细菌内毒素检查法幻灯片.ppt

《细菌内毒素检查法幻灯片.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细菌内毒素检查法幻灯片.ppt（44页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、细菌内毒素检查法第1页，共44页，编辑于2022年，星期一一、基本概念n细菌内毒素与热原的关系细菌内毒素与热原的关系n热原热原(Progen)(Progen)指临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质。关于热原的定义指临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质。关于热原的定义在学术上还有争论。在学术上还有争论。n细菌内毒素细菌内毒素(Endotxin)(Endotxin)革兰氏阴性细菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活性，其革兰氏阴性细菌细胞壁的构成成分，具有多种生物活性，其化学结构是脂多糖化学结构是脂多糖(LPS)(LPS)。n热原与内毒素的关系在学术上仍有争论，但在热原与内毒素的关系在学术上仍有争

2、论，但在GMPGMP的条件下，在的条件下，在药检的范畴里，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无药检的范畴里，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就控制热原热原，控制内毒素就控制热原。第2页，共44页，编辑于2022年，星期一一、基本概念n细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中的细菌内毒素的限量是以判断供试品中的细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。否符合规定的一种方法。n细菌内毒素检查包括两种方式，即凝胶细菌内毒素检查包括两种方式，即凝胶法和光度测定

3、法，后者包括浊度法和显法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。第3页，共44页，编辑于2022年，星期一一、基本概念n细菌内毒素的量用内毒素单位细菌内毒素的量用内毒素单位(EU(EU或或IU)IU)表示。表示。n细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标

4、准品的效价。定细菌内毒素工作标准品的效价。n细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏 度复度复核、干扰试验及各种阳性对照。核、干扰试验及各种阳性对照。第4页，共44页，编辑于2022年，星期一一、基本概念n细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml0.015EU/ml（用于凝胶法）或（用于凝胶法）或0.005EU/ml0.005EU/ml（用于光度测定法）且（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰的灭菌注射用水。对内毒素

5、试验无干扰的灭菌注射用水。n试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在源性内毒素。常用的方法是在250250干烤干烤3030分钟以分钟以上，也可以采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的上，也可以采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。适宜方法。n试验操作过程应防止微生物的污染。试验操作过程应防止微生物的污染。第5页，共44页，编辑于2022年，星期一二、细菌内毒素检查法(凝胶限量法凝胶限量法)n细菌内毒素检查法（凝胶法）实验程序如下：细菌内毒素检查法（凝胶法）实验程序如下：n一、实验准备：试剂、仪器、及用具等一、实验准备：试剂

6、、仪器、及用具等n二、确定药品的细菌内毒素限值（二、确定药品的细菌内毒素限值（L L）n三、计算供试品的最大有效稀释倍数（三、计算供试品的最大有效稀释倍数（MVDMVD）或最低）或最低有效浓度（有效浓度（MVCMVC）n四、鲎试剂灵敏度复核四、鲎试剂灵敏度复核n五、药品与鲎试剂相容性的初筛试验五、药品与鲎试剂相容性的初筛试验n六、供试品干扰试验以及干扰试验的验证六、供试品干扰试验以及干扰试验的验证n七、供试品日常的内毒素限量检查。七、供试品日常的内毒素限量检查。第6页，共44页，编辑于2022年，星期一三、实验准备n1.1.仪器、设备仪器、设备 371371恒温水浴或适宜的恒温器具恒温水浴或适

7、宜的恒温器具n2.2.器具：凡与供试品或试剂直接接触的器具必须经除器具：凡与供试品或试剂直接接触的器具必须经除热原处理（热原处理（250250干烤干烤30min30min以上）以上）;塑料用具须确塑料用具须确证不干扰实验结果证不干扰实验结果.n3.3.试剂试剂 内毒素工作标准品、内毒素工作标准品、鲎试剂、鲎试剂、鲎试验用水、鲎试验用水、PHPH调节剂。调节剂。第7页，共44页，编辑于2022年，星期一四、四、确定药品的细菌内毒素限值（确定药品的细菌内毒素限值（L L）nL=K/M L=K/M nL:L:供试品的内毒素限值供试品的内毒素限值,可从可从药典药典上查询或按以上公式计上查询或按以上公式

