1-2DNA重组技术的基本操作程序.pptx

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1、1.2基因工程的基因工程的基本操作程序基本操作程序1 1、原核细胞的基因结构、原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因的首端，是位于基因的首端，是RNARNA聚合酶聚合酶 识别和结合的部位识别和结合的部位，有了它才能驱动，有了它才能驱动 基因转录出基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质。，最终获得蛋白质。终止子：终止子：位于基因尾端的一段特殊的位于基因尾端的一段特殊的DNADNA 片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的转录。的转录。原基原基核因核因细结细结胞构胞构编码区：编

2、码区：非编码区非编码区能转录为能转录为mRNAmRNA，编码蛋白质，编码蛋白质不能转录为不能转录为mRNAmRNA，不能编码蛋白质，不能编码蛋白质功能功能2 2、真核细胞的基因结构、真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子真核细胞真核细胞基因结构基因结构编码区编码区非编码区：非编码区：外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔编码区是间

3、隔的、的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_ 和具和具有调控作用的有调控作用的_组成的组成的3 3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较、原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码编码区区非编码区非编码区原核生物的基因表达编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区RNA聚合酶聚合酶mRNA转录转录翻译翻译启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因蛋白质蛋白质真核生物的基因表达编

4、码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区剪接有关的酶剪接有关的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前体前体mRNA转录转录剪接剪接翻译翻译启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因蛋白质蛋白质1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取1目的基因目的基因主要是编码蛋白质的基因主要是编码蛋白质的基因获取目的基因的常用方法：获取目的基因的常

5、用方法：如：与生物抗性相关的基因、如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、与工业用酶相关的基因、具有调控作用的因子等。具有调控作用的因子等。2 1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取 2 2、利用、利用PCR技术扩增技术扩增 3 3、利用利用DNA合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成（一）从基因文库中获取目的基因1.1.基因文库的概念基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，

6、导片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。生物的不同基因。2.2.基因文库的种类基因文库的种类:基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库基因文库的构建方法 基因组文库的构建基因组文库的构建提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶用适当的限制酶 切割切割一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体片段与载体 连接连接重组重组DNADNA基因组文库基

7、因组文库导入受体菌导入受体菌 中储存中储存 cDNA文库的构建文库的构建-反转录法：反转录法：提取某种生物的提取某种生物的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组重组DNADNA与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因文库的构建方法mRNA单链单链DNA双链双链DNA思考？思考？真核生物的基因用反转录法得到的真核生物的基因用反转录法得到的cDNAcDNA与原基因相同吗？与原基因相同吗？真核细胞的cDNA的获取编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编

8、码区非编码区DNA聚合酶聚合酶剪接有关的酶剪接有关的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA反转录酶反转录酶转录转录剪接剪接反转录反转录复制复制启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因不含不含非编码非编码区区和和内含子内含子基因组文库与cDNA文库的比较文库类型文库类型cDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小基因中启动子（具有启动基因中启动子（具有启动作用的作用的DNA片段）片段）基因中内含子基因中内含子(位于编码蛋白质序列的位于编码蛋白质序列的非编码非编码DNA片段）片段）基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种

9、生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以（二）利用PCR技术扩增目的基因1概念：概念：PCR全称为全称为_，是一项在生物，是一项在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNA片段片段3前提：前提：模板模板DNA；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；热稳定热稳定DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）；酶）；DNA引物引物DNA双链双链复制复制原理：原理：条件：条件：2一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列a.DNAa.DNA变性变性（90-9590-95）：）：双链双链DN

10、ADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b.b.退火退火（55-6055-60）：系统）：系统温度降低，温度降低，引物引物与与DNADNA模板结模板结合，形成局部合，形成局部_。c.c.延伸延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板的作用下，合成与模板互补的互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNADNADNA单链单链d.d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复一步骤：每重复一次，目的基因增加次，目的基因增加_倍倍1PCR反应原理示意图：反应原理示意图：PCR反应原理示意图：反应原理示意图：PCR技术的操作过程PCRP

11、CR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数指数指数(2(2n n)形式扩增形式扩增形式扩增形式扩增思考？思考？1 1个个DNADNA分子进行分子进行PCRPCR扩增扩增,循环循环4 4次，次，理论上至少需要几个引物？理论上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为循循环次数次数)（24-1）2=30PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶

12、、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下解旋在高温下解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋变复制边解旋变复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的解旋酶、细胞内的解旋酶、DNA聚合酶等聚合酶等3.人工合成法在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用利用DNADNA合成仪用化学方法人工合成合成仪用化学方法人工合成蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨

13、基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测思考：思考：化学法合化学法合成的目的基因含成的目的基因含内含内含子、启动子和终止子子、启动子和终止子吗？吗？不含不含课堂小结目的基因的获取目的基因的获取1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成种种类类基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1目的：目的：使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可，并且可以以遗传遗传

