转基因动物ZHY学习.pptx

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1、动物细胞工程制药一、培养动物细胞以获得多肽和蛋白质类药物二、采用遗传操作技术定向改造动物和动物细胞的遗传性状，利用转基因动物或转基因动物细胞生产疫苗、多肽和蛋白质。涉及到的技术：动物细胞培养、细胞融合、细胞大规模培养、动物细胞反应器、核移植、染色体改造和转移技术、转基因动物技术等第1页/共112页 第一节第一节 生产用动物细胞生产用动物细胞动物细胞分类动物细胞分类1、贴壁依赖性细胞概念：anchoraged-dependent cell需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长的细胞大多数动物细胞都属于此类。第2页/共112页 2、非贴壁依赖性细胞概念：anchoraged-indepen

2、dent cell不依赖于固体支持物表面生长的细胞，可在培养液中悬浮生长，被称为悬浮细胞。举例：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞，Namalwa细胞。第3页/共112页 3、兼性贴壁细胞概念：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。理想的药物生产细胞系第4页/共112页接触抑制概念：contact inhibition细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加。有：大多数细胞无：少数悬浮培养细胞（癌细胞）第5页/共112页

3、HelaNIH/3T3第6页/共112页动物细胞的特点动物细胞的特点无细胞壁无细胞壁倍增时间长，生长缓慢倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成聚集体形成原代细胞培养原代细胞培养5050代即开始退化代即开始退化第7页/共112页动物细胞培养动物细胞培养动物细胞或组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养动物细胞或组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。第8页

4、/共112页生产用动物细胞生产用动物细胞原代细胞原代细胞二倍体细胞二倍体细胞转化细胞转化细胞基因工程细胞基因工程细胞第9页/共112页1 1、原代细胞、原代细胞直接取自动物组织、器官，经粉碎、消化而获得的细胞悬液直接取自动物组织、器官，经粉碎、消化而获得的细胞悬液常用的原代细胞：鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、血液的淋巴细胞常用的原代细胞：鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、血液的淋巴细胞缺点：需要大量动物组织缺点：需要大量动物组织第10页/共112页动物组织或器官洗涤、粉碎酶解、消化离心、过滤洗涤培养液稀释细胞接种培养从体内取出组织或器官经过粉碎、消化而获得单细胞进行体外接种培养。37消化，胰蛋白酶

5、，胶原酶工作浓度：0.1-0.3 mg/ml原代细胞培养过程第11页/共112页2 2、二倍体细胞、二倍体细胞原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出具有一定特征的细胞株。有正常细胞的特点：化出具有一定特征的细胞株。有正常细胞的特点：其染色体的组型其染色体的组型2n2n具有明显的贴壁吸附和接触抑制特性具有明显的贴壁吸附和接触抑制特性只有有限的增殖能力，传代只有有限的增殖能力，传代5050次次无致瘤性无致瘤性常用的细胞：常用的细胞：WI-38,MRC-5,2BSWI-38,MRC-5,2BS第12页/共1

6、12页W1-38W1-38W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。：正常胚肺组织人二倍体细胞系。核型为核型为2n=462n=46。成纤维细胞，。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用能产生胶原，培养基用BME BME（EagleEagle Basal Basal mediummedium）。）。10%10%小牛血清，小牛血清，pH7.2,pH7.2,同工酶为同工酶为G6PD BG6PD B型。型。倍增时间为倍增时间为24h24h，有限寿命，有限寿命5050代。代。安全，用于制备疫苗。安全，用于制备疫苗。第13页/共112页MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。核型为2n=46。属成纤维

7、细胞。培养基用加小牛血清。同工酶G6PD B型。有限寿命4246代。增殖速度较W1-38 快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。第14页/共112页3 3、转化细胞、转化细胞通过某个转化过程形成通过某个转化过程形成染色体断裂成异倍体染色体断裂成异倍体无正常细胞特点无正常细胞特点具有无限增殖能力具有无限增殖能力常用的细胞：常用的细胞：NamalwaNamalwa、CHOCHO、BHK-21BHK-21、VeroVero第15页/共112页CHO-K1CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。核型：核型：2n=202n=20222