8、计算算,以以EU/mlEU/ml、EU/mgEU/mg、EU/UEU/U表示表示nK:K:按照规定的给药途径按照规定的给药途径,人体每公斤体重每小时可接受的最大内人体每公斤体重每小时可接受的最大内毒素剂量毒素剂量,以以EU/(kg.h)EU/(kg.h)表示表示;nM:M:人体每公斤体重每小时最大用药剂量人体每公斤体重每小时最大用药剂量,以以mlml(kg.h)(kg.h)、mgmg(kg.h)(kg.h)或或U U(kg.h)(kg.h)表示，中国人均体重按表示，中国人均体重按6060公斤计算，人体表公斤计算，人体表面积按面积按1.62m1.62m2 2计算。按注射时间若不足计算。按注射时间

9、若不足1 1小时，按小时，按1 1小时计算小时计算。供试品每平方米体表剂量乘以供试品每平方米体表剂量乘以0.0270.027即可转换为每千克体重剂量即可转换为每千克体重剂量（M)M)。第8页，共44页，编辑于2022年，星期一五、鲎试剂灵敏度复核 n1.鲎试剂灵敏度定义：在本检查法规定的条件下，使鲎试鲎试剂灵敏度定义：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用度，用EU/mlEU/ml表示表示。n2.2.目的目的 2.12.1考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒

10、素工作标准品的效价是否准确，2.22.2考察试验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。考察试验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。n3.3.鲎试剂灵敏度复核的条件鲎试剂灵敏度复核的条件 3.13.1使用新批号的鲎试剂，使用新批号的鲎试剂，3.23.2试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时。试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时。第9页，共44页，编辑于2022年，星期一五、鲎试剂灵敏度复核n4.溶液配制溶液配制 注：注：A 为内毒素水溶液系列；为内毒素水溶液系列；B为阴性对照为阴性对照编编号号内毒素浓度内毒素浓度/配配制内毒素的溶制内毒素的溶液液稀释用液稀释用液稀释倍稀释

11、倍数数所含内毒所含内毒素的浓度素的浓度平行平行管数管数A2/检查用水检查用水检查用水检查用水124822110.50.50.250.254444B无检查用水无检查用水-2第10页，共44页，编辑于2022年，星期一五、鲎试剂灵敏度复核n5.反应加样反应加样n6.结果判断：反应管倒转结果判断：反应管倒转180 阳性阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱者：凝胶不变形，不从管壁滑脱者 阴性阴性(-)：无凝胶或凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者：无凝胶或凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者内毒素浓度内毒素浓度(EUml)20.50.25NC0.1ml鲎试剂鲎试剂反应条件反应条件371，60min2min第11页

12、，共44页，编辑于2022年，星期一五、鲎试剂灵敏度复核n试验有效性判断试验有效性判断 NCNC管必须全部为阴性管必须全部为阴性(-)TAL TAL与内毒素水溶液系列：与内毒素水溶液系列：2 2管均为阳性管均为阳性(+)(+)，0.250.25管均为阴性管均为阴性(-)符合以上条件试验有效符合以上条件试验有效第12页，共44页，编辑于2022年，星期一五、鲎试剂灵敏度复核n结果计算结果计算 鲎试剂灵敏度的测定值鲎试剂灵敏度的测定值(c)c)计算：计算：c=antilg(Xc=antilg(X4)4)X X为反应终点浓度的对数值为反应终点浓度的对数值(lg)(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内

13、毒素浓反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。度中最后一个呈阳性结果的浓度。n当当0.50.5c2c2时，以标示灵敏度时，以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。为该批鲎试剂的灵敏度。第13页，共44页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度的选择 n一般为了试验的方便，选择灵敏度一般为了试验的方便，选择灵敏度低的鲎试剂，低的鲎试剂，n若供试品的限值很小，则应选择若供试品的限值很小，则应选择灵敏度高的鲎试剂，方便供试品灵敏度高的鲎试剂，方便供试品溶液的稀释和溶液的稀释和PPCPPC（供试品阳性对（供试品阳性对照）的制备照）的制备。第14页，共44页，编辑于2022年，星期一

