基因工程的理论基础与基本技术精选PPT.ppt
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1、基因工程的理论基础与基本技术第1页,此课件共48页哦第二章第二章 基因工程的理论基础与基本技术基因工程的理论基础与基本技术第2页,此课件共48页哦第一节第一节 基因工程的理论基础基因工程的理论基础第3页,此课件共48页哦(一)原核生物的基因结构特点1.操纵子结构 操纵子(Operon),由几个功能相关的结构基因成簇排列而组成的一个基因表达的协同单位(coordinatedunite),称为操纵子。一基因结构特点调节基因调节基因启动子启动子操纵基因操纵基因结构基因结构基因第4页,此课件共48页哦大肠杆菌乳糖操纵子 第5页,此课件共48页哦色氨酸操纵子 第6页,此课件共48页哦第7页,此课件共48
2、页哦2.原核细胞mRNA的特征(1)半衰期短(2)多顺反子形式(3)存在SD序列 原核生物中起始密码子AUG上游712个核苷酸序列因其与16SrRNA3末端反向互补而被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。(4)起始密码子常为AUG(有时GUG,甚至UUG)。第8页,此课件共48页哦3.原核细胞基因的终止子 根据对细菌和噬菌体DNA模板上的终止信号的分析,发现它们具有共同的结构特征:终止点上游存在一个富含GC碱基的二重对称区,由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构;在终止点前面有一段由48个A组成的序列,因此转录产物的3端为寡聚U。UUUUUUUUUUUURNA第9页,此课件共48
3、页哦(二)真核生物基因的结构特点1.真核生物基因的不连续性 断裂基因(interruptedgene)第10页,此课件共48页哦内含子内含子 是一个基因中非编码DNA片段,它分开相邻的外显子。外显子外显子 是一个基因中编码蛋白序列。严格地说,外显子是指保留在初级mRNA中不被剪切掉的区域,包括5非翻译区(5UTR)、编码序列和3非翻译区(3 UTR)。外显子外显子-内含子连接区内含子连接区 是指外显子和内含子的交界,又称边界序列。GT-AGGT-AG法则法则序列分析表明,几乎每个内含子5端起始的两个碱基都是GT,3端最后两个碱基总是AG,由于这两个碱基的高度保守性和存在的广泛性,有人把它称为G
4、T-AG法则,即:5 GT AG 3。第11页,此课件共48页哦第12页,此课件共48页哦卫星卫星DNA DNA 真核生物基因组中高度重复的DNA,有一些202030bp30bp的极短序列,且以数千个拷贝的串连方式排列,这种序列称为卫星DNA。2.卫星DNA在染色体DNA片段的氯化铯密度梯度离心中,由于浮力密度的不同,这种重复序列在主带DNA附近出现的卫星带,因此称之为卫星DNA。第13页,此课件共48页哦3.真核生物mRNA的特征(1)5端的帽子结构 几乎全部的真核mRNA端都具“帽子”结构。虽然真核生物的mRNA的转录以嘌呤核苷酸三磷酸(pppAG或pppG)领头,但在5端的一个核苷酸总是
5、7-甲基鸟核苷三磷酸(m7GpppAGpNp)。mRNA5端的这种结构称为帽子帽子(cap)。不同真核生物的mRNA具有不同的帽子。第14页,此课件共48页哦(1)有助于有助于mRNA越过核膜,进入胞质;越过核膜,进入胞质;(2)保护保护5不被核酶降解;不被核酶降解;(3)翻译时供翻译时供IF(起始因子)和核糖体识别,(起始因子)和核糖体识别,是翻译所必需的。是翻译所必需的。第15页,此课件共48页哦(2)3末端Poly(A)尾巴除了组蛋白以外,真核生物mRNA3末端都有由40200个A组成的Poly(A)尾巴。Poly(A)尾不是由DNA编码的,而是转录后的前体mRNA以ATP为前体,由RN
6、A末端腺苷酸转移酶,即Ploy(A)聚合酶催化聚合到3末端。第16页,此课件共48页哦Poly(A)尾巴在基因工程操作中的作用:A、用Poly(T)作为合成cDNA第一链的引物。B、用Poly(T)纯化柱从总RNA中分离mRNA寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。是是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式;由细胞核进入细胞质所必需的形式;它大大提高了它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。在细胞质中的稳定性。mRNA刚从细胞核进入细胞质时,其多聚刚从细胞核进入细胞质时,其多聚(A)尾巴一般比较长,随着尾巴一般比较长,随着mRNA在细胞质内逗留时间延长
