 表表10-2 某些甾体激素与硫酸的呈色反应某些甾体激素与硫酸的呈色反应（溶液颜色、溶液荧光、加水稀释后现象）（溶液颜色、溶液荧光、加水稀释后现象）特点特点：甾体：甾体母核反应母核反应，操作简便，不同甾体形成溶液颜色或荧光各不相同，可以互相区别。但，操作简便，不同甾体形成溶液颜色或荧光各不相同，可以互相区别。但专属专属性稍差性稍差，反应，反应较灵敏较灵敏。操作中对取样量和试剂用量要求。操作中对取样量和试剂用量要求较为严格较为严格。中国、英、日

8、国家药典采用此方法中国、英、日国家药典采用此方法中国药典鉴别醋酸可的松中国药典鉴别醋酸可的松第12页/共47页二、官能团的反应二、官能团的反应酮基的反应酮基的反应C17-醇酮基的反应醇酮基的反应甲酮基或活泼亚甲基的反应甲酮基或活泼亚甲基的反应酚羟基的反应酚羟基的反应氟元素的反应氟元素的反应乙炔基的反应乙炔基的反应第13页/共47页（一）酮基的反应（一）酮基的反应 4-3-酮、酮、C20-酮基酮基 +羰基试剂羰基试剂 呈色呈色 （异烟肼、硫酸苯肼、（异烟肼、硫酸苯肼、2,4-二硝二硝基苯肼）基苯肼）+HCl 黄体酮黄体酮 异烟肼异烟肼 黄色黄色反应速度反应速度:4-3-酮酮（即刻反应）（即刻反应

9、）1,4-3-酮酮(13min)C20-酮基酮基(更更长时间长时间)第14页/共47页(二二)C17-醇酮基的反应醇酮基的反应皮质激素分子结构中皮质激素分子结构中 C17 位上的位上的 -醇酮基醇酮基 还原性还原性 氧化剂氧化氧化剂氧化 被还原析出被还原析出沉淀沉淀或或显色显色 水合醛水合醛氧化剂氧化剂：碱性碱性酒石酸铜酒石酸铜试液、试液、氨制氨制硝酸银硝酸银试液、试液、碱性碱性四氮唑四氮唑试液试液第15页/共47页1.与碱性酒石酸铜试液反应与碱性酒石酸铜试液反应(斐林试液斐林试液)+2Cu2+4OH-醋酸泼尼松醋酸泼尼松 +Cu2O+2H2O 红色红色 水合醛水合醛 第16页/共47页2.与

10、氨制硝酸银试液反应与氨制硝酸银试液反应(多伦试液多伦试液)+2Ag+2OH-醋酸去氧皮质酮醋酸去氧皮质酮 +2Ag+CH3COOH 黑色黑色第17页/共47页3.与碱性四氮唑试液反应与碱性四氮唑试液反应四氮唑盐四氮唑盐:氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑(TTC);蓝四氮唑蓝四氮唑(BT)结构如下结构如下:还原还原 还原还原 单甲单甲 （红色）（红色）双甲双甲 （蓝色）（蓝色）应用：应用：-醇酮基醇酮基的的鉴别鉴别皮质激素中皮质激素中“其他甾体其他甾体”TLC检出试剂检出试剂含量测定显色含量测定显色试剂试剂 TTC BT第18页/共47页反应原理如下：反应原理如下：+H2O 醋酸泼尼松醋酸泼尼松 T

11、TC +CH3COOH 水合醛水合醛 深红色深红色第19页/共47页（三）甲酮基或活泼亚甲基的反应（三）甲酮基或活泼亚甲基的反应 亚硝基铁氰化钠亚硝基铁氰化钠 间二硝基苯间二硝基苯 芳香醛芳香醛 呈色呈色甲酮基甲酮基的反应的反应亚甲基亚甲基的反应的反应第20页/共47页1.甲酮基的反应甲酮基的反应黄体酮约黄体酮约5mg 至置小试管中至置小试管中 加甲醇加甲醇0.2ml 加亚硝基铁氰化钠加亚硝基铁氰化钠的细粉约的细粉约3mg、碳酸钠及醋酸铵各约、碳酸钠及醋酸铵各约50mg 摇匀摇匀 放置放置1030min 显显蓝紫色蓝紫色 含有含有C17-甲酮基甲酮基的黄体酮的的黄体酮的灵敏灵敏、专属专属的的鉴