14、七、供试品溶液的制备n供试品溶液的最大稀释倍数的计算供试品溶液的最大稀释倍数的计算 MVDMVDCLCL/L:L:供试品的内毒素限值；供试品的内毒素限值；C C：供试品溶液的浓度；：供试品溶液的浓度；当当L L以以 EU/mlEU/ml表示时，表示时，C C为为1ml/ml;1ml/ml;当当L L以以EU/mgEU/mg或或EU/uEU/u表示时，表示时，C C的单位为的单位为mg/mlmg/ml或或u u/ml(ml(注意：当注意：当L L以以EU/mlEU/ml表示时，表示时，C C的值的值不是样品的浓度，就是不是样品的浓度，就是1)1)。第15页，共44页，编辑于2022年，星期一七、

15、供试品溶液的制备n某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。成供试品溶液。n一般要求供试品溶液的一般要求供试品溶液的PH值在值在6.0 8.0的范围内。的范围内。(USP、EP一般要求供试品溶液与鲎试剂的混合液一般要求供试品溶液与鲎试剂的混合液的的PH值在值在6.0 8.0的范围内。）的范围内。）n对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需要调对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需要调节被测溶液节被测溶液(或其稀释液或其稀释液)的的PH值。值。第16页，共44页，编辑于2022年，星期一八、药品与鲎试剂相容性初筛试验n1.1.

16、目的：目的：通过一系列浓度的试验，筛选出对鲎试验无干扰的浓度通过一系列浓度的试验，筛选出对鲎试验无干扰的浓度 n2.2.作用：作用：确定以后对样品作确定以后对样品作BETBET常规检查的两个主要参数：常规检查的两个主要参数：样品的有效稀释范围或有效浓度范围，样品的有效稀释范围或有效浓度范围，可选择的鲎试剂的灵敏度范围。可选择的鲎试剂的灵敏度范围。减少干扰试验的盲目性减少干扰试验的盲目性 节省时间以及成本。节省时间以及成本。第17页，共44页，编辑于2022年，星期一九、供试品的干扰试验n1.1.目的：判断某种检品在某种浓度下是目的：判断某种检品在某种浓度下是否适合作内毒素检查。否适合作内毒素检

17、查。n2.2.原理：比较鲎试剂与内毒素的反应在原理：比较鲎试剂与内毒素的反应在水溶液中进行和在检品中进行的差异水溶液中进行和在检品中进行的差异,也也即是比较反应在不同介质中进行反应的即是比较反应在不同介质中进行反应的差异差异,无差异即无干扰无差异即无干扰,有差异即有干扰。有差异即有干扰。若没有干扰，该浓度可以进行日常检查；若没有干扰，该浓度可以进行日常检查；若有干扰，则必须排除干扰后才能进行若有干扰，则必须排除干扰后才能进行日常检查。日常检查。第18页，共44页，编辑于2022年，星期一九、供试品的干扰试验n3.3.在何种情况下需做干扰试验：在何种情况下需做干扰试验：新品种建立方法新品种建立方

18、法 鲎试剂的来源改变鲎试剂的来源改变 鲎试剂的配方、生产工艺改变鲎试剂的配方、生产工艺改变 供试品的来源改变供试品的来源改变 供试品的配方、生产工艺改变供试品的配方、生产工艺改变 试验环境中发生了其它有可能影响试验试验环境中发生了其它有可能影响试验结果的变化。结果的变化。第19页，共44页，编辑于2022年，星期一九、供试品的干扰试验编编号号内毒素浓度内毒素浓度/配制内毒素配制内毒素的溶液的溶液稀释用液稀释用液稀释倍数稀释倍数所含内毒素所含内毒素的浓度的浓度平行管数平行管数A无无/检查用水检查用水-2B2/检查用水检查用水检查用水检查用水124822110.50.50.250.254444C2

19、/供试品溶液供试品溶液供试品溶液供试品溶液124822110.50.50.250.254444D无无/供试品溶液供试品溶液-2注：注：A为阴性对照；为阴性对照；B为干扰试验系列；为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为供试品溶液为供试品溶液 USP、EP规定为规定为4支平行管支平行管凝胶法干扰试验溶液的制备凝胶法干扰试验溶液的制备第20页，共44页，编辑于2022年，星期一九、供试品的干扰试验n加样反应加样反应NCB溶液溶液(PC系列系列)C溶液溶液(PPC系列系列)供试供试品管品管内毒素浓内毒素浓度度(Euml)-20.50.2520.50.25-平

