重组蛋白质表达、复性与纯化.pptx

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1、重组蛋白质的重组蛋白质的表达、复性与纯化表达、复性与纯化为什么要重组基因表达？为什么要重组基因表达？1.蛋白质功能研究蛋白质功能研究2.生物制药和疫苗生产生物制药和疫苗生产3.疾病的基因治疗疾病的基因治疗4.食品、化工用酶制剂食品、化工用酶制剂5.抗虫、抗逆植物改良抗虫、抗逆植物改良6.细胞代谢产物的富集细胞代谢产物的富集基因表达体系及优劣势基因表达体系及优劣势大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系蛋白质的复性蛋白质的复性工作中经常碰到的问题工作中经常碰到的问题基因表达体系基因表达体系1.原核体系原核体系2.真核体系真核体系大肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli)遗遗传传背背景景清清楚楚

2、，基基因因工工程程操操作作方方便便，商商品品化化表表达达载载体体种种类齐全，表达效率高；类齐全，表达效率高；基基本本不不分分泌泌，易易形形成成包包含含体体(无无正正确确折折叠叠的的立立体体结结构构)，无加糖等修饰无加糖等修饰枯草杆菌枯草杆菌 (Bacillus subtilis)分分泌泌蛋蛋白白质质能能力力强强，一一般般有有天天然然立体结构；立体结构；无无加加糖糖修修饰饰功功能能，培培养养液液中中蛋蛋白白酶酶活活性性高高，重重组组蛋蛋白白易易受受蛋蛋白白酶酶的水解；的水解；质质粒粒不不稳稳定定，尚尚无无商商品品化化的的表表达达载体载体其其 他他乳酸菌乳酸菌(Lacticacidbacteria

3、)沙门氏菌沙门氏菌(Salmonella typhimurium)苏云金杆菌苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)真核细胞表达体系真核细胞表达体系酵母细胞酵母细胞昆虫细胞昆虫细胞植物细胞植物细胞/组织组织哺乳动物细胞哺乳动物细胞/组织组织酵母细胞酵母细胞可可生生产产分分泌泌型型蛋蛋白白；有有天天然然立立体体结结构构，有有加加糖糖修修饰饰功功能能；可可进进行行染染色色体体整整合合型型基因表达基因表达;糖糖链链与与哺哺乳乳动动物物加加工工的的不不一一致致，培培养养上上清多糖浓度高清多糖浓度高;商品化表达体系：商品化表达体系：酿酒酵母酿酒酵母（Saccharomyce cerev

4、isiae）;毕氏酵母毕氏酵母(Pichia pastoris);裂殖酵母裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）昆虫细胞昆虫细胞可以病毒感染的型式在成虫中生产，可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被作为药物宿主细胞未被FDA认可认可CHO细胞细胞可进行分泌表达，有天然可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；体蛋白质完全一致；表达量不

5、够高，培养成本表达量不够高，培养成本较高较高植物组织植物组织植物可大面积种植，可以廉植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；价大规模生产；转基因植物制作费时，表达转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化表达量较难提高，分离纯化不方便不方便动物乳腺组织动物乳腺组织分泌生产有天然立体结构和分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，转基因动物制作花费巨大，实验周期长实验周期长鸟类输卵管组织鸟类输卵管组织分泌生产有天

6、然立体结构的分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方易贮存和运输，分离纯化方便；便；实验成本低，饲养费用低；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同加糖方式可能与人有所不同体系选择体系选择研究基因功能研究基因功能:大大肠肠杆杆菌菌,裂裂殖殖酵酵母母,昆昆虫虫细细胞胞,CHO细细胞胞多肽药物生产多肽药物生产:大大肠肠杆杆菌菌,毕毕氏氏酵酵母母,CHO细细胞胞,乳乳腺腺组组织织疫苗疫苗:大肠杆菌大肠杆菌,酵母酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产单抗生产:杂交瘤细胞杂交瘤细胞工业酶生产工业酶生产:各

