第六章基因重组与基因工程.pptx
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1、第十七章第十七章 基因重组与基因工程基因重组与基因工程 (genetic recombination(genetic recombination and genetic engineer)and genetic engineer)1基因重组基因重组(genetic recombination)(genetic recombination)是指在体外用酶学方法将不同来源的是指在体外用酶学方法将不同来源的DNADNA进行切割、连接,进行切割、连接,组成一个新的组成一个新的DNADNA分子的过程,又称分子的过程,又称DNADNA重组重组。基因克隆基因克隆(gene cloning)(gene clo
2、ning)将重组将重组DNADNA分子导入到合适的受体细胞中,使其扩增和繁分子导入到合适的受体细胞中,使其扩增和繁殖,以获得大量的同一殖,以获得大量的同一DNADNA分子,称此为分子,称此为基因克隆、基因克隆、DNADNA克隆克隆或分子克隆或分子克隆。基因工程基因工程(genetic engineering)(genetic engineering)是将不同来源的是将不同来源的DNADNA片段与载体分子连接形成重组片段与载体分子连接形成重组DNADNA分子,分子,再导入宿主细胞内进行表达,也称再导入宿主细胞内进行表达,也称重组重组DNADNA技术技术。2 本章主要内容本章主要内容 重要的工具酶
3、重要的工具酶 基因克隆常用的载体基因克隆常用的载体 重组重组DNADNA基本原理基本原理 重组技术在医学和制药重组技术在医学和制药 工业中的应用工业中的应用3第一节第一节 重要的工具酶重要的工具酶工工具酶具酶 基基因因工工程程中中的的工工具具酶酶主主要要包包括括用用于于DNADNA和和RNARNA分分子子的的切切割割、连连接接、聚聚合合、逆逆转转录录等等相相关关的各种酶类。的各种酶类。4一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是一类由细菌产生的能专一识别和是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链切割双链DNADNA中中的特定碱基序列的核酸
4、内切酶,简称的特定碱基序列的核酸内切酶,简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。根据限制酶作用特性,一般分为根据限制酶作用特性,一般分为、和和型,型,其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。5 限制酶(限制酶(型)识别及切割位点型)识别及切割位点 特异识别及切割特异识别及切割4 4 8 8个个bpbp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的的DNADNA片断,主要产生片断,主要产生3 3种末端结构:种末端结构:55粘性末端粘性末端 33粘性末端粘性末端 平端或钝端平端或钝端 回文序列回文序列(palindrome)(palindrome)是指该部位的核苷酸序列呈是指该部位的核苷酸序列呈180180O
5、 O反向重复反向重复;粘性末端粘性末端(sticky end)(sticky end)是指经内切酶特异切割后产生的是指经内切酶特异切割后产生的55末端突出和末端突出和33末端突出的碱基序列相互间具有互补性末端突出的碱基序列相互间具有互补性。6 产生产生5-5-粘性末端粘性末端 产生产生3-3-粘性末端粘性末端7 产生平产生平(头末头末)端端/钝端钝端其它特殊性质其它特殊性质的的型限制酶型限制酶同裂酶(同裂酶(异源同工酶异源同工酶)同尾酶同尾酶可变酶可变酶8同裂酶同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同,但具有又称异源同工酶。指来源不同,但具有相同的相同的识别识别序列序列。在切割在切割DNADNA时,
6、其时,其切割点切割点可以是可以是相同相同的,产生平的,产生平头末端,称为头末端,称为同识同切同识同切;切割点切割点也可以是也可以是不同不同的,产生的,产生33或或55粘性末粘性末端,称为端,称为同识异切同识异切。9同裂酶同裂酶同识同识同同切切10同裂酶同裂酶同识同识异异切切11同同 尾尾 酶酶 同尾酶同尾酶 指来源不同,但识别与切割顺序有一定的相关指来源不同,但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后性的一类酶。它们作用后产生相同产生相同的的粘性末端粘性末端。12可变酶可变酶可变酶可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的,识别顺序中的一个或几个碱基是可变的,并且识别顺序往往超过并且识
7、别顺序往往超过6 6个碱基对。个碱基对。如,如,BstBstpp,其识别顺序为,其识别顺序为GGTNACCGGTNACC。13 常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称微生物名称酶名称酶名称识别顺序识别顺序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciens H解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢杆菌球芽孢杆菌Bgl ACATCTEscherichia coli RY13大肠杆菌大肠杆菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌Hind AAGCTTHsuPr
8、ovidencia stuartii 164普罗威登细菌普罗威登细菌PstCTGCAGSalpStreptomyces albusSubspecies pathocidicus白色链球菌白色链球菌SalGTCGACAvaXho14 限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用 通过切割不同来源通过切割不同来源DNA双链的特异碱双链的特异碱基序列,基序列,产生产生含有黏性末端或平端的、长含有黏性末端或平端的、长度不同的度不同的DNA片段。片段。用于用于DNA重组、制备探针、分子杂交、重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。序列分析等。15二、二、DNADNA聚合酶聚合酶 (最常用的最常用的DNADN