20、行管平行管 反应条件反应条件371，60min2min第21页，共44页，编辑于2022年，星期一十、干扰试验结果分析 n试验有效性判断试验有效性判断 -NC-NC管必须全部为阴性管必须全部为阴性 -供试品管必须为阴性供试品管必须为阴性 -TAL-TAL与内毒素水溶液系列：与内毒素水溶液系列：22管均为阳性管均为阳性(+)(+)，0.250.25管均为阴性管均为阴性(-)(-)即即0.50.5EEs s22 符合以上条件试验有效。符合以上条件试验有效。第22页，共44页，编辑于2022年，星期一十、干扰试验结果分析n按下式计算系列溶液按下式计算系列溶液C C和溶液和溶液B B的反应终点浓度的的

21、反应终点浓度的几何平均值几何平均值(E(Es s和和E Et t)E Es s=antilg(X=antilg(Xs s4)4)E Et t=antilg(X=antilg(Xt t4)4)Xs Xs和和XtXt分别为系列溶液分别为系列溶液C C和溶液和溶液B B的反应终点浓的反应终点浓度的对数值度的对数值(lg)(lg)。当当0.50.5EEs s22且且0.5E0.5Es sEEt t2E2Es s 时，认为供时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。试品在该浓度下无干扰作用。USPUSP、EPEP规定规定当当0.50.5EEs s22且且0.5E0.5Et t22时，认为供试品在该浓度下无干扰

22、作用。时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。第23页，共44页，编辑于2022年，星期一十、干扰试验结果分析n反应结果反应结果1 1(S(SD D表示供试品溶液表示供试品溶液)nE E0.50.5 E E0.250.25 E E0.1250.125 E E0.06 0.06 NC ENC Es s +-0.25EumlnS SD DE E0.50.5 S SD DE E0.250.25 S SD DE E0.1250.125 S SD DE E0.06 0.06 NPC ENPC Et t +-0.25Euml 0.5 0.5 E Es s 22且且E Es s=E Et t,干扰成立干扰成立第

23、24页，共44页，编辑于2022年，星期一十、干扰试验结果分析n反应结果反应结果2 2：nE E0.5 0.5 E E0.25 0.25 E E0.125 0.125 E E0.06 0.06 NC ENC Es s +-0.125EumlnS SD DE E0.5 0.5 S SD DE E0.25 0.25 S SD DE E0.125 0.125 S SD DE E0.06 0.06 NPC ENPC Et t +-0.25Euml 0.5 0.5 E Es s 22且且E Et t=2E=2Es s,干扰成立干扰成立第25页，共44页，编辑于2022年，星期一十、干扰试验结果分析n反应

24、结果反应结果3 3：nE E0.5 0.5 E E0.25 0.25 E E0.125 0.125 E E0.06 0.06 NC ENC Es s +-0.25EumlnS SD DE E0.5 0.5 S SD DE E0.25 0.25 S SD DE E0.125 0.125 S SD DE E0.06 0.06 NPC ENPC Et t +-0.125Euml 0.50.5 E Es s 22且且 E Et t=0.5E=0.5Es s,干扰成立干扰成立第26页，共44页，编辑于2022年，星期一十、干扰试验结果分析n反应结果反应结果4 4：增强：增强nE E0.5 0.5 E E

25、0.25 0.25 E E0.125 0.125 E E0.06 0.06 NC ENC Es s +-0.25EumlnS SD DE E0.5 0.5 S SD DE E0.25 0.25 S SD DE E0.125 0.125 S SD DE E0.06 0.06 NPC ENPC Et t +-0.104Euml按中国药典判断：试验有效，但按中国药典判断：试验有效，但内毒素供试品溶液系列内毒素供试品溶液系列不符合不符合 0.5E0.5Es sEEt t2E2Es s ，则认为，则认为干扰试验不成立，即干扰试验不成立，即供试品在试验浓度下有干扰作供试品在试验浓度下有干扰作用。用。按按U

26、SPUSP、EPEP判断判断:内毒素供试品溶液系列内毒素供试品溶液系列0.250.25管（管（S SD DE E0.50.5）中有一管呈阳性）中有一管呈阳性,不符合不符合0.5E0.5Et t22的要求的要求,则认为则认为干扰试验不成立干扰试验不成立，即供试品在试验，即供试品在试验浓度下有干扰作用。浓度下有干扰作用。第27页，共44页，编辑于2022年，星期一十、干扰试验结果分析n反应结果反应结果5 5：增强：增强nE E0.5 0.5 E E0.25 0.25 E E0.125 0.125 E E0.06 0.06 NC ENC Es s +-0.125EumlnS SD DE E0.5 0