8、2。培养基：培养基：DEMEDEME培养基培养基 0.1mmol/L0.1mmol/L次黄嘌呤，次黄嘌呤，0.1mmol/L0.1mmol/L胸胸苷，苷，10%10%小牛血清，小牛血清，加入脯氨酸。加入脯氨酸。第16页/共112页BHK-21BHK-21:从从5 5只无性别的生长只无性别的生长1 1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞成纤维样细胞,核型为核型为2n=44;2n=44;培养基为培养基为DMEMDMEM加加7%7%胎牛血清。胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，

9、现已用于工程细胞构建。现已用于工程细胞构建。第17页/共112页NamalwaNamalwa：从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取，建成的人的 类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，1214条标记染色体。单条X，无Y。培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生产干扰素。第18页/共112页Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。第19页/共112页4 4、基因工程细胞、基因工程细胞将不同生物的遗传物质将不同生物的遗传物质,在体外进行剪切并与载体在体外进行剪切并与载体重组转

10、入细胞进行扩增，形成新的细胞系。重组转入细胞进行扩增，形成新的细胞系。1 1）常用的构建重组的细胞：）常用的构建重组的细胞：CHOCHO、BHK-21BHK-21、SP2/0SP2/0 Vero Vero2 2）常用的表达载体）常用的表达载体病毒载体病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、：牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒杆状病毒质粒载体质粒载体：SV40SV40、BKVBKV、BPVBPV、EBVEBV第20页/共112页动物细胞培养条件动物细胞培养条件营养条件：水、碳源、氮源、维生素、激素、无机盐培养的条件：培养温度、PH(7.2-7.4)、通氧量、防止污染动物细胞培养基：平衡盐溶液

11、、合成培养基、天然 培养基第21页/共112页动物细胞的大规模培养方法动物细胞的大规模培养方法悬浮培养法微载体培养法多空载体培养法微囊化培养法中空纤维培养法固定化培养第22页/共112页动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器概念:是给动物细胞的生长代谢提供一个优良的环境，从而使其在生长代谢中产生出大量优质的所需产物。第23页/共112页种类种类搅拌式生物反应器气升式生物反应器中空纤维式生物反应器透析袋式或膜式生物反应器固定床或流化床式生物反应器第24页/共112页转基因技术转基因动物第三节 转基因动物将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰

12、的技术，为转基因技术。采用基因工程技术把外源目的基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，又经过各种发育途径把外源目的基因稳定地传给子代，所获得动物为转基因动物。第25页/共112页转基因动物(transgenic animal)以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。特点分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达第26页/共112页转基因技术的基本原理-将体外构建的重组DNA分子(目的基因或基因组片段)通过显微注射、或转染胚胎干细胞等方法注入动物的受

13、精卵或着床前的胚胎细胞,然后将此受精卵或胚胎再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带外源基因的转基因动物。第27页/共112页转基因技术的发展19811981年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎.19821982年年,获得转基因小鼠。转入大鼠的生长激素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，获得转基因小鼠。转入大鼠的生长激素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，因而被称为因而被称为“超级小鼠超级小鼠”以后相继在以后相继在1010年间报道过转基因兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊、大鼠等转基年间报道过转基因兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊、大鼠等转基因动

14、物的成功。因动物的成功。转基因动物技术在转基因动物技术在19911991年第一次国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析、体年第一次国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术，被列为生物学发展史上细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术，被列为生物学发展史上126126年中第年中第1414个转折点。个转折点。第28页/共112页转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达和遗传的一类动物（包括基因敲除的动物）。1982年，华盛顿大学制备的著名“超级小鼠”将大鼠生长激素导入小鼠第29页/共112页转基因动物技术应用的医学和药学领

15、域：转基因动物技术应用的医学和药学领域：（1 1）作为人类疾病的病理模型用于遗传病等疾病的发病机理研究；）作为人类疾病的病理模型用于遗传病等疾病的发病机理研究；（2 2）研究外源基因在整体动物中的表达调控规律；）研究外源基因在整体动物中的表达调控规律；（3 3）作为药理学研究的动物模型用于寻找新的药物作用靶点和新药筛选试）作为药理学研究的动物模型用于寻找新的药物作用靶点和新药筛选试验；验；（4 4）利用转基因大动物如牛、羊、猪等的乳腺等组织作为）利用转基因大动物如牛、羊、猪等的乳腺等组织作为“生物反应生物反应 器器”生产极具药用价值的稀有生物活性蛋白质生产极具药用价值的稀有生物活性蛋白质。第3