7、种微生物各种微生物 在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素 在大肠杆菌中生产人凝血在大肠杆菌中生产人凝血在大肠杆菌中生产人凝血在大肠杆菌中生产人凝血IXIX因子因子因子因子 在大肠杆菌生产在大肠杆菌生产在大肠杆菌生产在大肠杆菌生产CalcitoninCalcitonin类类类类C C端酰胺化短肽端酰胺化短肽端酰胺化短肽端酰胺化短肽 在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰 在酵母中进行与哺乳动物细胞一致

8、的糖基化在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 提高乳腺分泌表达的提高乳腺分泌表达的提高乳腺分泌表达的提高乳腺分泌表达的FactorIXFactorIX类因子的活性类因子的活性类因子的活性类因子的活性 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化

9、有可能以后能做到的事有可能以后能做到的事在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达重组蛋白质重组蛋白质如果目的蛋白质有二硫键并需要如果目的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构正确的立体结构,尽可能进行可尽可能进行可溶性表达溶性表达;如果目的蛋白质没有二硫键或只如果目的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清用来制备抗血清,采用包含体表达采用包含体表达比较好比较好;如果目的多肽的分子量小于如果目的多肽的分子量小于10kDa,一定要进行融合表达一定要进行融合表达按蛋白质类型分按蛋白质类型分 单纯表达单纯表达单纯表达单纯表达:pJLA:pJLA系列系列系列系列,用用用用NcoI/NdeINcoI/NdeI导入导入导入

10、导入AUGAUG的载体的载体的载体的载体 融合表达融合表达融合表达融合表达:融合各种融合各种融合各种融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etctag,GST,CBD,MAL,GFP,etc 分泌表达分泌表达分泌表达分泌表达:pel/ompTpel/ompT分泌肽分泌肽分泌肽分泌肽按启动子分按启动子分 laclac及衍生的及衍生的及衍生的及衍生的tac,trc,pac,ractac,trc,pac,rac等启动子等启动子等启动子等启动子IPTGIPTG诱导诱导诱导诱导 lamdaphagePlamdaphagePL L和和和和P PR R 启动子启动子启动子启动子热诱导热诱导热诱导热

11、诱导 T7T7启动子启动子启动子启动子IPTGIPTG诱导诱导诱导诱导 T5T5启动子启动子启动子启动子IPTGIPTG诱导诱导诱导诱导 araara启动子启动子启动子启动子阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类大肠杆菌表达载体分类pJLA50X系列系列;pcDNAII;etcpET系列系列(T7promoter,Novagen(T7promoter,Novagen公司公司公司公司)pQE系列系列(T5promoter,Qiagen(T5promoter,Qiagen公司公司公司公司)pMAL系列系列(周质表达周质表达周质表达周质表达,BioLabs,BioLab

12、s公司公司公司公司)pGEX系列系列(GST(GST融合表达融合表达融合表达融合表达,Pharmacia,Pharmacia公司公司公司公司)pBAD系列系列(Arabinose(Arabinose诱导型诱导型诱导型诱导型)常用表达载体常用表达载体pTYB系列系列(CBD(CBD融合融合融合融合,可以自我切割可以自我切割可以自我切割可以自我切割,BioLabs),BioLabs)ProteinAProteinA GSTGST（glutathioneS-transferaseglutathioneS-transferase）CBD(chitin-bindingdomain,CBD(chitin-

13、bindingdomain,BioLabs;BioLabs;cellulose-bindingdomain,cellulose-bindingdomain,NovagenNovagen)calmodulin-bindingdomain,calmodulin-bindingdomain,StratageneStratagene)MBP(maltose-bindingprotein)MBP(maltose-bindingprotein)GFP(greenfluorescenceprotein)GFP(greenfluorescenceprotein)Thioredoxin*Thioredoxin*