27、.5 S SD DE E0.25 0.25 S SD DE E0.125 0.125 S SD DE E0.06 0.06 NPC ENPC Et t +-0.104Euml按中国药典判断按中国药典判断:试验有效，符合试验有效，符合 0.5E0.5Es s22且且0.5E0.5Es sEEt t2E2Es s ，则认为干扰试验成立，则认为干扰试验成立,即供试品在试验浓度下即供试品在试验浓度下无干扰作无干扰作用。用。按按USPUSP、EPEP判断判断:内毒素供试品溶液系列内毒素供试品溶液系列0.250.25管（管（S SD DE E0.50.5）中有一管呈阳性）中有一管呈阳性,不符合不符合0.5

28、E0.5Et t22的要求的要求 ，则认为干扰试验不成立，则认为干扰试验不成立,即供试品在试验浓度即供试品在试验浓度下下有干扰作用。有干扰作用。第28页，共44页，编辑于2022年，星期一十、干扰试验结果分析n反应结果反应结果6 6：抑制：抑制nE E0.50.5 E E0.250.25 E E0.1250.125 E E0.06 0.06 NCNC +-nS SD DE E0.50.5 S SD DE E0.250.25 S SD DE E0.1250.125 S SD DE E0.06 0.06 NPC NPC +-内毒素供试品溶液系列内毒素供试品溶液系列22管（管（S SD DE E0.

29、50.5）中有一管）中有一管呈阴性，供试品在该浓度下对凝胶反应有抑制作用。呈阴性，供试品在该浓度下对凝胶反应有抑制作用。第29页，共44页，编辑于2022年，星期一十、干扰试验结果分析n反应结果反应结果7 7：抑制：抑制nE E0.5 0.5 E E0.25 0.25 E E0.125 0.125 E E0.06 0.06 NC ENC Es s +-0.125EumlnS SD DE E0.5 0.5 S SD DE E0.25 0.25 S SD DE E0.125 0.125 S SD DE E0.06 0.06 NPC ENPC Et t +-0.5Eumln按中国药典按中国药典:0.

30、50.5 E Es s 22但但 E Et t 2E2Es s,干扰不成立干扰不成立。认为。认为供试品在试验浓度下对凝胶反应有抑制作用供试品在试验浓度下对凝胶反应有抑制作用.按按USP、EP:0.50.5 E Es s 22且且0.50.5 E Et t 22 干扰成干扰成立。立。认为供试品在试验浓度下对凝胶反应无干扰作用认为供试品在试验浓度下对凝胶反应无干扰作用.第30页，共44页，编辑于2022年，星期一十一、举例：某产品的干扰试验1.1.试剂试剂 试剂名称试剂名称厂家厂家规格规格灵敏度或效价灵敏度或效价数量数量鲎试剂鲎试剂湛江安度斯湛江安度斯0.1ml/0.1ml/支支0.25Eu/ml

31、0.25Eu/ml3636支支工作标准品工作标准品中国药品生物中国药品生物制品检验所制品检验所-150EU/150EU/支支1 1支支BETBET水水湛江安度斯湛江安度斯50ml/50ml/瓶瓶-PHPH调节剂调节剂湛江安度斯湛江安度斯2ml/2ml/支支-1 1支支某产品某产品-100ml:0.4g100ml:0.4g-1 1瓶瓶第31页，共44页，编辑于2022年，星期一十一、举例：某产品的干扰试验2.2.制备某产品供试品溶液制备某产品供试品溶液n某产品内毒素限值某产品内毒素限值L0.6EU/mgL0.6EU/mgn最大有效稀释倍数最大有效稀释倍数MVD=(4mg/ml0.6EU/mg)/