12、别方鉴别方法法第21页/共47页甲酮基的反应原理甲酮基的反应原理 +Fe(CN)5(NO)2-+2OH-黄体酮黄体酮 +2H2O 配位阴离子配位阴离子 蓝紫色蓝紫色第22页/共47页2.亚甲基的反应亚甲基的反应硫酸普拉睾酮钠硫酸普拉睾酮钠约约10mg，加乙醇，加乙醇1ml溶解，加溶解，加间二硝基苯间二硝基苯约约10mg使溶解，使溶解，加氢氧化钠试液数滴加氢氧化钠试液数滴 显显紫红色紫红色 +OH-+H2O 共轭结构（共轭结构（紫红色紫红色）第23页/共47页(四四)酚羟基的反应酚羟基的反应雌激素类具有雌激素类具有C3位酚羟基位酚羟基，C4位（芳香环的位（芳香环的 位位）上的氢较为）上的氢较为活

13、泼活泼，能与重氮苯磺酸偶合生成能与重氮苯磺酸偶合生成红色偶氮化合物红色偶氮化合物。+苯甲酸雌二醇苯甲酸雌二醇 红色红色偶氮化合物偶氮化合物第24页/共47页(五五)氟元素的反应氟元素的反应 含含氟氟甾体激素类药物甾体激素类药物 （醋酸氟轻松（醋酸氟轻松 醋酸地塞米松）醋酸地塞米松）氧瓶燃烧氧瓶燃烧 无机氟化物无机氟化物 茜素氟蓝茜素氟蓝 硝酸亚铈硝酸亚铈 蓝紫色蓝紫色第25页/共47页(六六)乙炔基的反应乙炔基的反应 +AgNO3 +HNO3 白色乙炔盐沉淀白色乙炔盐沉淀第26页/共47页三、测定衍生物熔点三、测定衍生物熔点 甾体激素类药物甾体激素类药物 甾体激素酯类甾体激素酯类 试剂试剂 反

14、应反应 醇制醇制碱液碱液 水解水解 酯、肟、缩氨基脲酯、肟、缩氨基脲 游离甾体游离甾体 测熔点测熔点 第27页/共47页（一）酮肟的生成（一）酮肟的生成 +HONH2 +H2O （盐酸（盐酸羟胺羟胺醋酸钠试液）醋酸钠试液）炔诺孕酮炔诺孕酮 沉淀沉淀 滤过滤过 水洗水洗 重结晶重结晶 测熔点约为测熔点约为195C，熔融同时分解第28页/共47页（二）缩氨基脲的生成（二）缩氨基脲的生成 +H2NCONHNH2 （盐酸氨基脲盐酸氨基脲试液试液）苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙 +H2O 熔点熔点约为约为180C 第29页/共47页四、酯类的反应四、酯类的反应 甾体激素多以甾体激素多以羧酸酯类羧酸酯类用药用药 水

15、解水解 乙醇制氢氧化碱乙醇制氢氧化碱 游离羧酸游离羧酸 乙醇、硫酸（乙醇、硫酸（12）共热）共热 羧酸乙酯羧酸乙酯 蒸除乙醇与硫酸共热蒸除乙醇与硫酸共热 香气香气 产生产生羧酸特臭羧酸特臭第30页/共47页五、紫外分光光度法五、紫外分光光度法 多数甾体激素类药物多数甾体激素类药物 共轭体系共轭体系 紫外吸收紫外吸收 （规定规定 max、A、Amax/Amin）第31页/共47页六、红外分光光度法六、红外分光光度法甾体药物结构复杂甾体药物结构复杂 红外光谱鉴别红外光谱鉴别各国药典收载的甾体激素类药物，各国药典收载的甾体激素类药物，几乎都采用几乎都采用红外光谱作为鉴别方法之一。红外光谱作为鉴别方法

16、之一。中国药典收载甾体激素原料药中国药典收载甾体激素原料药40种，种，37种采用红外光谱作为鉴别。种采用红外光谱作为鉴别。表表10-3 甾体激素某些基团的特征吸收频率甾体激素某些基团的特征吸收频率第32页/共47页七、薄层色谱法七、薄层色谱法薄层色谱法（薄层色谱法（TLC）一些国家用作甾体激素类一些国家用作甾体激素类药物制剂药物制剂的主要的主要鉴别方法鉴别方法之之一。一。中国药典用中国药典用TLC鉴别的药物和制剂有十余个品种。鉴别的药物和制剂有十余个品种。例：醋酸泼尼松片的鉴别例：醋酸泼尼松片的鉴别 薄层板：硅胶薄层板：硅胶G板板 展开剂：二氯甲烷展开剂：二氯甲烷-乙醚乙醚-甲醇甲醇-水水（3