14、帮助二硫键形成帮助二硫键形成帮助二硫键形成帮助二硫键形成 Dsb(periplasmaenzymeDsbA,DsbC)Dsb(periplasmaenzymeDsbA,DsbC)*二硫键的形成与二硫键的形成与二硫键的形成与二硫键的形成与 SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)KSI(ketosteroidisomerase)KSI(ketosteroidisomerase)基本上全部沉淀基本上全部沉淀基本上全部沉淀基本上全部沉淀各种融合蛋白表达载体各种融合蛋白表达载体帮助可溶化帮助可溶化帮

15、助分泌到周质帮助分泌到周质可用亲和层析纯化可用亲和层析纯化采用采用MBD融合融合采用采用GST融合融合采用采用CBD融合融合采用采用thioredoxin融合融合采用采用Origami等宿主菌等宿主菌降低菌体培养的速度降低菌体培养的速度温度温度温度温度(15-30(15-30),),降低转速降低转速降低转速降低转速让表达产物可溶化让表达产物可溶化采用采用CBD融合融合(pET36/37)(pET36/37)采用采用Dsb融合融合(pET39/40)(pET39/40)采用带采用带pelB/ompT引导肽的载体引导肽的载体(pET12/20/22)(pET12/20/22)采用带采用带MBD融合

16、融合(pMAL(pMAL载体载体载体载体,Biolabs),Biolabs)采用带采用带SUMO融合融合(pETSUMO,Invitrogen)(pETSUMO,Invitrogen)让蛋白质分泌到间质去让蛋白质分泌到间质去纯化方便纯化方便:先用先用EDTA/EDTA/蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖 溶液处理溶液处理,然后然后5mMMgSO45mMMgSO4洗出洗出His-tag(His-tag(6-8Histidine6-8Histidine)T7-tag(T7-tag(MASMTGGQQMGMASMTGGQQMG)HSV-tag(HSV-tag(QPELAPEDPEDQPELAPEDPED)S-tag(

17、S-tag(KETAAKFERQHMDSKETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag(VSV-G-tag(TTDIEMNRLGKTTDIEMNRLGK)HA-tag(HA-tag(YPYDVPDYAYPYDVPDYA)Flag-tagFlag-tag(DYKDDDDKDYKDDDDK)Myc-tag(Myc-tag(EQKLISEEDLEQKLISEEDL)各种用于抗体识别的标记各种用于抗体识别的标记为什么要为什么要加加 tag?Biotinylation-tag100100多多多多AAAA的结构域的结构域的结构域的结构域,在大肠杆菌中被识别为生在大肠杆菌中被识别为生在大肠杆菌中被识别为生

18、在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点物素化的位点物素化的位点物素化的位点.Promega.Promega的的的的PinPointPinPointTMTMXa-1;Xa-1;InvitrogenInvitrogen的的的的pET104-DEST.pET104-DEST.未命名未命名未命名未命名DVEAWLGAR,DVEAWLGAR,被用来和被用来和被用来和被用来和streptoavidinstreptoavidin结合结合结合结合(个人通讯个人通讯个人通讯个人通讯)未命名未命名未命名未命名一些病毒外壳蛋白的片段一些病毒外壳蛋白的片段一些病毒外壳蛋白的片段一些病毒外壳蛋白的片段,破坏细胞膜的结构导破

19、坏细胞膜的结构导破坏细胞膜的结构导破坏细胞膜的结构导致容易进入细胞致容易进入细胞致容易进入细胞致容易进入细胞有前景的特殊用途的有前景的特殊用途的tagDTT:intein的的Cys溴化氰溴化氰:MetThrombin:LVPRGSFactorXa:IEGREnterokinase:DDDDKPreScissionTMprotease:LEVLFQGPGenenaseITMPGAAHYTEVprotease:ENLYFQG融合蛋白的专一性切割融合蛋白的专一性切割 BL21(DE3)/pLysS:BL21(DE3)/pLysS:自身表达自身表达自身表达自身表达T7RNApolymeraseT7RN