16、0页/共112页 转基因动物实例一转基因动物实例一超级奶牛普通奶牛的三倍大（英国）第31页/共112页转基因动物实例二转基因动物实例二东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪 绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆 第32页/共112页转基因动物实例三转基因动物实例三转绿色荧光蛋白的兔第33页/共112页转基因动物实例四转基因动物实例四正在进行转基因山羊的实验乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊上海交通大学医学遗传研究所第34页/共112页一、基本过程及原理供体的基因受体的受精卵第35页/共112页第36页/共112页定位整合、稳定遗传和适度表达第37页/共112页建立转基因动物相关的技术生

17、产转基因动物的关键技术包括生产转基因动物的关键技术包括：外源目的基因的获得和组构外源目的基因的获得和组构将外源目的基因有效地导人生殖细胞或胚胎干细胞，经选择获得转目的基将外源目的基因有效地导人生殖细胞或胚胎干细胞，经选择获得转目的基因的细胞因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物，使转基因胚胎发育选择合适的体外培养系统和宿主动物，使转基因胚胎发育鉴定、筛选所得到的转基因动物品系鉴定、筛选所得到的转基因动物品系第38页/共112页以基因工程过程来分以基因工程过程来分:上游上游基因改造和载体构建基因改造和载体构建中游中游基因转移、胚胎移植与建系基因转移、胚胎移植与建系下游下游基因的整合、表达检测与

18、细胞筛选基因的整合、表达检测与细胞筛选第39页/共112页1 1、上游、上游-基因改造和载体构建基因改造和载体构建外源基因外源基因:完整的转录单位完整的转录单位,由顺式作用元件由顺式作用元件(cis element)(cis element)或称调控或称调控元件元件(regulatory element)(regulatory element)、结构基因（、结构基因（structural gene)structural gene)和转录终和转录终止信号组成止信号组成 报告基因报告基因 (reporter gene)(reporter gene)或报告序列（或报告序列（reporter sequ

19、ence):reporter sequence):在表在表达载体中引入易于检测的提示重组体存在的基因。达载体中引入易于检测的提示重组体存在的基因。融合基因融合基因 (fusion gene):(fusion gene):将不同来源的结构基因、非编码序列、报告将不同来源的结构基因、非编码序列、报告基因和表达调控序列重组成杂合单元基因和表达调控序列重组成杂合单元第40页/共112页2 2、中游中游基因转移、胚胎移植与建系基因转移、胚胎移植与建系基因导入技术：物理、化学和生物学方法基因导入技术：物理、化学和生物学方法1)1)显微注射法显微注射法 （microinjection)microinject

20、ion)2)2)胚胎干细胞法（胚胎干细胞法（embryonic stem cells,ESembryonic stem cells,ES细胞）细胞）3)3)逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法4)4)精子载体法精子载体法第41页/共112页1）DNA显微注射精前核卵原核DNA注射针持卵管第42页/共112页 显显微微注注射射法法是是2020多多年年来来构构建建转转基基因因动动物物的的最最主主要要方方法法，以以制制备备转转基基因因小小鼠鼠为为例例，其其操操作作程程序序如如下下：首首先先，向向供供体体母母鼠鼠注注射射孕孕马马血血清清，4848小小时时后后再再注注射射人人绒绒毛毛膜膜促促性性腺腺激激素素

21、，使使其其超超排排卵卵（排排卵卵数数可可达达2525枚枚）。然然后后，将将雌雌鼠鼠与与雄雄鼠鼠交交配配获获取取受受精精卵卵，随随后后将将构构建建的的外外源源基基因因在在体体外外用用显显微微注注射射器器注注射射到到受受精精卵卵的的原原核核中中。显显微微注注射射完完成成后后，将将受受精精卵卵移移植植到到假假孕孕母母鼠鼠输输卵卵管管内，大约内，大约3 3周后，代孕母鼠产下转基因鼠。周后，代孕母鼠产下转基因鼠。第43页/共112页克隆DNA供体母鼠酶解、分离、纯化、定量注射激素（HCG）与雄鼠交配目的基因DNA片段鼠受精卵显微注射注射DNA的受精卵输卵管移卵假孕母鼠表型分析胎鼠组织或幼鼠尾巴取出鼠胚胎

