重组DNA技术与基因工程6.pptx

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1、酵母的分类学特征酵母的分类学特征 酵 母 菌（酵 母 菌（YeastYeast）是 一 群 以是 一 群 以芽 殖芽 殖或或裂 殖裂 殖方 式 进 行方 式 进 行无 性 繁 殖无 性 繁 殖的 单 细的 单 细胞胞真 核 生 物真 核 生 物，分 属 于，分 属 于子 囊 菌 纲子 囊 菌 纲（子 囊 酵 母 菌）、（子 囊 酵 母 菌）、担 子 菌 纲担 子 菌 纲（担 子 酵 母（担 子 酵 母菌）、菌）、半 知 菌 类半 知 菌 类（半 知 酵 母 菌半 知 酵 母 菌），共 由），共 由5 65 6个 属 和个 属 和5 0 05 0 0多 个 种 组 成。如多 个 种 组 成。如果

2、 说 大 肠 杆 菌 是 外 源 基 因 最 成 熟 的 原 核 生 物 表 达 系 统，则 酵 母 菌 是 最果 说 大 肠 杆 菌 是 外 源 基 因 最 成 熟 的 原 核 生 物 表 达 系 统，则 酵 母 菌 是 最成熟的真核生物表达系统。成熟的真核生物表达系统。A 酵母作为表达外源基因受体的特征6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达第1页/共63页酵母表达外源基因的优势酵母表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传操作简便全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法

3、比拟的真核蛋白翻译后加工系统具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDAFDA认定为安全的认定为安全的基因工程受体系统（基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRASGenerally Recognized As Safe GRAS）酵母是最简单的真核模式生物酵母是最简单的真核模式生物A 酵母作为表达外源基因受体的特征第2页/共63页酵母的受体系统酵母的受体系统B B目前已广泛用于外源

4、基因表达和研究的酵母包括：目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母包括：酵母属酵母属 如如酿酒酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）克鲁维酵母属克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactisKluyveromyces lactis）毕赤酵母属毕赤酵母属 如如巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastorisPichia pastoris）裂殖酵母属裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombeSchizosacchar

5、omyces pombe）汉逊酵母属汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（如多态汉逊酵母（Hansenula polymorphaHansenula polymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。表达外源基因最理想。6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达第3页/共63页提高重组蛋白表达产率的突变型受体提高重组蛋白表达产率的突变型受体抑制超糖基化作用的突变型受体抑制超糖基化作用的突变型受体衰减泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体衰减泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体酵母的受体

6、系统酵母的受体系统B B6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达第4页/共63页提高重组蛋白表达产率的突变型受体提高重组蛋白表达产率的突变型受体能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型：能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型：sscssc11sscssc22rgrrgr11oseose11sscssc1111 rhorho-突变类型突变类型生物效应生物效应作用位点作用位点改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的钙离子依赖型的ATPATP酶酶提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达转录后加工转录后加工转录水平转录水平提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达转录水平转录

7、水平提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌羧肽酶羧肽酶YY转录水平转录水平提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达第5页/共63页抑制超糖基化作用的突变型受体抑制超糖基化作用的突变型受体能抑制超糖基化的突变类型能抑制超糖基化的突变类型mnnmnnalgalgochoch突变类型突变类型生物效应生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心糖基核心和和外侧糖链外侧糖链两部分两部分组成。组成。酵母菌普遍拥有蛋白酵母菌普

8、遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。基化缺陷株非常重要。甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型第6页/共63页衰减泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体衰减泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体蛋白酶体LysLysHOOCUbiquitin 76 aaUbiquitin 76 aa ubiq

9、uitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLysubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLys靶蛋白靶蛋白靶蛋白第7页/共63页第8页/共63页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母共有四个泛素编码基因：酵母共有四个泛素编码基因：UBI UBI 1 1 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 2 2 编

10、码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 3 3 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白7676（CEP76CEP76）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 4 4 编码泛素五聚体编码泛素五聚体 对数生长期关闭对数生长期关闭 稳定期表达稳定期表达酵母共有七个泛素连接酶基因：酵母共有七个泛素连接酶基因：UBC UBC 11、UBC UBC 22、UBC UBC 33、UBC UBC 44、UBC UBC 55、UBC UBC 66、UBC UBC 77第9页/共63页减