20、Apolymerase适用适用适用适用pETpET系列等带系列等带系列等带系列等带T7T7启动子的载体启动子的载体启动子的载体启动子的载体 M15/SG13009:M15/SG13009:自身表达自身表达自身表达自身表达T5RNApolymeraseT5RNApolymerase适用适用适用适用pQEpQE系列等带系列等带系列等带系列等带T5T5启动子的载体启动子的载体启动子的载体启动子的载体 BL21BL21TrxBTrxB(DE3):(DE3):thioredoxinreductasethioredoxinreductase突变突变突变突变 Origami:Origami:thioredo

21、xinreductase/glutathionethioredoxinreductase/glutathionereductasereductase双突变双突变双突变双突变适合带适合带适合带适合带thioredoxinreductasethioredoxinreductase的的的的融合表达载体融合表达载体融合表达载体融合表达载体,帮助形成更多的二硫键帮助形成更多的二硫键帮助形成更多的二硫键帮助形成更多的二硫键 BR21CodonPlusRIL:BR21CodonPlusRIL:富含富含富含富含ATAT的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达 BR21C

22、odonPlusRP:BR21CodonPlusRP:富含富含富含富含GCGC的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达特殊的表达用菌株特殊的表达用菌株NovagenStratageneInvitrogenBioLabsQiagenPharmaciaPromegaClontechRocheGibco/BRL重要的原核表达质粒提供商重要的原核表达质粒提供商TheproteinfoldingProblemHow to get to the bottom of the funnel?And,what is at the bottom?透析法透析法:简单简单;但费

23、时但费时,费缓冲液费缓冲液,蛋白质蛋白质量少，浓度不能过高量少，浓度不能过高(容易产生沉淀容易产生沉淀)快速稀释法快速稀释法:最常用的小规模复性方法最常用的小规模复性方法;但比较费时但比较费时,费缓冲液费缓冲液,蛋白质的浓度不能蛋白质的浓度不能高高(容易产生沉淀容易产生沉淀)超滤透析法超滤透析法:比较省缓冲液比较省缓冲液,处理量大处理量大;但费时但费时,要控制好蛋白质浓度要控制好蛋白质浓度凝胶过滤法凝胶过滤法:快速快速,可重复性高可重复性高,不会产不会产生沉淀生沉淀,操作复杂一点操作复杂一点 亲和层析复性法亲和层析复性法亲和层析复性法亲和层析复性法,水相二相法水相二相法水相二相法水相二相法,e

24、tc,etc包含体蛋白质的复性方法包含体蛋白质的复性方法分子伴侣分子伴侣(MolecularChaperone)(MolecularChaperone)Amolecularchaperoneisabletotransientlybindandthusstabilizeanunstableconformationofanotherprotein,therebyfacilitatingcorrectfoldingbypreventingmisfoldingandaggregation.TypeI:chaperoneswhicharefunctionallyresponsibleforthecorr

25、ectfolding,assemblyandtransportofnewlysynthesizedpeptideHSPfamily,GroELS,ect.TypeII:chaperoneswithenzymaticpropertiesaccountableforaccelerationofratelimitingstepsofproteinfoldingPDI（protein disulfide isomeraseprotein disulfide isomerase）,PPI（peptidyl-prolyl peptidyl-prolyl cis-trans isomerase),isome

26、rase),etc两种主要的分子伴侣两种主要的分子伴侣人人PDI的结构特征的结构特征PDI作用机理作用机理 PDI has been shown to catalyze reactivation of non-native proteins without disulfide bonds.This function is independent from the redox/isomerase function,as it has been shown to exist in vitro with several model substrates that do not contain dis

27、ulfides in their native structure.Foldingassistant/chaperoneTimedadditionofPDItorefoldingFab/red.TimedadditionofPDItorefoldingFab/red.Marcus Mayer et al.,BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding ofAntibodies in Vitro,JBC Vol.275,No.38,2000Marcus Mayer et al.,BiP and PDI Cooperate in the Oxidat