22、或待娩幼鼠制备DNA传代转基因鼠外源基因的整合检测确定转基因鼠 显微注射法建立转基因鼠的一级实验程序第44页/共112页鼠的要求第45页/共112页DNA显微注射第46页/共112页第47页/共112页显微注射法的优缺点：优点：a、转移率较高、整合效率达20%；b、外源基因长度可达数百Kb；c、可得纯系动物；d、周期相对较短。第48页/共112页缺点：a、设备昂贵、操作复杂；技术要求高b、随机整合、首尾相连的多拷贝；c、转基因效率较低，约0.5%-3%;d、常造成插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，出现动物严重生理缺陷。e、对卵子伤害大，胚胎存活率低第49页/共112页动物转基因的效

23、率动物转基因的效率以小鼠转基因为例：1.1.注射外源基因后受精卵的存活率为8686 2.2.将受精卵移殖到母鼠子宫内后受精卵的存 活率为2525 3.母鼠的怀孕率为8080 4.4.转基因在基因组上的整合率为2424 5.5.因此小鼠转基因的总有效率约为4 4第50页/共112页提高整合效率的手段：a a、注射位置：核内注射、多为雄前核内注射；、注射位置：核内注射、多为雄前核内注射；b b、DNADNA浓度：浓度：1-2ng/ul1-2ng/ul，DNADNA拷贝数拷贝数200-600200-600分子分子/ul/ul；c c、缓冲液选择：、缓冲液选择：MgClMgCl2 2 1mmol/L

24、EDTA0.1-0.3mmol/L 1mmol/L EDTA0.1-0.3mmol/L第51页/共112页注意事项显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体系胞后，在染色体上的整合位置是随机的外源基因甲基化程度在胚胎发育过程中会影响其活性某些外源基因的表达程度可受到个体细胞正常调节机制的控制由于受到宿主组织分化的影响，外源基因还具有一定的组织特异性第52页/共112页2 2）胚胎干细胞法）胚胎干细胞法胚胎干细胞（胚胎干细胞（Embryonic Stem CellEmbryonic Stem Cell，ESES）是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多潜能细胞系，）是从早期胚胎的内细胞团经体外培养

25、建立起来的多潜能细胞系，具有胚胎细胞相似的形态特征和分化特征。具有胚胎细胞相似的形态特征和分化特征。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆形式保存可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆形式保存第53页/共112页第54页/共112页制备过程制备过程a a 动物的准备动物的准备b b 胚胎的分离与初培养胚胎的分离与初培养c ESc ES细胞的扩增细胞的扩增第55页/共112页胚泡培养皿中培养分离内层细胞团胰蛋白酶解离加饲养层细胞培养胚胎干细胞第56页/共112页 ES是从囊胚开始发育的为二倍体细胞，ES法是在基因组相应位点进行同源重组或置换，而将外源DNA定向整合到内源基因组中表达。将转染的

26、胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。一般程序如下：第57页/共112页胚胎干细胞法转基因动物DNA磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法胚胎干细胞筛选微注射囊胚原肠胚转基因动物第58页/共112页通过胚胎干细胞获得转基因小鼠示意图第59页/共112页第60页/共112页第61页/共112页胚胎干细胞法必需先获得嵌合体后代才能得到转基因动物，历经至少两代，胚胎干细胞法必需先获得嵌合体后代才能得到转基因动物，历经至少两代，杂交选育工作繁重，这对大动物如羊、牛等尤其不便，而且后代过度纯合杂交选育工作繁