11、少泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI UBI 44基因表达，基因表达，UBI UBI 44-突变株能突变株能UBI UBI 44缺陷型：缺陷型：正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此因此UBI UBI 44缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。UBA UBA 11缺陷型：缺陷型：UBAUBA11编码泛素激活酶编码泛素激活酶E1E1，UBAUB

12、A11突变株是致死性的，但其等位突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。Ubc4 Ubc4-ubc5 ubc5 双突变型：双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。第10页/共63页酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建酵母中的野生型质粒酵母中的野生型质粒酵母的载体系统酵母的载体系统C C6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达第11页/共63页酵母中的野生型质粒酵母中的野生型质粒酿酒酵母中的酿酒酵母中的2 2m

13、 m环状质粒环状质粒同源重组同源重组REP1REP1RAFRAFSTBSTBorioriREP2REP2FLPFLPIRIRIRIRAABB几乎所有的酿酒酵母中都含有几乎所有的酿酒酵母中都含有22mm双链双链环状质粒，拷贝数达环状质粒，拷贝数达5050至至100100个。个。IRs IRs 反向重复序列，反向重复序列，600 600 bpbp，重组重组FLPFLP 编码产物驱动编码产物驱动IRsIRs的同源重组的同源重组REPREP 编码产物控制质粒的稳定性编码产物控制质粒的稳定性STBSTB REPREP的结合位点的结合位点接合酵母属中的接合酵母属中的pSR1pSR1和和pSB1pSB1，以

14、及以及克鲁维酵母属中的克鲁维酵母属中的pKD1pKD1等均与等均与22mm质质粒类似。粒类似。第12页/共63页乳酸克鲁维酵母中的线乳酸克鲁维酵母中的线状质粒状质粒乳 酸 克 鲁 维 酵 母 中 含 有 两 种 不 同乳 酸 克 鲁 维 酵 母 中 含 有 两 种 不 同pGKL1 8.9 kbpGKL1 8.9 kbDNADNA聚合酶聚合酶 毒素蛋白毒素蛋白 免疫蛋白免疫蛋白 g g 亚基亚基的 双 链 线 状 质 粒的 双 链 线 状 质 粒p G K L 1p G K L 1和和p G K L 1p G K L 1拷 贝 数 为拷 贝 数 为5 0-1 0 05 0-1 0 0个，分 别

15、 携 带个，分 别 携 带K 1K 1K 2K 2两 种 能 使 多 种 酵 母 菌 致 死 的 毒两 种 能 使 多 种 酵 母 菌 致 死 的 毒反向重复序列反向重复序列素蛋白编码基因（素蛋白编码基因（g g），），同时同时酵母中的野生型质粒酵母中的野生型质粒含有毒素蛋白抗性基因。含有毒素蛋白抗性基因。第13页/共63页酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建含有含有ARSARS的的YRpYRp质粒的构建质粒的构建 A R SA R S为 酵 母 菌 中 的 自 主 复 制 序 列，为 酵 母 菌 中 的 自 主 复 制 序 列，0.8-1.50.8-1.5k bk b，染 色 体 上

16、 每染 色 体 上 每3 0-4 03 0-4 0k bk b就 有 一 个就 有 一 个A R SA R S元 件。酵 母 菌 自 主 复 制 型 质 粒 的 构 建 组 成 包 括 复 制 子、标元 件。酵 母 菌 自 主 复 制 型 质 粒 的 构 建 组 成 包 括 复 制 子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNADNA。以以ARSARS为复制子的质粒称为为复制子的质粒称为YRpYRp 上 述 两 类 质 粒 在 酿 酒 酵 母 中 的 拷 贝 数 最 高 可 达上 述 两 类 质 粒 在 酿 酒 酵 母 中 的 拷 贝 数 最 高 可 达2 0