9、A聚合酶有以下聚合酶有以下4 4种种)DNA DNA聚合酶聚合酶(全酶)(全酶)DNA DNA聚合酶聚合酶大片段大片段KlenowKlenow片段片段 Taq DNA Taq DNA聚合酶聚合酶 T T4 4 噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶16 DNA DNA聚合酶聚合酶 E.Coli E.Coli DNADNA聚合酶聚合酶(DNA pol DNA pol)是一个具有是一个具有3 3 种酶活性的多功能性酶。种酶活性的多功能性酶。包括:包括:5 533DNA DNA 聚合酶活性聚合酶活性 5 533核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 355核酸外切酶活性核酸外切酶活性17 DNA pol D
10、NA pol 应用应用 常用来常用来催化催化DNADNA缺口平移反应,制备高比活性缺口平移反应,制备高比活性DNADNA 探针探针;cDNA cDNA第二条链的合成;第二条链的合成;对对DNA3DNA3 突出末端进行标记;突出末端进行标记;DNA DNA序列分析。序列分析。18E.coliE.coli DNA pol.DNA pol.催化缺口平移催化缺口平移*T*T*T*TMg2+D N a s e I53353 5533553355335dATP,dCTP,dGTP-32P dTTPE.coli DNA POL I19 Klenow Klenow片段(片段(DNA pol.DNA pol.大
11、片断)大片断)20 KlenowKlenow片段用途片段用途 补齐双链补齐双链DNADNA的的 3 3末端;末端;用标记碱基补用标记碱基补 齐齐3 3末端末端 ;用于用于cDNAcDNA克隆中克隆中第二股链的合成第二股链的合成;DNA DNA序列分析。序列分析。21 Taq DNA pol Taq DNA pol(耐热(耐热DNADNA聚合酶)聚合酶)作用特点作用特点1 1)Taq DNA pol Taq DNA pol催化催化DNADNA合成的最适温度范围合成的最适温度范围 70 70 7575,2 2)95 95以上高温,半小时不失活,以上高温,半小时不失活,3 3)最适合用于最适合用于聚
12、合酶链反应(聚合酶链反应(PCRPCR)。22三、逆转录酶三、逆转录酶(reverse transcriptase)特点特点 逆转录酶是一个多功能性酶,至少具有以下逆转录酶是一个多功能性酶,至少具有以下3 3种酶种酶活性:活性:以单链以单链RNARNA为模板,为模板,催化合成催化合成cDNAcDNA单链单链 具有具有RNase H RNase H 活性,能水解活性,能水解RNA:DNARNA:DNA杂交链中的杂交链中的 RNA RNA 以以DNADNA为模板,为模板,催化合成催化合成cDNAcDNA双链。双链。23 逆转录酶的应用:逆转录酶的应用:将将mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAc
13、DNA,构建,构建cDNAcDNA文库文库;补平和标记补平和标记5 5-末端突出的末端突出的DNADNA片段;片段;代替代替KlenowKlenow酶用于酶用于DNADNA序列分析;序列分析;制备杂交探针等。制备杂交探针等。24四、四、DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)催催化化双双链链DNADNA中中一一条条链链的的33OHOH与与另另一一条条链链的的55POPO3 3H H2 2形成磷酸二酯键,从而构成完整的形成磷酸二酯键,从而构成完整的DNADNA长链。长链。DNADNA连接酶的用途连接酶的用途(1 1)两个双链两个双链DNADNA片段连接起来片段连接
14、起来5-ACG AATTCGT-3 5-ACG AATTCGT-3 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 5-ACGAATTCGT-3 5-ACGAATTCGT-33-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-53-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5(2 2)修补带有缺口的双链修补带有缺口的双链DNADNA分子分子T4DNA连接连接酶酶25五、碱性磷酸酶五、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)能够催化水解去除能够催化水解去除DNADNA或或RNA5-RNA5-端的磷酸基团。端的磷酸基团。用途用途 制备载体制备载体时,用碱性磷酸酶处理去除载体分
15、子时,用碱性磷酸酶处理去除载体分子 55端磷酸基后,可防止载体自身环化连接,提高端磷酸基后,可防止载体自身环化连接,提高重组效率。重组效率。用用3232P P标记标记5-5-端前,去除端前,去除5-P5-P,再通过激酶作用,再通过激酶作用把放射性核苷酸加到把放射性核苷酸加到5-5-端进行标记端进行标记。26六、末端六、末端 (脱氧核苷酸)转移酶(脱氧核苷酸)转移酶(TdT)(TdT)作用作用 将将标标记记或或未未标标记记的的dNTPdNTP加加到到DNADNA的的3OH3OH末末端端;也也可可催催化化载载体体分分子子或或待待克克隆隆的的DNADNA片片段段上上加加上上互互补补的的同同聚聚尾尾,
16、便便于于进进一步连接。一步连接。应用应用 探针标记探针标记 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾,以便于进行连接在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾,以便于进行连接333327重要的工具酶重要的工具酶工具酶工具酶 活性活性 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异碱基序列,切割识别特异碱基序列,切割DNA DNA T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 催化催化DNA5DNA5-磷酸与磷酸与3 3-羟基羟基 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNA DNA 逆转录酶逆转录酶