7、,多聚在细胞质内逗留时间延长,多聚(A)逐渐变短消失,逐渐变短消失,mRNA进进入降解过程。入降解过程。它可促进核糖体的有效循环。它可促进核糖体的有效循环。Poly(A)尾巴有三个方面的功能:第17页,此课件共48页哦寡聚(寡聚(dTdT)-纤维素柱层析法纤维素柱层析法常规方法常规方法RNA(RNA(高盐缓冲液高盐缓冲液)寡聚(寡聚(dTdT)纤维素柱)纤维素柱低盐溶液和蒸馏水洗脱较高纯度的较高纯度的mRNAmRNA加样结合结合第18页,此课件共48页哦DynabeadsOligo(dT)25是一种直径为2.8m的均一的、超顺磁的微球体,其表面的5连接键共价结合了由25个脱氧核糖核苷组成的长链
8、。mRNA磁珠分离法第19页,此课件共48页哦二从DNA到蛋白质(一)中心法则1970年特明特明(H.M.Temin)以在劳斯肉瘤病毒内发现逆转录酶这一成就进一步发展和完善了“中心法则”。第20页,此课件共48页哦(二)基因表达(二)基因表达从DNA到蛋白质的过程称为基因表达。DNARNA转录翻译蛋白质第21页,此课件共48页哦原核生物和真核生物比较1.启动子第22页,此课件共48页哦2.RNA聚合酶原核生物真核生物RNA聚合酶仅一种RNA聚合酶有三种RNARNA聚合酶聚合酶大部分大部分rRNArRNARNARNA聚合酶聚合酶mRNAmRNA和和snRNAsnRNARNARNA聚合酶聚合酶tR
9、NAtRNA和和5sRNA5sRNA全酶的组成是2 第23页,此课件共48页哦3.表达过程原核生物真核生物无细胞核,转录和翻译几乎同时进行,基因表达的调控主要发生在转录水平。有细胞核,转录在细胞核中,翻译在细胞质中,并且转录和翻译后都有加工过程,基因表达的调控可以发生在各种不同水平。第24页,此课件共48页哦4.表达的调控(1)真核生物的表达调控信号转导转录因子信号分子受体分子离子通道第二信使分子蛋白激酶或磷酸酯酶活性转录因子基因表达第25页,此课件共48页哦(2)原核生物的表达调控代谢物对基因活性的调节 第26页,此课件共48页哦可诱导调节可诱导调节是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的是指一
10、些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下,由原来关闭的状态转变为工作状态,即在某作用下,由原来关闭的状态转变为工作状态,即在某些物质的诱导下使基因活化。些物质的诱导下使基因活化。可阻遏调节中的基因平时都是开启的,处在产生蛋中的基因平时都是开启的,处在产生蛋白质和酶的工作过程中,但由于一些特殊代谢物或白质和酶的工作过程中,但由于一些特殊代谢物或化合物的积累将其关闭,阻遏了基因的表达,所以化合物的积累将其关闭,阻遏了基因的表达,所以称为可阻遏基因。称为可阻遏基因。第27页,此课件共48页哦弱化因子对基因活性的影响 第28页,此课件共48页哦降解物对基因活性的调节 添加葡萄糖添加葡萄糖能量得到满足能量得
11、到满足细菌的腺苷酸环化酶抑制环腺苷酸环腺苷酸(cMAP)(cMAP)cAMP受体蛋白调控的基因就不表达第29页,此课件共48页哦细菌的应急反应 氨基酸饥饿 空载tRNA 鸟苷四磷酸(ppGpp)鸟苷五磷酸(pppGpp)关闭一些基因的表达开启氨基酸合成基因的表达生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止 第30页,此课件共48页哦环腺苷酸受体蛋白对转录的调控葡萄糖缺乏葡萄糖缺乏cAMPcAMP合成合成cAMP受体蛋白促进促进RNARNA聚合酶聚合酶结合一些基因结合一些基因的启动子的启动子抑制RNA聚合酶结合一些基因的启动子第31页,此课件共48页哦总结基因工程操作中
12、应注意的真核生物与原核生物的差异1.基因结构的差异2.启动子和RNA聚合酶的差异3.蛋白质的翻译后修饰加工(前体切割、二硫键、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、软脂化)4.4.基因表达的调节(表达量)基因表达的调节(表达量)5.载体的差异6.6.蛋白质的纯化方便蛋白质的纯化方便第32页,此课件共48页哦1遗传密码与信息流储存在DNA上的遗传信息通过上的遗传信息通过mRNAmRNA传递给蛋白质,mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的。mRNAmRNA上每上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸,这3个核苷酸就称为密码子,个核苷酸就称为密码子
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