17、 02 0 0个，但 培 养 几 代个，但 培 养 几 代 以以22mm质粒上的复制元件为复制子的质粒称为质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEpYEp后，质粒的丢失率高达后，质粒的丢失率高达50%-70%50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。，主要是由于分配不均匀所致。第14页/共63页含有含有CENCEN的的YCpYCp质粒的构建质粒的构建 CENCEN为酵母菌染色体为酵母菌染色体DNADNA上与染色体均匀分配有关的序列上与染色体均匀分配有关的序列 将将CEN CEN DNADNA插入含插入含ARSARS的质粒中，获得的新载体称为的质粒中，获得的新载体称为YCpYCp YCp YCp质

18、粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-51-5个个酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建第15页/共63页YACYAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建：酵母人造染色体的构建：pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRP1TRP1ARS1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的酵母系统的选择标记选择标记大肠杆菌的

19、复制子大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的大肠杆菌的选择标记选择标记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为350-400 350-400 kbkb含有含有TELTEL的的YACYAC质粒的构建质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建第16页/共63页酵母人造染色体的使用：酵母人造染色体的使用：pYAC4pYAC4CENCENEcoRIEcoRIURAURATELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRPTRPARSARSEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHI连接连接转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体含有含

20、有TELTEL的的YACYAC质粒的构建质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建第17页/共63页含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体DNADNA同源序列的同源序列的YIpYIp质粒的构建质粒的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体染色体DNADNA特定序列和标记基因，特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为构建出来的质粒称为YipYip。目的基因目的基因表达盒通常插在染色体表达盒通常插在染色体DNADNA特定序特定序列中，这样目的基因就能借助同源列中，这样目的基因就能借助同源重 组 高 效 整 合 入 酵 母 菌 特 定 的重 组 高 效 整 合 入 酵 母

21、 菌 特 定 的染色体染色体DNADNA区域。区域。酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建第18页/共63页酵母的转化程序酵母的转化程序转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运用于酵母转化子筛选的标记基因用于酵母转化子筛选的标记基因酵母的转化系统酵母的转化系统D D6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达第19页/共63页酵母的转化程序酵母的转化程序酵母菌原生质体转化法酵母菌原生质体转化法 早 期 酵 母 菌 的 转 化 都 采 用 在 等 渗 缓 冲 液 中 稳 定 的 原 生 质 体 转 化 法早 期 酵 母 菌 的 转 化 都 采 用 在 等 渗 缓 冲 液

22、 中 稳 定 的 原 生 质 体 转 化 法在在C aC a2+2+和和P E GP E G的 存 在 下，转 化 细 胞 可 达 原 生 质 体 总 数 的的 存 在 下，转 化 细 胞 可 达 原 生 质 体 总 数 的1-2%1-2%。但 该 程。但 该 程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。原 生 质 体 转 化 法 的 一 个 显 著 特 点 是，一 个 受 体 细 胞 可 同 时 接 纳 多原 生 质 体 转 化 法 的 一 个 显 著 特 点 是，一 个 受 体 细 胞 可 同 时 接 纳 多个质粒分子，而且

23、这种个质粒分子，而且这种共转化共转化的原生质体占转化子总数的的原生质体占转化子总数的25-33%25-33%。第20页/共63页碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿 酒 酵 母 的 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子（如酿 酒 酵 母 的 完 整 细 胞 经 碱 金 属 离 子（如L iL i+等）、等）、P E GP E G、热 休 克 处热 休 克 处理后，也可高效吸收质粒理后，也可高效吸收质粒DNADNA，而且具有下列特性：而且具有下列特性：吸收线型吸收线型DNADNA的能力明显的能力明显大于环状大于环状DNADNA，两者相差两者相差8080倍

24、倍共转化现象极为罕见共转化现象极为罕见酵母的转化程序酵母的转化程序第21页/共63页酵母电击转化法酵母电击转化法 酵 母 菌 原 生 质 体 和 完 整 细 胞 均 可 在 电 击 条 件 下 吸 收 质 粒酵 母 菌 原 生 质 体 和 完 整 细 胞 均 可 在 电 击 条 件 下 吸 收 质 粒D N AD N A，但但在 此 过 程 中 应 避 免 使 用在 此 过 程 中 应 避 免 使 用P E GP E G，它 对 受 电 击 的 细 胞 具 有 较 很 大 的 负 作 用它 对 受 电 击 的 细 胞 具 有 较 很 大 的 负 作 用电 击 转 化 的 优 点 是 不 依 赖