27、重，这对大动物如羊、牛等尤其不便，而且后代过度纯合可能导致胚胎早期死亡、畸形或者后代不育等。可能导致胚胎早期死亡、畸形或者后代不育等。如果结合核移植技术，将携带有外源基因的如果结合核移植技术，将携带有外源基因的ESES细胞的细胞核移植到去核的细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中，就能直接获得转基因动物，既节约了时间还能避开近交不育等卵细胞中，就能直接获得转基因动物，既节约了时间还能避开近交不育等纯种劣势纯种劣势。第62页/共112页胚胎干细胞法的特点胚胎干细胞法的特点*一般带有定点整合元件一般带有定点整合元件,避免了随机整合避免了随机整合*体外培养体外培养,正正-负选择负选择,相对较简单相对较简单

28、*需经过多代才能得到纯合的转基因动物，成本高需经过多代才能得到纯合的转基因动物，成本高*目前只在小鼠身上获得成功目前只在小鼠身上获得成功第63页/共112页3）逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法19741974年年JaenischJaenisch等用逆转录病毒作为转基因载体，将等用逆转录病毒作为转基因载体，将SVSV4040DNA DNA 注入小鼠囊胚腔中，发现获得的小鼠体内注入小鼠囊胚腔中，发现获得的小鼠体内SVSV4040DNADNA整合整合逆转录病毒侵染法是最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以逆转录病毒侵染法是最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以RN

29、ARNA分子的形式，在逆分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠转基因小鼠第64页/共112页 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的),),获得转基因动物的方法。获得转基因动

30、物的方法。目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作。目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作。第65页/共112页逆转录病毒载体外源基因四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚逆转录病毒感染嵌合小鼠纯合转基因小鼠第66页/共112页1）原理及过程反转录病毒单链RNA编码RNA反转录酶双链DNA整合至宿主DNA上前病毒（子代病毒RNA模板）克隆至适当载体反转录病毒载体目的基因包装细胞-载体包装细胞包装蛋白RNA感染早期胚胎第67页/共112页逆转录病毒感染法的特点单位点单拷贝整合单位点单拷贝整合插入位点分析较容易插入位点分析较容易对家禽类的转基因研究有重要意义对家禽类的转基因研究有重要意义反转录病毒载体容量有限，只能转移小

31、片段反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(DNA(10kb)10kb)转入的基因易缺少其邻近的调控序列转入的基因易缺少其邻近的调控序列有可能大量复制病毒和存在病毒污染有可能大量复制病毒和存在病毒污染第68页/共112页优点：优点：受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高第69页/共112页缺点：容纳大小有限 潜在致癌性,载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性第70页/共112页4）精子载体法精子载体法 Lavitrano Lavitrano 等于等于19891989年首次报道使用

32、小鼠附睾精子携带外源年首次报道使用小鼠附睾精子携带外源DNADNA受精，生产出表达外源基因的转基因小鼠受精，生产出表达外源基因的转基因小鼠 该方法是将外源基因与精子共同培养，再通过电穿孔或脂质体介导等方该方法是将外源基因与精子共同培养，再通过电穿孔或脂质体介导等方法将外源基因导入成熟的精子，使精子携带外源法将外源基因导入成熟的精子，使精子携带外源DNADNA进入卵中并受精，从进入卵中并受精，从而使外源而使外源DNA DNA 整合到染色体中。整合到染色体中。第71页/共112页精子载体法DNA精子受精卵卵细胞共育法脂质体转染法电穿孔法转基因动物第72页/共112页精子载体法特点精子载体法特点k简

33、便、实用简便、实用k外源外源DNADNA以附加体存在以附加体存在,不再受宿主不再受宿主DNADNA的影响的影响k理论上有较好前景理论上有较好前景k小鼠和鱼小鼠和鱼k具体机制不清楚具体机制不清楚,尚待进一步改进尚待进一步改进第73页/共112页5 5）体细胞核移植法 该技术是以动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等）为受体，将目的基因导入能传代培养该技术是以动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等）为受体，将目的基因导入能传代培养的动物体细胞，再以这些动物体细胞为核供体，进行动物克隆，进而得到带有外源基因的转基因动物。的动物体细胞，再以这些动物体细胞为核供体，进行动物克隆，进而