17、85:60:15:2）显色剂：显色剂：碱性四氮唑蓝碱性四氮唑蓝 对照品：醋酸泼尼松对照品：醋酸泼尼松第33页/共47页八、高效液相色谱法八、高效液相色谱法HPLC鉴别法鉴别法：一般采用在含量测定项下记录的：一般采用在含量测定项下记录的HPLC图中图中供试品供试品峰的保留时间应与峰的保留时间应与对照品对照品峰的峰的保留时间保留时间一致一致。特点特点：简便、快速、高分离效能。：简便、快速、高分离效能。中国药典采用中国药典采用HPLC鉴别鉴别醋酸氟轻松软膏醋酸氟轻松软膏等十余个品种。等十余个品种。第34页/共47页第三节第三节 特殊杂质检查特殊杂质检查杂质杂质：原料原料、中间体中间体、异构体异构体、

18、降解产物降解产物、试剂试剂、溶剂溶剂。检查项目检查项目：特殊杂质特殊杂质（有关物质）（有关物质）“其他甾体其他甾体”（主要主要）其它检查项目其它检查项目 地塞米松磷酸钠、氢化可的松磷酸钠地塞米松磷酸钠、氢化可的松磷酸钠 游离磷游离磷酸酸 地塞米松磷酸钠地塞米松磷酸钠 甲醇甲醇、丙酮丙酮 醋酸氟轻松醋酸氟轻松 氟氟 炔诺孕酮炔诺孕酮 乙炔基乙炔基 醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、泼尼松龙醋酸氟轻松、醋酸地塞米松、泼尼松龙 硒硒第35页/共47页一、游离磷酸一、游离磷酸来源：磷酸酯化时残存的来源：磷酸酯化时残存的过量磷酸过量磷酸检查方法：检查方法：钼蓝比色法钼蓝比色法原理：磷酸原理：磷酸+钼酸铵钼酸铵

19、酸性溶液酸性溶液 磷钼酸铵磷钼酸铵 还原还原 磷铵酸蓝磷铵酸蓝（钼蓝钼蓝）=740nm 有有最大吸最大吸收收 例：中国药典收载的地塞米松钠的检查例：中国药典收载的地塞米松钠的检查 结果：结果：在在740nm处测定吸收度，供试品溶液的吸收度不得处测定吸收度，供试品溶液的吸收度不得 大于对照溶液的吸收度。大于对照溶液的吸收度。第36页/共47页二、甲醇和丙酮二、甲醇和丙酮 地塞米松磷酸钠中地塞米松磷酸钠中甲醇甲醇和和丙酮丙酮的检查的检查来源来源：在生产工艺中使用大量甲醇和丙酮：在生产工艺中使用大量甲醇和丙酮检查检查：气相色谱法气相色谱法规定规定：含丙酮不得过：含丙酮不得过0.5%(g/g)，含，含

20、甲醇甲醇不得不得 过过0.3%(g/g)。为什么药典规定作甲醇与丙酮残留量检查？由于甲醇对人体有害，若用丙酮冲洗数次即可除尽甲醇。故药典规定由于甲醇对人体有害，若用丙酮冲洗数次即可除尽甲醇。故药典规定采用气相色谱法测定时不得出现甲醇峰。采用气相色谱法测定时不得出现甲醇峰。第37页/共47页三、硒三、硒来源来源：生产中使用：生产中使用二氧化硒二氧化硒脱氢工艺脱氢工艺检查原理检查原理：氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法破坏破坏 Se（VI）盐酸羟胺盐酸羟胺 Se（IV）2,3-二氨基萘二氨基萘 pH2 4,5-苯并硒二苯并硒二唑唑 环己烷提取环己烷提取 378nm最大最大吸收吸收测定供试品溶液和对照品溶液在测定

21、供试品溶液和对照品溶液在378nm波长处的吸收度并波长处的吸收度并进行比较，来判断供试品中的硒是否超过了限量。进行比较，来判断供试品中的硒是否超过了限量。第38页/共47页四、其他甾体四、其他甾体 其他甾体其他甾体（有关物质有关物质）甾体激素类药物甾体激素类药物主要杂质主要杂质 限量检查限量检查 甾体激素药物甾体激素药物纯度检查重要项目纯度检查重要项目 检查方法检查方法 TLC、HPLC第39页/共47页（一）薄层色谱法（一）薄层色谱法1.方法方法：主成分自身对照法主成分自身对照法（高低浓度对照法高低浓度对照法）即将供试品制成高、低二种浓度的溶液。即将供试品制成高、低二种浓度的溶液。高浓度溶液