25、 于 受 体 细 胞 的 遗 传 特 征 及 培 养 条 件 适 用 范 围电 击 转 化 的 优 点 是 不 依 赖 于 受 体 细 胞 的 遗 传 特 征 及 培 养 条 件 适 用 范 围广，而且转化率可高达广，而且转化率可高达101055/mmg DNAg DNA。酵母的转化程序酵母的转化程序第22页/共63页转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运单双链单双链DNADNA均可转化酵母菌，但均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的单链的转化率是双链的10-3010-30倍倍；含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制；含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化

26、为双链并复制；不 含 复 制 子 的 单 链 质 粒 进 入 细 胞 后，能 高 效 地不 含 复 制 子 的 单 链 质 粒 进 入 细 胞 后，能 高 效 地同 源 整 合同 源 整 合入 染 色 体入 染 色 体这对于体内定点突变酵母基因组极为有利；这对于体内定点突变酵母基因组极为有利；克 隆 在克 隆 在Y I pY I p整 合 型 质 粒 上 的 外 源 基 因，如 果 含 有 受 体 细 胞 的 染 色 体整 合 型 质 粒 上 的 外 源 基 因，如 果 含 有 受 体 细 胞 的 染 色 体D N AD N A的 同 源 序 列，会 发 生 高 频 同 源 整 合，整 合 子

27、 占 转 化 子 总 数 的的 同 源 序 列，会 发 生 高 频 同 源 整 合，整 合 子 占 转 化 子 总 数 的50-80%50-80%。第23页/共63页用于酵母转化子筛选的标记基因用于酵母转化子筛选的标记基因营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因 用 于 酵 母 转 化 子 筛 选 的 标 记 基 因 主 要 有用 于 酵 母 转 化 子 筛 选 的 标 记 基 因 主 要 有营 养 缺 陷 型 互 补 基 因营 养 缺 陷 型 互 补 基 因和和显性基因显性基因两大类：两大类：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合

28、成基因，如：LEULEU、TRPTRP、HISHIS、LYSLYS、URAURA、ADEADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。第24页/共63页 显性标记基因的编码产物大都是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因的编码产物大都是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因显性标记基因 aph aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418G418 cat cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合

29、物 耐受铜离子耐受铜离子 suc2 suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型用于酵母转化子筛选的标记基因用于酵母转化子筛选的标记基因第25页/共63页用于酵母转化子筛选的标记基因用于酵母转化子筛选的标记基因 显性标记基因显性标记基因酿酒酵母的生长为酿酒酵母的生长为氨甲氨甲喋呤喋呤和和对氨基苯磺酰胺对氨基苯磺酰胺的混合物所抑制，前者的混合物所抑制，前者抑制二氢叶酸还原酶的抑制二氢叶酸还原酶的活性，后者则阻止四氢活性，后者则阻止四氢叶酸的生物合成。因此

30、叶酸的生物合成。因此在酵母载体上过量表达在酵母载体上过量表达二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶基因基因（dhfrdhfr），可以有效抵），可以有效抵消由于氨甲喋呤抑制所消由于氨甲喋呤抑制所造成的酵母内源性二氢造成的酵母内源性二氢叶酸还原酶活性的不足。叶酸还原酶活性的不足。第26页/共63页酵母启动子的可控性酵母启动子的可控性外源基因在酵母中表达的限制因素外源基因在酵母中表达的限制因素酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择酵母的表达系统酵母的表达系统E E6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达第27页/共63页酵母启动子的可控性酵母启动子的可控性温度控制型启动子温度控制型启动子pho4ph

31、o4TSTS-PHO5-PHO5启动子：启动子：酿酒酵母酿酒酵母PHO5PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开；启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开；PHO4PHO4基因编码产物是基因编码产物是PHO5PHO5启动子的正调控因子；启动子的正调控因子；因此，装在因此，装在pho4pho4TSTS-PHO5-PHO5启动子下游的外源基因在启动子下游的外源基因在3535时关闭，时关闭，2323诱导诱导表达。表达。PHO4PHO4温度敏感型突变基因温度敏感型突变基因pho4pho4TSTS的编码产物在的编码产物在3535时失活；时失活；第28页/共63页a a 型启动子型启动子hmlhm