17、 以以RNARNA为模板合成为模板合成cDNA cDNA 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除切除5 5 末端磷酸末端磷酸T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端合成同聚尾端合成同聚尾28第二节第二节 基因克隆常用的载体基因克隆常用的载体载体载体(vector)(vector)是指能在连接酶作用下和外源是指能在连接酶作用下和外源DNADNA片段连接起来,并运送片段连接起来,并运送到宿主细胞的运载工具。到宿主细胞的运载工具。其化学本质为其化学本质为DNADNA分子分子 。本节主要内容本节主要内容 载体必须
18、具备的基本条件载体必须具备的基本条件 载体的分类载体的分类 常用的载体常用的载体29一、载体必须具备的基本条件一、载体必须具备的基本条件 具有独立复制能力具有独立复制能力 具备多个限制酶的识别位点具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点多克隆位点)具有具有遗传表型或遗传表型或筛选筛选标记标记 有有足够的容量足够的容量以容纳外源以容纳外源DNADNA片段片段 可导入受体细胞。可导入受体细胞。30二、载体的分类二、载体的分类*(一)(一)克隆载体克隆载体 用来克隆和扩增用来克隆和扩增DNADNA片段的载体。片段的载体。有质粒有质粒DNADNA、噬菌体、噬菌体DNADNA和病毒和病毒DNADNA三类三类
19、。(二)(二)表达型载体表达型载体 为了使插入的外源为了使插入的外源DNADNA能够表达为多肽链而设计的能够表达为多肽链而设计的载体称为载体称为表达型载体表达型载体。表达型载体表达型载体除需载体必备条件外,还需相应的除需载体必备条件外,还需相应的启启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控等表达调控构件。构件。31三、常用的载体三、常用的载体(一)(一)质粒质粒(plasmid)(plasmid):是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状状DNADNA分子。分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点:作为克隆载
20、体的质粒应具备以下特点:1.1.分子量相对较小,能稳定存在于细菌体内,分子量相对较小,能稳定存在于细菌体内,有较高的拷贝数;有较高的拷贝数;2.2.具有具有1 1个以上的遗传标志,便于筛选;个以上的遗传标志,便于筛选;3.3.具有多克隆位点。具有多克隆位点。32 总而言之,质粒载体应该是一种分子量总而言之,质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的较小、高拷贝的“松弛型松弛型”质粒,且具有一质粒,且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒:广泛应用的质粒:pBR32质粒、质粒、pUC系列等系列等33 pBR322pBR322质粒质粒 4363 bp
21、4363 bp 含一个复制点含一个复制点含一个抗氨卞青霉素基因含一个抗氨卞青霉素基因(ampampR R)一个抗四环素基因一个抗四环素基因 (tettetR R)ampampR R和和tettetR R抗性基因内各有抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点,供一些限制酶的酶切位点,供外源基因插入外源基因插入 当外源基因插入抗药基当外源基因插入抗药基因内后,抗药基因失活。因内后,抗药基因失活。AmpAmpR RAmpAmp敏感敏感(AmpAmpS S)、TetTetR RTetTet敏感敏感(TetTetS S).).34pUC系列质粒系列质粒 由由pBR322pBR322和和M13M13噬噬菌菌体体
22、构构建建而成的双链质粒载体;而成的双链质粒载体;(1 1)2674bp 2674bp;(2 2)有有ampampR R和与和与M13M13噬菌体噬菌体 相同的多克隆位点(相同的多克隆位点(MCSMCS)(3 3)有有1 1个个来来自自E.coliE.coli的的LacZLacZ基基因因片片断断,编编码码半半乳乳糖糖苷苷酶酶,便便于蓝白筛选于蓝白筛选35 (二二)噬菌体噬菌体 组成特点组成特点:双链线状双链线状DNADNA分子,分子,全长全长50kb50kb,含含6666个基因,个基因,在其分子两端各含有在其分子两端各含有1212个碱基的互补单链,是个碱基的互补单链,是天然的粘性末端,被称为天然
23、的粘性末端,被称为COSCOS位点位点。36 噬菌体两种生长途径(示意图)噬菌体两种生长途径(示意图)37 噬菌体感染细菌后的噬菌体感染细菌后的两种生长途径两种生长途径 溶菌性生长溶菌性生长 噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后,借借助助其其2 2个个COSCOS位位点点互互补补成成环环,在在宿宿主主菌菌体体内内连连续续复复制制,合合成成大大量量基基因因产产物物,进进而而装装配配成成噬噬菌菌体体颗粒,颗粒,裂解宿主菌裂解宿主菌,释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。,释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长溶源性生长 噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后,可可将将自自身身DNADNA整整合合到到细细菌
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- 第六 基因 重组 基因工程
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