32、0.25EU/ml=9.6MVD=(4mg/ml0.6EU/mg)/0.25EU/ml=9.6n选择稀释倍数为选择稀释倍数为8 8倍倍,则其供试液的浓度为则其供试液的浓度为0.5mg/ml0.5mg/ml。n供试液供试液(S(S8 8)的制备的制备 2.0ml2.0ml供试品供试品+13.4mlBET+13.4mlBET水水+0.6mlOH+0.6mlOH-,PH=7.0,PH=7.0第32页，共44页，编辑于2022年，星期一十一、举例：某产品的干扰试验3.3.内毒素标准品溶液的制备内毒素标准品溶液的制备n细菌内毒素标准品溶液和内毒素供试品溶液的制细菌内毒素标准品溶液和内毒素供试品溶液的制备

33、：分别用鲎试剂和供试品溶液将同一支内毒素备：分别用鲎试剂和供试品溶液将同一支内毒素标准品按以下步骤稀释：标准品按以下步骤稀释：0.2ml 0.2ml 1.0ml0.2ml 0.2ml 1.0ml 150EU/ml 15EU/ml 1.5EU/ml 0.5EU/ml1.81.8mlml1.81.8mlml2.02.0mlml1.01.0mlml1.01.0mlml1.01.0mlml1.01.0mlml0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml1.01.0mlml1.01.0mlml第33页，共44页，编辑于2022年，星期一十一、举例：某产品的干扰试验4.4.反应结果反应结果

34、NCNCB B溶液溶液(PC(PC系列系列)反应反应终点终点浓度浓度C C溶液溶液(PPC(PPC系列系列)反应反应终点终点浓度浓度供试供试品管品管内毒素浓内毒素浓度度(Euml)(Euml)-0.50.50.250.250.120.125 50.060.060.0.5 50.250.250.120.125 50.060.06-平行管平行管-+-0.250.25+-0.250.25-+-0.250.25+-0.250.25-+-0.250.25+-0.50.5+-0.250.25+-0.250.25反应条件反应条件373711，60min60min2min2min第34页，共44页，编辑于20

35、22年，星期一十一、举例：某产品的干扰试验 5.5.结果分析结果分析n试验有效性判断：试验有效性判断：NCNC管必须全部为阴性管必须全部为阴性 NPCNPC管必须全部为阴性管必须全部为阴性 TALTAL与内毒素水溶液系列：与内毒素水溶液系列：22管均为阳性管均为阳性(+)(+)，0.250.25管均为阴性管均为阴性(-)试验结果符合以上条件，试验有效。试验结果符合以上条件，试验有效。第35页，共44页，编辑于2022年，星期一十一、举例：某产品的干扰试验n按下式计算系列溶液按下式计算系列溶液C C和溶液和溶液B B的反应终点浓度的的反应终点浓度的几何平均值几何平均值(Es(Es和和Et)Et)

36、E Es s=antilg(X=antilg(Xs s4)4)=antilg =antilg(lg0.25Eu(lg0.25Euml4)ml4)4 4=0.25Eu=0.25Euml ml E Et t=antilg=antilg (X(Xt t4)4)=antilg =antilg(lg0.25Eu(lg0.25Euml3+lg0.5Euml3+lg0.5Euml)ml)4 4=0.297Eu=0.297Eumlmln0.50.5EEs s22且且0.5E0.5Es sEEt t2E2Es s ，供试品在，供试品在0.5mg0.5mgmlml浓浓度下无干扰作用。度下无干扰作用。第36页，共4

37、4页，编辑于2022年，星期一十二、消除干扰的方法 供试品若经干扰试验证实存在干扰因供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采用适宜的方法来消除干扰。消除素，可采用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要原则是干扰的一个重要原则是不能影响供试品中不能影响供试品中的内毒素生物活性的内毒素生物活性。1.1.供试品稀释法供试品稀释法 MVD=CL/MVD=CL/鲎试剂灵敏度鲎试剂灵敏度()()越高越高(数值越小数值越小)，供试品的稀释倍，供试品的稀释倍数数越大，干扰越小。越大，干扰越小。第37页，共44页，编辑于2022年，星期一十二、消除干扰的方法 2.2.物理方法物理方法 如加热法如加热法(血液制

38、品血液制品)、冷析法、冷析法(甘露醇甘露醇 )3.3.化学方法化学方法 如调节如调节PHPH值值(奎诺酮类奎诺酮类)、调节金属离子、调节金属离子(血液保养液、血液保养液、FDP)FDP)4.4.生物方法生物方法 如抗增液的使用，阻断如抗增液的使用，阻断G G因子反应，防止假阳性；因子反应，防止假阳性；5.5.其它方法其它方法 如过滤法、溶剂抽提等如过滤法、溶剂抽提等 第38页，共44页，编辑于2022年，星期一十三、检品的日常检查十三、检品的日常检查 1.1.经过干扰试验的验证后，则可进行检品的日常内毒经过干扰试验的验证后，则可进行检品的日常内毒素检查，检查法的反应管按以下设置：素检查，检查法