32、laa2-102 2-102 MATaMATaa1a1Sir3-8Sir3-8TSTS 型启动子型启动子 受体细胞基因组受体细胞基因组 重组质粒重组质粒a a 型启动子型启动子hmlhmlaa2-102 2-102 MATaMATaa1a1Sir3-8Sir3-8TSTS 型启动子型启动子221125253535aa-型启动子：型启动子：酿酒酵母有酿酒酵母有aa和和两种单倍体两种单倍体，分 别 由，分 别 由MATMATaa和和MATMAT两个等位基因决定。两个等位基因决定。11因子决定因子决定细胞特征表达细胞特征表达22因子阻遏因子阻遏aa细胞细胞特征表达特征表达a1-a2a1-a2阻遏阻遏

33、细胞特征表达细胞特征表达编码编码22因子的基因突变型因子的基因突变型hmlhmlaa2-1022-102能产生能产生22变体，变体，它能灭活它能灭活a1a1，同时阻遏同时阻遏aa型型酵母启动子的可控性酵母启动子的可控性 温度控制型启动子温度控制型启动子第29页/共63页超诱导型启动子超诱导型启动子GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导时，半乳糖诱导时

34、，GAL4GAL4高效表达，高效表达，GAL1GAL1、GAL1GAL1、GAL10GAL10超高效表达超高效表达GAL10GAL10PromoterPromoter酿酒酵母酿酒酵母的半乳糖的半乳糖利用酶系利用酶系由由GAL1 GAL1 GAL7GAL7和和 G A L 1 0G A L 1 0基因编码基因编码酵母启动子的可控性酵母启动子的可控性第30页/共63页外源基因在酵母中表达的限制因素外源基因在酵母中表达的限制因素外源基因稳态外源基因稳态mRNAmRNA的浓度的浓度外源基因外源基因mRNAmRNA的翻译活性的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性酵母菌对密码子的偏爱性在 酿 酒 酵 母 中，高

35、 丰 度 的 蛋 白 质（如 甘 油 醛在 酿 酒 酵 母 中，高 丰 度 的 蛋 白 质（如 甘 油 醛-3-3-磷 酸 脱 氢 酶磷 酸 脱 氢 酶G A P D HG A P D H、磷 酸 甘 油 激 酶磷 酸 甘 油 激 酶P K GP K G、乙 醇 脱 氢 酶乙 醇 脱 氢 酶A D HA D H）中中9 6%9 6%以上的氨基酸是由以上的氨基酸是由2525个密码子编码的。个密码子编码的。第31页/共63页酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛醛-3-3-磷酸脱氢酶基因磷

36、酸脱氢酶基因GAPDHGAPDH、磷酸甘油激酶基因磷酸甘油激酶基因PKGPKG、乙醇脱氢乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酶基因酶基因ADHADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化超糖基化能力，往往使得能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母非酿酒酵母型的表达系统来弥补。型的表达系统来弥补。第32页/共63页 乳 酸 克

37、鲁 维 酵 母 的 双 链 环 状 质 粒乳 酸 克 鲁 维 酵 母 的 双 链 环 状 质 粒p K D 1p K D 1已 被 广 泛 用 作 重 组 异 源已 被 广 泛 用 作 重 组 异 源蛋 白 生 产 的 高 效 表 达 稳 定 性 载 体，即 便 在 无 选 择 压 力 的 条 件 下，也蛋 白 生 产 的 高 效 表 达 稳 定 性 载 体，即 便 在 无 选 择 压 力 的 条 件 下，也乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传能稳定遗传4040代以上。代以上。乳 酸 克 鲁 维 酵 母 表 达 分 泌 型 和 非 分 泌 型 的 重 组 蛋 白，性 能 均