22、作为供试溶液；低浓度作为对照溶高浓度溶液作为供试溶液；低浓度作为对照溶液。液。2.判定法判定法：供试溶液图谱中供试溶液图谱中杂质斑点杂质斑点的的数目数目和和颜色颜色与对照溶与对照溶液图谱的液图谱的主斑点主斑点进行进行比较比较，即通过杂质总数和各单一杂质，即通过杂质总数和各单一杂质的量进行控制。的量进行控制。3.检查示例检查示例：醋酸氟轻松中其他甾体的检查醋酸氟轻松中其他甾体的检查薄层板：硅胶薄层板：硅胶G 结果判断：结果判断：供试品溶液如显杂质斑供试品溶液如显杂质斑点，点，不不展开剂：氯仿展开剂：氯仿-甲醇（甲醇（97:3）得多于得多于2个，个，其颜色与对照其颜色与对照显色剂：显色剂：四氮唑蓝

23、四氮唑蓝 溶液的溶液的主斑点比较，主斑点比较，不得更不得更深。深。第40页/共47页（二）高效液相色谱法（二）高效液相色谱法1.色谱条件色谱条件2.方法方法：主成分自身对照法主成分自身对照法或或面积归一化法面积归一化法3.判定法判定法：供试溶液的色谱图中杂质峰的数目和各单一杂质供试溶液的色谱图中杂质峰的数目和各单一杂质峰面积及其总和，与对照溶液的主峰面积比较或用归一化峰面积及其总和，与对照溶液的主峰面积比较或用归一化法计算相对含量。法计算相对含量。4.检查示例检查示例：甲睾酮甲睾酮中其他甾体的检查法中其他甾体的检查法 结果判断结果判断：供试溶液如显杂质峰，：供试溶液如显杂质峰，不得超过不得超过

24、3个个，各杂质，各杂质峰面积及其总和分别峰面积及其总和分别不得大于不得大于对照溶液主峰面积的对照溶液主峰面积的1/2和和3/4。第41页/共47页第四节第四节 含量测定含量测定依据依据：不同类别不同类别的的特征基团特征基团的性质的性质方法方法：紫外分光光度法紫外分光光度法、比色法比色法、色谱法色谱法 高效液相色谱法高效液相色谱法 紫外分光光度法紫外分光光度法 四氮唑盐比色法四氮唑盐比色法 异烟肼比色法异烟肼比色法 柯柏比色法柯柏比色法第42页/共47页一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法2000年版收载甾体激素类原料药与各种制剂年版收载甾体激素类原料药与各种制剂97种，种，65个品种采用个品种

25、采用HPLC测定含量。测定含量。RP-HPLC ：色谱柱填料（色谱柱填料（ODS）流动相流动相（甲醇甲醇-水水 or 乙腈乙腈-水水）；少数药物使用磷酸盐或）；少数药物使用磷酸盐或醋酸盐缓冲液；流动相中加冰醋酸或三乙胺；个别药物在醋酸盐缓冲液；流动相中加冰醋酸或三乙胺；个别药物在流动相中加入四氢呋喃、异丙醇、乙醚等有机改性剂，以流动相中加入四氢呋喃、异丙醇、乙醚等有机改性剂，以改善峰形、提高分离效能。改善峰形、提高分离效能。检测检测：4-3-酮酮或或苯苯 紫外检测，检测波长紫外检测，检测波长240nm或或280nm附近。附近。示例：黄体酮、地塞米松磷酸钠含量测定（祥见讲义）示例：黄体酮、地塞米

26、松磷酸钠含量测定（祥见讲义）第43页/共47页二、紫外分光光度法二、紫外分光光度法 max=240nm or 280nm附近附近 UV测定测定UV法专属性较差（相对于法专属性较差（相对于HPLC），但），但简便易行简便易行，有，有可靠的准确度可靠的准确度。在中国药典中在中国药典中UV法应用仅次于法应用仅次于HPLC。第44页/共47页三、四氮唑盐比色法三、四氮唑盐比色法反应原理同前反应原理同前四氮唑盐还原产物在可见光区有最大吸收，反应可定量完成，生成的有色甲四氮唑盐还原产物在可见光区有最大吸收，反应可定量完成，生成的有色甲 具具一定稳定性，可用于甾体激素类药物的比色分析。一定稳定性，可用于甾体激素类药物的比色分析。测定方法及反应各种影响因素祥见讲义测定方法及反应各种影响因素祥见讲义第45页/共47页自学内容自学内容四、异烟肼比色法四、异烟肼比色法五、柯柏比色法五、柯柏比色法第46页/共47页感谢您的观看！第47页/共47页