氨基酸的分离鉴定纸层析法精选文档.ppt

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1、氨基酸的分离鉴定纸层析氨基酸的分离鉴定纸层析法法本讲稿第一页，共十三页一、实验目的掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。待测样品的氨基酸成分。本讲稿第二页，共十三页二、实验原理纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用溶质在滤纸上的移动速

2、度用RfRf值表示：值表示：RfRf=原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的原点到溶剂前沿的距离距离 在一定的条件下某种物质的在一定的条件下某种物质的RfRf值是常数。值是常数。RfRf值的值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。析法分离氨基酸。本讲稿第三页，共十三页三、实验器材（1 1）大烧杯（）大烧杯（5000mL5000mL）：）：1 1只只/组组 （2 2）培养皿：）培养皿：1 1只只/组。组。（5 5）层析滤纸

3、（长）层析滤纸（长20cm20cm、宽、宽12cm12cm的的 滤纸）：滤纸）：1 1张张/组。组。（6 6）直尺、铅笔）直尺、铅笔（7 7）电吹风：）电吹风：1 1只只/组。组。（8 8）托盘、双面胶：）托盘、双面胶：1 1套套/组。组。（9 9）手套：）手套：1 1双双/组。组。（1010）塑料薄膜：公用。）塑料薄膜：公用。（1111）量筒：）量筒：50mL50mL，1 1只只/组。组。本讲稿第四页，共十三页四、实验试剂（1 1）扩展剂：）扩展剂：将将4 4体积正丁醇和体积正丁醇和1 1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与体积冰醋酸放入分液漏斗中，与3 3体积水混合，体积水混合，倒入分液漏斗充分振

4、荡，静置后分层，弃去下层水层。再按倒入分液漏斗充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。再按0.1%0.1%浓度的比例加入质量相当的茚三酮。浓度的比例加入质量相当的茚三酮。（2 2）氨基酸溶液：）氨基酸溶液：1 1、0.25%0.25%蛋氨酸标准溶液：精确称取蛋氨酸标准溶液：精确称取0.125g 蛋氨酸，蛋氨酸，溶于溶于50mL 蒸馏中，摇匀、充分溶解。蒸馏中，摇匀、充分溶解。2 2、0.25%0.25%组氨酸标准溶液：精确称取组氨酸标准溶液：精确称取0.125g 蛋氨酸，溶于蛋氨酸，溶于50mL蒸馏水中，摇匀、充分溶解。蒸馏水中，摇匀、充分溶解。3 3、0.25%0.25%待测溶液：精确称取待测溶

5、液：精确称取0.125g 待测样品，待测样品，溶于溶于50mL 蒸馏中，摇匀、充分溶解。蒸馏中，摇匀、充分溶解。本讲稿第五页，共十三页 实验试剂 本讲稿第六页，共十三页五、实验操作检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内于干燥箱内120120烘干。烘干。（1 1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯内，展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯内，用塑料薄膜密封起

6、来，平衡用塑料薄膜密封起来，平衡20min20min。本讲稿第七页，共十三页（2）规划：带上手套，取宽）规划：带上手套，取宽约约12cm、高约、高约20cm的层的层析滤纸一张。在纸的下端析滤纸一张。在纸的下端距边缘距边缘2cm处轻轻用铅笔划处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线一条平行于底边的直线A，在直线上做在直线上做3个记号个记号（），记号之间间隔，记号之间间隔3cm，这，这就是原点的位置。另在距就是原点的位置。另在距左边缘左边缘1cm处画一条平行处画一条平行于左边缘的直线于左边缘的直线B，在，在B线线上以上以A、B两线的交点为原两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单点标明刻度（以厘米为单位），

7、参见左图。位），参见左图。本讲稿第八页，共十三页 （3 3）点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在中）点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在中间间3 3个记号（个记号（）上，风干后再点一次。每点在纸上）上，风干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过扩散的直径，最大不超过3 mm3 mm。每人须点。每人须点3 3个样，其个样，其中中2 2个是已知样，个是已知样，1 1个是待测样品。个是待测样品。本讲稿第九页，共十三页 （4 4）层析：用双面胶将滤纸粘成筒状，点）层析：用双面胶将滤纸粘成筒状，点样面向外，纸的两侧边缘不能接触且要保样面向外，纸的两侧边缘不能接触且要保持平行，参见图持平行，参见图3

8、-33-3。向培养皿中加入扩展。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到剂，使其液面高度达到1cm1cm左右，将点好样左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在下，扩展剂的液面在A A线下约线下约1cm1cm），罩上），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当展开剂上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当展开剂上升到升到8 810cm10cm，取出滤纸，剪断双面胶连线，取出滤纸，剪断双面胶连线，立即用电吹风热风吹干。立即用电吹风热风吹干。本讲稿第十页，共十三页（5 5）显色：用喷雾器）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均在通风厨中向滤纸上均匀喷上匀喷上0

9、.1%0.1%茚三酮正丁茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热醇溶液，然后立即用热风吹干，即可显出各层风吹干，即可显出各层析斑点，参见左图。析斑点，参见左图。本讲稿第十一页，共十三页（6 6）计算各种氨基酸的）计算各种氨基酸的RfRf值，并判断混合样品值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表实验报告上，见表3-23-2。（7 7）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到标画图，求出扩展剂上升到18cm18cm时所需要的时间。时所需要的时间。（8 8）将微量注射

10、器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用）将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。收，实验报告当场交给老师。计算：计算：RfRf=原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离/原点到原点到 溶剂前沿的距离溶剂前沿的距离 本讲稿第十二页，共十三页纸层析结果蛋氨酸蛋氨酸 组氨酸组氨酸 待测氨基酸待测氨基酸 原点到层析斑点中原点到层析斑点中心的距离心的距离 原点到溶剂前沿的原点到溶剂前沿的距离距离 RfRf 判断待测氨基酸判断待测氨基酸 本讲稿第十三页，共十三页