38、优乳 酸 克 鲁 维 酵 母 表 达 分 泌 型 和 非 分 泌 型 的 重 组 蛋 白，性 能 均 优于酿酒酵母表达系统。于酿酒酵母表达系统。酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择第33页/共63页 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 是 一 种巴 斯 德 毕 赤 酵 母 是 一 种甲 基 营 养 菌甲 基 营 养 菌，能 在 低 廉 的 甲 醇 培 养 基 中 生，能 在 低 廉 的 甲 醇 培 养 基 中 生巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母表达系统长，长，甲 醇甲 醇可 高 效 诱 导 甲 醇 代 谢 途 径 中 各 酶 编 码 基 因 的 表 达。因 此可 高 效 诱 导 甲 醇 代 谢 途

39、 径 中 各 酶 编 码 基 因 的 表 达。因 此生 长生 长迅 速迅 速、乙 醇 氧 化 酶 基 因、乙 醇 氧 化 酶 基 因A O XA O X11所 属 强 启 动 子、表 达 的所 属 强 启 动 子、表 达 的可 诱 导 性可 诱 导 性是 巴 斯是 巴 斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。德毕赤酵母表达系统的三大优势。由 于 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 没 有 合 适 的 自 主 复 制 型 载 体，所 以 外 源 基 因由 于 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 没 有 合 适 的 自 主 复 制 型 载 体，所 以 外 源 基 因的 表 达 序 列 一 般 整 合 入 受 体 的 染

40、色 体的 表 达 序 列 一 般 整 合 入 受 体 的 染 色 体D N AD N A上。在 此 情 况 下，外 源 基 因上。在 此 情 况 下，外 源 基 因具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。的 高 效 表 达 在 一 定 程 度 上 取 决 于 整 合 拷 贝 数 的 多 寡。目 前 已 有的 高 效 表 达 在 一 定 程 度 上 取 决 于 整 合 拷 贝 数 的 多 寡。目 前 已 有2 02 0余 种余 种酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择第34页/共63页巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母表

41、达系统酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择第35页/共63页 多 型 汉 逊 酵 母 也 是 一 种多 型 汉 逊 酵 母 也 是 一 种甲 基 营 养 菌甲 基 营 养 菌。其 自 主 复 制 序 列。其 自 主 复 制 序 列H A R SH A R S已 被已 被多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母表达系统克 隆，并 用 于 构 建 克 隆 表 达 载 体，但 与 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 相 似，这 种 载克 隆，并 用 于 构 建 克 隆 表 达 载 体，但 与 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 相 似，这 种 载体 在 受 体 细 胞 有 丝 分 裂 时 显 示 出 不 稳 定 性。所 不

42、 同 的 是，体 在 受 体 细 胞 有 丝 分 裂 时 显 示 出 不 稳 定 性。所 不 同 的 是，H A R SH A R S质 粒质 粒能 高 频 自 发 地 整 合 在 受 体 的 染 色 体能 高 频 自 发 地 整 合 在 受 体 的 染 色 体D N AD N A上，甚 至 可 以 连 续 整 合上，甚 至 可 以 连 续 整 合1 0 01 0 0多多 目 前，包 括 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 在 内 的 数 种 外 源 蛋 白 在 该 系 统 中 获目 前，包 括 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 在 内 的 数 种 外 源 蛋 白 在 该 系 统 中 获个拷贝，因此

43、重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。得成功表达。得成功表达。酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择第36页/共63页 由由乙 型 肝 炎 病 毒乙 型 肝 炎 病 毒（H B VH B V）感 染 引 起 的 急 慢 性 乙 型 肝 炎 是 一 种 严 重感 染 引 起 的 急 慢 性 乙 型 肝 炎 是 一 种 严 重的 传 染 病，每 年 约 有的 传 染 病，每 年 约 有2 0 02 0 0万万病 人 死 亡，并 有病 人 死 亡，并 有33亿亿人 成 为人 成 为H B VH B V携 带 者，其携 带 者，其中 相 当 一