34、得到带有外源基因的转基因动物。第74页/共112页SchniekeSchnieke等用阳离子脂质体介导外源基因转染到培养的绵羊胎儿成纤维细等用阳离子脂质体介导外源基因转染到培养的绵羊胎儿成纤维细胞中，然后将细胞融入去核卵母细胞中，经激活后在体外培养至囊胚移入胞中，然后将细胞融入去核卵母细胞中，经激活后在体外培养至囊胚移入同步受体母羊中，最后获得同步受体母羊中，最后获得6 6只转基因绵羊只转基因绵羊该方法产生个体的外源基因整合率为该方法产生个体的外源基因整合率为100100，但是核移植技术难度较大，但是核移植技术难度较大，成功率较低，且胎儿成活率不高成功率较低，且胎儿成活率不高第75页/共112

35、页显微注射法与体细胞克隆法生产转基因羊的比较参数显微注射（1989-1996）体细胞克隆卵母细胞供体羊98268中间受体羊14终末受体羊198522用羊总数2877104妊娠羊数（占终末）912（48%）9（41%）活羊羔数12866转基因活羊羔数565转基因羊比例4.53%100%生产一头转基因羊需要羊数51.420.8第76页/共112页克隆羊“多莉”第77页/共112页第78页/共112页优点：优点：无需母兽承载非转基因的胚胎，可减少受体动物的数量无需母兽承载非转基因的胚胎，可减少受体动物的数量事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛选，简化了许多生产环节事先在细胞中进行基因转移和对阳

36、性细胞进行筛选，简化了许多生产环节第79页/共112页DNA精子受精卵DNA卵细胞微注射DNA胚胎干细胞DNA逆转录病毒感染磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法四细胞胚胎囊胚原肠胚转基因动物微注射常用转基因方法及其与受精卵不同发育阶段关系第80页/共112页几种不同转基因方法比较 原核注射 反转录病毒感染 精子携带 体细胞核转移基因准备 易 难 易 中等转基因大小 中等 小 无限制 无限制定点整合 有可能 不可能 不可能 有可能技术要求 高 低 低 高胚胎存活 中等 高 中等 低胎儿存活 中等 高 中等 低转基因胎儿比例 1-10%100%20%100%外源基因拷贝数 高 低 低 可

37、选择多位点整合 低 中等到高 中等 低第81页/共112页3、下游基因的整合、表达检测与细胞筛选1 1）随机整合）随机整合 核内注射整合位点多变，影响表达水平和组织特异性表达核内注射整合位点多变，影响表达水平和组织特异性表达第82页/共112页2 2）同源重组）同源重组双链双链DNADNA的两个区段的的两个区段的DNADNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源区。同源的双链序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源区。同源的双链DNADNA可以通过相互交可以通过相互交换进行重组。换进行重组。外源外源DNADNA如有同源区，也可通过类似的同源重组过程整合到生物的染色体基因组上如有同源区，也可通

38、过类似的同源重组过程整合到生物的染色体基因组上第83页/共112页同源重组方式同源重组方式基因打靶基因打靶gene targeting通过通过DNADNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物体内研究定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物体内研究此基因的功能此基因的功能基因敲除基因敲除 (gene knockout):(gene knockout):将某个基因定向去除将某个基因定向去除基因敲入基因敲入 (gene knockin):(gene knockin):定向将一段基因序列替代另一段基因序列定向将一段基因序列替代另一段基因序列第84页/共112页基因打靶的必备

39、条件基因打靶的必备条件胚胎干细胞胚胎干细胞(ES(ES细胞细胞)能在体外培养，保留发育的全能性能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体打靶载体NeoNeo（新霉素）阳性筛选标志（新霉素）阳性筛选标志HSV-tkHSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)(thymidine kinase)-两个同源两个同源DNADNA片段（片段（HB1,HB2HB1,HB2），它们与），它们与ESES细胞中某一非必需基因两端同源，细胞中某一非必需

40、基因两端同源，保证转基因及标记基因保证转基因及标记基因neorneor通过同源交换定向整合在通过同源交换定向整合在ESES的这一非必需基因内部。的这一非必需基因内部。-转基因（转基因（TGTG），必须能赋予受体），必须能赋予受体ESES细胞新的功能。细胞新的功能。第85页/共112页基因敲除的基本程序基因敲除的基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种第86页/共112页打靶载体的构建同源基因片段质粒载体neor基因HSV-tk基因 HB1HB2第87页/共112页同源重组整合,neo基因置换ES细胞基因组的目的基因t