39、的反应管按以下设置：注：注：A A为供试品溶液；为供试品溶液；B B供试品阳性对照供试品阳性对照(PPC)(PPC)；C C为阳性对照为阳性对照(PC)(PC)；D D为阴性对照为阴性对照(NC)(NC)编编号号内毒素浓度配制内毒素的溶内毒素浓度配制内毒素的溶液液平行管平行管数数A无供试品溶液无供试品溶液2B2供试品溶液供试品溶液2C2检查用水检查用水2D无检查用水无检查用水2第39页，共44页，编辑于2022年，星期一十三、检品的日常检查十三、检品的日常检查供试品管供试品管PPCPCNC加样加样0.1mlTAL0.1ml供试品供试品溶液溶液0.1ml 2内毒内毒素素供试品供试品溶液溶液0.1

40、ml 22内内毒素水溶液毒素水溶液0.1ml BET水水平行管数平行管数2222封口封口、混混 合合、反应反应反应条件反应条件3711，60min 2min2.加样反应加样反应第40页，共44页，编辑于2022年，星期一十三、检品的日常检查、检品的日常检查 结果判断结果判断供试品管供试品管NCPCPPC符合符合 规定规定-+不符合不符合 规定规定+-+需复测需复测+-+复测符合规定复测符合规定-+复测不符合规定复测不符合规定+-+试验无效试验无效+试验无效试验无效-试验无效试验无效-3.结果判断结果判断第41页，共44页，编辑于2022年，星期一十四、注意事项n防止鲎试验用水被污染防止鲎试验用

41、水被污染n开开启启内内毒毒素素标标准准品品和和鲎鲎试试剂剂时时，要要将将粘粘附附在在安安瓿瓿壁壁上上的的粉粉末末尽尽可可能能地地弹弹落落下下去去。用用砂砂轮轮划划过过安安瓿瓿后后，要要用用酒酒精精棉棉（最最好好能能用用沾沾异异丙丙醇醇的的无无纺纺布布，以以避避免免产产生生假假阳阳性性结结果果）擦擦拭拭，防防止止开开启启时时玻玻璃璃屑屑落落入入安安瓿瓿内内。开开启启内内毒毒素素标标准准品品时时，要要在在安安瓿瓿曲曲颈颈上上部部，并并尽尽可可能能保保留留较较长长的的安安瓿瓿颈颈，准准确确加加入入1.0ml1.0ml鲎鲎试试验用水复溶。验用水复溶。第42页，共44页，编辑于2022年，星期一十四、注

42、意事项n细菌内毒素要充分混合均匀细菌内毒素要充分混合均匀1.1.内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器混合内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器混合1515分钟，以后的每一步稀释前要至少混合分钟，以后的每一步稀释前要至少混合3030秒，秒，其它国家药典也有类似要求；其它国家药典也有类似要求；2.2.具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布。分布。3.3.不按要求进行旋涡混合器混合会使所稀释的内不按要求进行旋涡混合器混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确的实验结果。不凝等不正确的实

43、验结果。第43页，共44页，编辑于2022年，星期一十四、注意事项n对对灵灵敏敏度度标标示示值值的的误误解解：如如=0.06EU/ml=0.06EU/ml，实实际际上上表表示示的的灵灵敏敏度度=0.0625EU/ml=0.0625EU/ml，这这样样写写是是为为了了简简便便。稀稀释释过过程程中中一一定定要要按按照照=0.0625EU/ml=0.0625EU/ml来来稀稀释释，否否则，会对实验结果有影响。则，会对实验结果有影响。n凡凡含含内内毒毒素素标标准准品品的的溶溶液液在在加加样样前前须须再再漩漩涡涡混混合合至至少少3030秒钟。秒钟。n在在保保温温过过程程中中要要注注意意不不要要振振动动，以以免免因因振振动动造造成成假假阴阴性结果。性结果。第44页，共44页，编辑于2022年，星期一