44、部 分 人 可 能 转 化 为 肝 硬 化 或 肝 癌 患 者。目 前 对 乙 型 肝 炎 病 毒中 相 当 一 部 分 人 可 能 转 化 为 肝 硬 化 或 肝 癌 患 者。目 前 对 乙 型 肝 炎 病 毒还 没 有 一 种 有 效 的 治 疗 药 物，因 此 高 纯 度 乙 型 疫 苗 的 生 产 对 预 防 病 毒还 没 有 一 种 有 效 的 治 疗 药 物，因 此 高 纯 度 乙 型 疫 苗 的 生 产 对 预 防 病 毒感 染 具 有 重 大 的 社 会 效 益，而 利 用 重 组 酵 母 大 规 模 生 产 乙 型 疫 苗 为 其感 染 具 有 重 大 的 社 会 效 益，而

45、 利 用 重 组 酵 母 大 规 模 生 产 乙 型 疫 苗 为 其广泛应用提供了可靠的保证。广泛应用提供了可靠的保证。利用重组酵母生产乙肝疫苗利用重组酵母生产乙肝疫苗F F6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达第37页/共63页产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母利用重组酵母生产乙肝疫苗利用重组酵母生产乙肝疫苗F F6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达第38页/共63页乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质 乙 肝 病

46、 毒 是 一 种 蛋 白 包 裹 型 的乙 肝 病 毒 是 一 种 蛋 白 包 裹 型 的双 链双 链D N AD N A病 毒病 毒，具 有 感 染 力 的 病 毒，具 有 感 染 力 的 病 毒乙型肝炎病毒的结构乙型肝炎病毒的结构颗 粒 呈 球 面 状，直 径 为颗 粒 呈 球 面 状，直 径 为4 24 2n mn m，基 因 组 仅 为基 因 组 仅 为3.23.2k bk b。病 毒 颗 粒 的 主 要 结病 毒 颗 粒 的 主 要 结构 蛋 白 是 病 毒 的构 蛋 白 是 病 毒 的表 面 抗 原表 面 抗 原多 肽（多 肽（H B s A gH B s A g）或）或SS多 肽

47、，它 具 有 糖 基 化 和多 肽，它 具 有 糖 基 化 和非 糖 基 化 两 种 形 式。颗 粒 内 的 蛋 白 成 份 包 括非 糖 基 化 两 种 形 式。颗 粒 内 的 蛋 白 成 份 包 括核 心 抗 原核 心 抗 原（H B c A gH B c A g）、）、病病 除 此 之 外，被 乙 肝 病 毒 感 染 的 人 的 肝 脏 还 能 合 成 并 释 放 大 量 的除 此 之 外，被 乙 肝 病 毒 感 染 的 人 的 肝 脏 还 能 合 成 并 释 放 大 量 的2 22 2毒毒DNADNA聚合酶亚基聚合酶亚基、微量病毒蛋白微量病毒蛋白。n mn m的的空 壳 亚 病 毒 颗

48、 粒空 壳 亚 病 毒 颗 粒，其 免 疫 原 性 是 未 装 配 的 各 种 包 装 蛋 白 组 份 的，其 免 疫 原 性 是 未 装 配 的 各 种 包 装 蛋 白 组 份 的10001000倍倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：SS、MM、LL多肽多肽。第39页/共63页乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因ATGATGATGATGATGATGTAATAA108 aa108 aa55 aa55 aa226 aa226 aapreS1preS1preS2preS2SSS S 多肽多肽226 aa226 aaM M 多肽多肽281 aa281

49、 aaL L 多肽多肽399 aa399 aa乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质第40页/共63页 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫传统乙肝疫苗的制备传统乙肝疫苗的制备苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质第41页/共63页产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙

50、肝表面抗原的重组酿酒酵母 20 20世 纪世 纪8 08 0年 代 开 始 选 择 酿 酒 酵 母 表 达 重 组年 代 开 始 选 择 酿 酒 酵 母 表 达 重 组H B s A gH B s A g，主 要 工 作 包 括主 要 工 作 包 括将将SS多 肽 的 编 码 置 于多 肽 的 编 码 置 于A D H 1A D H 1启 动 子启 动 子控 制 下，转 化 子 能 表 达 出 具 有 免 疫 活控 制 下，转 化 子 能 表 达 出 具 有 免 疫 活性 的 重 组 蛋 白，它 在 细 胞 提 取 物 中 以 球 形 脂 蛋 白 颗 粒 的 形 式 存 在，平性 的 重 组