28、ive Folding ofAntibodies in Vitro,JBC Vol.275,No.38,2000PPI的作用的作用Proline isomerization is widely accepted to be one of the rate-determining steps in protein folding.The function of PPIis to accelerate the cis-trans isomerization process.Molecular ChaperonCyclophilinFamily,典型的典型的PPIRefoldingofHCAIIHC

29、A IIHCA II with PPlHCA II with PPl and CsAP202N mutant with PPIP202N mutantReactivation was initiated by rapid dilution of 0.3 M GuHCl and a protein concentration of 0.025 mg/ml(0.83,uM).PPI:9.6M;CsA:25M 表达量不够高；表达量不够高；表达量不够高；表达量不够高；包含体在包含体在包含体在包含体在8M8M尿素中不能溶解；尿素中不能溶解；尿素中不能溶解；尿素中不能溶解；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量

30、偏小；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；带带带带His-tagHis-tag重组蛋白不吸附到重组蛋白不吸附到重组蛋白不吸附到重组蛋白不吸附到Ni-chelatingNi-chelating树脂上；树脂上；树脂上；树脂上；Ni-chelatingNi-chelating分离纯化的效果不好；分离纯化的效果不好；分离纯化的效果不好；分离纯化的效果不好；GSTGST融合蛋白不吸附到融合蛋白不吸附到融合蛋白不吸附到融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharoseglutathione-Sepharose上；上；上；

31、上；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；Ni-chelatingNi-chelating错用错用错用错用DTTDTT后发生黑色沉淀该怎么办？后发生黑色沉淀该怎么办？后发生黑色沉淀该怎么办？后发生黑色沉淀该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高某些表达载体的表达效率在放大培养时无法

32、提高某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高工作中经常碰到的问题工作中经常碰到的问题尝试不同表达载体，尝试不同表达载体，特别是特别是N端有融合蛋端有融合蛋白的载体白的载体是不是忘了加还原剂（是不是忘了加还原剂（DTT或巯基乙醇）？或巯基乙醇）？是不是在是不是在20冻存过？冻存过？用用4M盐酸胍试试盐酸胍试试是不是酸性蛋白质？是不是酸性蛋白质？是不是蛋白质的合成提前中止了？是不是蛋白质的合成提前中止了？（富（富含含Arg,Ile,Leu,Pro这几种氨基酸）这几种氨基酸）可以尝试用可以尝试用BL21CodonPlusRIL或或RP作宿主菌作宿主菌(St

33、ratagen)；使用使用C端带端带His-tag的融合表达载体（如的融合表达载体（如pET21,Novagen）以便纯化全长的融合）以便纯化全长的融合蛋白蛋白His-tag被操作过程混入的重金被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加属离子所饱和，可以通过添加0.5mMEDTA来去除重金属离来去除重金属离子的干扰；子的干扰；His-tag被包裹在不易和树脂发被包裹在不易和树脂发生结合的生结合的位置（比较罕见）位置（比较罕见）;其他不明原因导致弱结合其他不明原因导致弱结合样品没有很好细心去除不溶性物质样品没有很好细心去除不溶性物质重复使用前树脂没有洗干净重复使用前树脂没有洗干净蛋白质之间存

34、在相互作用蛋白质之间存在相互作用可以提高盐浓度可以提高盐浓度,改变改变pH,添加添加2-6M尿素等方法来洗去杂蛋白质尿素等方法来洗去杂蛋白质是不是在进行复性时是不是在进行复性时用了用了Redoxbuffer尝试用尝试用Ureagradient/Gelfiltration来解决来解决尽快用尽快用0.1NHCl冲洗冲洗用用0.1NNaOH/0.1%SDS洗洗主要是溶氧量的问题主要是溶氧量的问题,可可以通过在摇瓶中加入不同量的以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积。培养基的方式来确定最佳体积。细节决定成功。细节决定成功。重组重组蛋白质的表达、纯化和蛋白质的表达、纯化和后加工的各个细节对技后加工的各个细节对技术细节有高度的要求，术细节有高度的要求，直接直接决定决定了产业化的了产业化的可可行性行性。