41、k1 HB1 neor HB2 tk2非特异整合正负选择法:neor:新霉素抗性基因,G418tk:单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶,自杀基因,GCV特异整合tk1 HB1 neor HB2 tk2第88页/共112页PCR鉴定tk1 HB1 neor HB2 tk2P1P2PCR无条带非特异整合P1PCR特异条带P2CS HB1 neor HB2特异整合第89页/共112页2.2.打靶载体导入打靶载体导入ESES细胞细胞w磷酸钙磷酸钙-DNA-DNA共沉淀法共沉淀法w逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法w电穿孔法电穿孔法w脂质体包埋法脂质体包埋法w显微注射法显微注射法第90页/共112页3.基因敲除ES

42、细胞注射入胚泡4.胚泡植入假孕小鼠的子宫中5.嵌合体的杂交育种第91页/共112页第92页/共112页二、转基因动物在医药学方面的应用1医学研究的疾病动物模型 人类许多疾病的发生发展多涉及到基因的异常改变，如，遗传性疾病、肿瘤等。因此，从基因入手，将疾病相关基因导入动物染色体基因组中/或敲除基因而形成的转基因动物可以很好的研究基因的调控变化与疾病发生发展的内在关系。目前，转基因动物越来越多的应用到医学研究中。第93页/共112页表表1 1 已建立的部分人类疾病的转基因动物模型已建立的部分人类疾病的转基因动物模型_疾病模型 基因转移方法 转导的基因_老年性痴呆症 显微注射 淀粉样蛋白基因型糖尿病

43、 显微注射 胰岛淀粉样多肽基因地中海贫血症 显微注射 人珠蛋白基因镰刀形细胞贫血症 显微注射 人和珠蛋白基因唐氏综合症 显微注射 Cu/Zn-SOD酶基因卡氏肉瘤 反转录病毒转染 HIV tat基因成骨不全症 显微注射 突变的1胶原蛋白前体基因自毁容貌症 ES细胞同源重组 突变HGPRT基因_第94页/共112页2 2转基因动物在新药研究中应用转基因动物在新药研究中应用 以往在药物研究中所采用的动物模型大多是通过化学损伤等方法形成的。如，四氧化以往在药物研究中所采用的动物模型大多是通过化学损伤等方法形成的。如，四氧化碳造成的肝损伤等，这些动物模型从病因学上讲与疾病发生是完全不相符的，因此，应碳

44、造成的肝损伤等，这些动物模型从病因学上讲与疾病发生是完全不相符的，因此，应用这样的动物模型筛选药物的成功性很低。而转基因动物是人们有目的的将疾病的相关用这样的动物模型筛选药物的成功性很低。而转基因动物是人们有目的的将疾病的相关基因导入动物染色体基因组中形成的动物模型，其模拟了疾病的病症，所以在药物筛选基因导入动物染色体基因组中形成的动物模型，其模拟了疾病的病症，所以在药物筛选和药物作用机制的研究方面有着独特的作用。目前，转基因动物在新药研究中已得到广和药物作用机制的研究方面有着独特的作用。目前，转基因动物在新药研究中已得到广泛的应用。泛的应用。第95页/共112页3 3转基因动物制药转基因动物

45、制药 转基因动物制药是当前转基因动物研究的最受人们关注的热点。国外许多研究机构和制药公司都在投入大量的人力和物力进行研究开发。第96页/共112页 基因工程制药发展的三个阶段a、原核细胞表达阶段；b、真核细胞表达系统；c、转基因动物表达系统。第97页/共112页原核表达优点：操作简单、效率高、成本低。缺点；（1）由于原核与真核系统的差异，某些真核生物的 蛋白不能表达或表达量低；（2）细菌内大量表达的蛋白容易形成包涵体而难以 提纯；（3）不能正确修饰：糖基化、羧基化等而影响蛋白 的活性；（4）细菌表达的蛋白作为药物使用时可产生过敏反 应。第98页/共112页真核细胞表达高等动物细胞等真核表达系统