14、给下一代，同时使目的基因能够给下一代，同时使目的基因能够表达表达和发挥作用和发挥作用。2基因表达载体基因表达载体的组成：的组成：复制原点复制原点+启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标记基因标记基因表达载体启动子：启动子：位于基因的首端的一段位于基因的首端的一段特殊的特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶聚合酶识别和结合的部位识别和结合的部位，有了它才能，有了它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得最终获得蛋白质。蛋白质。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段位于基因的尾端的一段特殊的特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的的转

15、录。转录。标记基因标记基因的作用是为了的作用是为了鉴别受体鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。将有目的基因的细胞筛选出来。基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端注意：载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了片段。表达载体在载体基础上

16、增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：限制酶和限制酶和DNADNA连接酶，两种酶作用连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体必需以表达载体的方式携带进去。的方式携带进去。三、将目的基因导入受体细胞1转化：转化：目的基因目的基因进入进入受体细胞内，并且在受体受体细胞内，并且在受体 细胞内维持细胞内维持稳定稳定和和表达表达的过程的过程。3目的基因导入受体细胞的原理：

17、目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。21、目的基因导入植物细胞的方法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T TDNADNA可以转移到受体可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的细胞，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。

18、上。构建基因表达载体构建基因表达载体转入转入农杆菌农杆菌植物植物细胞细胞导入导入稳定维持和表达稳定维持和表达过程：过程：1、目的基因导入植物细胞的方法优点：优点：经济、有效经济、有效整合到染色体整合到染色体DNADNA上上（2 2）基因枪法：）基因枪法：操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在 金属粒表面的表达载体金属粒表面的表达载体DNADNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。金属粒子：钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般金属粒子：钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般 在在0.60.64u

19、m4um 适用：单子叶植物适用：单子叶植物1、目的基因导入植物细胞的方法（3 3）花粉管通道法：）花粉管通道法：操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还未操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还未 愈合前期，剪去柱头，然后，滴入愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNADNA（含目的基（含目的基 因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 特点特点:十分简便经济十分简便经济 实例：转基因抗虫棉实例：转基因抗虫棉1、目的基因导入植物细胞的方法2、将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（3 3）程序：）程序：含目地基因的表达载体提纯含

20、目地基因的表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物（2 2）受体细胞：）受体细胞：受精卵受精卵3、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用细胞：常用细胞：大肠杆菌大肠杆菌常用方法：常用方法：CaCa2+2+处理处理获得感受态细胞获得感受态细胞过程：过程：CaCaCaCa2+2+2+2+处理处理处理处理大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态感受态感受态 细胞细胞细胞细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞 吸收吸收吸收吸收DNADNA表

21、达载体表达载体表达载体表达载体与感受态与感受态与感受态与感受态细胞混合细胞混合细胞混合细胞混合1.1.导入过程完成后，全部受体细胞都能摄导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组入重组DNADNA分子吗？分子吗？真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。2.2.目的基因进入受体细胞后，是否都能稳目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？定维持和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测思考思考四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定探针探针15N N15N N转基因生转基因生物的物的DNA14N N14N N（1 1）检测转基因生物染色体的）检测

22、转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入 了了目的基因目的基因基因探针：基因探针：放射性同位素等标记的放射性同位素等标记的含目的基因含目的基因DNADNA分子分子方法方法 DNADNA分子杂交技术分子杂交技术变性变性变性变性变性变性变性变性1、检测分子水平的检测变性变性变性变性方法方法 分子杂交技术分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了）检测目的基因是否转录出了mRNA探针探针15N N15N N转基因生物转基因生物的的mRNA14N N1、检测分子水平的检测提取提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法抗原抗原-抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌苏云金

23、杆菌将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现出现杂交带杂交带脱分化脱分化组织培养组织培养Bt毒素蛋白毒素蛋白1、检测分子水平的检测2、鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未导入中毒症状，说明未导入目的基因或导入目的基目的基因或导入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明导入了毒死亡，则说明导入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。课堂练

24、习1 1、有关基因工程的叙述中，错误的是有关基因工程的叙述中，错误的是()()A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性内切酶用于目的基因的获得、限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶A2 2、下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技

25、术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成 A.B.A.B.C.D.C.D.D课堂练习3 3、有关基因工程的叙述正确的是、有关基因工程的叙述正确的是 （）A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料资料D【拓展深化拓展深化】工具酶只有两种：限制酶在操作程序工具酶只有两种：限制酶在操作程序1 1、2 2中用到且中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；要求用同一种，目

26、的是产生相同的黏性末端；DNADNA连接酶只在操作程序连接酶只在操作程序2 2中用到。中用到。课堂练习4 4、基因工程是在、基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是补配对的步骤是 （）A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C【拓展深化拓展深化】只有第三步将目的基因导入受只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补

27、配对，其余三个步骤都涉体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对及碱基互补配对课堂练习即时应用即时应用(随学随练，轻松夺冠随学随练，轻松夺冠)5(2009年高考浙江卷年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，下列关于基因工程的叙述，错误的是错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物物B限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的连接酶是两类常用的工具酶工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细的细胞和促进目的基因的表达胞和促进目的基因的表达D D课堂练习