46、也已广泛用于制药行业，其优点在于很大程度上克服了细菌的原核表达系统的一些缺点。但真核细胞表达系统也有其不足之处如：对培养条件的要求苛刻，需要高容量、高效的动物细胞发酵罐，扩大培养困难，成本太高，且易污染。第99页/共112页第100页/共112页转基因动物生物反应器转基因动物生物反应器重组蛋白的表达系统重组蛋白的表达系统禽卵哺乳动物血液哺乳动物尿液哺乳动物精液哺乳动物乳汁转基因动物的获得转基因动物的获得受精卵配子（精子或卵母细胞）ES细胞体细胞第101页/共112页生物反应器生物反应器禽卵禽卵特点：特点：一种新型的白来杭鸡年产蛋可达330只，每只蛋约含6.5g蛋白，其中属于卵清部分的就有3.5

47、g。卵黄蛋白进入卵黄需要特定的内部识别序列，所以对卵清蛋白基因修饰更容易些。蛋清的产量高、蛋白含量丰富且产物分泌到动物体外，且家禽在传代时间和实验成本上拥有优势。第102页/共112页难点：难点：缺少有效的转基因途径，因而进展缓慢。缺少有效的转基因途径，因而进展缓慢。最新报道：最新报道：HarveyHarvey等于等于Nature TechnologyNature Technology上宣布，利用复制缺陷型的禽白血病上宣布，利用复制缺陷型的禽白血病病毒病毒(ALV)(ALV)，将，将-内酰胺酶基因导入来杭鸡体内，获得嵌合体公鸡。经过几代的近交、内酰胺酶基因导入来杭鸡体内，获得嵌合体公鸡。经过几

48、代的近交、选育，最终得到蛋中能含有选育，最终得到蛋中能含有-内酰胺酶的纯合母鸡。蛋清中内酰胺酶的纯合母鸡。蛋清中-内酰胺酶含量在内酰胺酶含量在0.250.25到到1.65g/ml1.65g/ml之间之间第103页/共112页生物反应器生物反应器血液血液特点特点许多蛋白在血浆中很不稳定，甚至有些蛋白对动物的健康不利。血液也许只适合生产人血红蛋白、抗体或非活性状态的融合蛋白。目前研究显示：网织红细胞也许能成为非分泌型重组蛋白的“工厂”。第104页/共112页几例较成功的报道：几例较成功的报道：作者作者受体动物受体动物 表达环境表达环境目标蛋白目标蛋白MassoudMassoud等等家兔家兔 血浆血

49、浆1-1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶 LoLo等等 猪猪血浆血浆重组抗体重组抗体 LimontaLimonta等等家兔家兔 血浆血浆重组抗体重组抗体 TomizukaTomizuka等等 小鼠小鼠血浆血浆人源抗体人源抗体 SharmaSharma等等猪网织红细胞猪网织红细胞人血红蛋白人血红蛋白 第105页/共112页生物反应器生物反应器尿液尿液特点特点收集产物蛋白比较容易，不必对动物造成伤害。收集产物蛋白比较容易，不必对动物造成伤害。从动物一出生就可收集产物，不论动物的性别和是否正处于生殖期。从动物一出生就可收集产物，不论动物的性别和是否正处于生殖期。尿液中杂蛋白及脂类含量极低，重组蛋白的分离纯化就

50、简单的多。尿液中杂蛋白及脂类含量极低，重组蛋白的分离纯化就简单的多。第106页/共112页生物反应器生物反应器乳腺乳腺特点产量高、成本低、周期短，效率高；产量高、成本低、周期短，效率高；英国英国PPLPPL公司转基因羊生产公司转基因羊生产1-1-抗胰蛋白酶，一升羊奶中含蛋白抗胰蛋白酶，一升羊奶中含蛋白3030克，价值克，价值40004000英镑，成本英镑，成本0.050.05美元美元/每克蛋白，而细胞培养法每克蛋白，而细胞培养法5-500mg/L5-500mg/L，4-104-10美元美元/每克蛋白。荷兰每克蛋白。荷兰PHPPHP公司三头转基因公司三头转基因牛生产的牛生产的EPOEPO可供全球