离子交换层析分离技术.pptx

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1、仪器设备简介仪器设备简介第1页/共45页离子交换全套装置离子交换全套装置第2页/共45页第第 九九 章章 离子交换层析离子交换层析第一节第一节 离子交换层析基本原理离子交换层析基本原理第二节第二节 离子交换剂的分类与性质离子交换剂的分类与性质 第三节第三节 离子交换剂与缓冲液的选择离子交换剂与缓冲液的选择第四节第四节 离子交换拄层析操作方法离子交换拄层析操作方法第五节第五节 离子交换拄层析应用离子交换拄层析应用第3页/共45页第一节第一节 离子交换层析基本原理离子交换层析基本原理一、离子交换剂的组成结构及其的特性一、离子交换剂的组成结构及其的特性 二、离子交换剂的选择性二、离子交换剂的选择性

2、三、离子交换柱层析原理示意图三、离子交换柱层析原理示意图 第4页/共45页一、离子交换剂的组成结构及其特性一、离子交换剂的组成结构及其特性 基质基质基质基质 电荷基团电荷基团电荷基团电荷基团 反离反离反离反离子子子子商品名商品名商品名商品名纤维素纤维素纤维素纤维素 OOCHCH2 2COOCOO-NaNa+CM-CM-纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素纤维素-O-O-O-O-（CHCHCHCH2 2 2 2）2 2 2 2-N N+H H H H（C C C C2 2 2 2H H H H5 5 5 5）2 2 2 2 ClCl-DEAE-DEAE-纤维素纤维素纤维素纤维素聚苯乙烯聚苯

3、乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯SOSO3 3 3 3-NaNa+732732阳离子树阳离子树阳离子树阳离子树脂脂脂脂 聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯聚苯乙烯N N+（CHCH2 2）4 4 4 4 ClCl-717717阴离子树阴离子树阴离子树阴离子树脂脂脂脂第5页/共45页聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备第6页/共45页离子交换树脂的形状结构示意图离子交换树脂的形状结构示意图第7页/共45页二、离子交换剂的选择性二、离子交换剂的选择性1 1、平衡常数、平衡常数 2 2、选择性与离子的电荷及、选择性与离子的电荷及 水合离子半径的关系水合离子半径的关系 3 3、离子浓度对选择

4、性的影响、离子浓度对选择性的影响4 4、两性物质的选择性、两性物质的选择性 第8页/共45页1 1、平衡常数、平衡常数 值值反反映映离离子子交交换换剂剂对对不不同同离离子子的的结结合合力力或或选选择择性性，称称为为选选择择系系数数，此此外外平平衡的移动遵循质量作用定律衡的移动遵循质量作用定律 若若K KB BA A值值1 1，即即RBRBRARA，若若 K KB BA A值值 1 1，即即 RBRBRA,RA,若若K KB BA A值值1 1，即即RBRBRARA，RA+BRA+B+RB+A RB+A+第9页/共45页2 2、选择性与离子的电荷及、选择性与离子的电荷及水合离子半径的关系水合离子

5、半径的关系 离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比，而与水合离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。离子半径的平方成反比。一价离子：LiLi+NaNa+K K+RbRb+CsCs+二价离子：MgMg2+2+CaCa2+2+SrSr2+2+BaBa2+2+一价阴离子：F F-ClCl-BrBr-I I-不同价阳离子：NaNa+CaCa2+2+AlAl3+3+TiTi4+4+第10页/共45页磺酸基树脂和季胺基树脂磺酸基树脂和季胺基树脂对各种离子的相对选择系数对各种离子的相对选择系数 阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂 阴离子树脂

6、阴离子树脂阴离子树脂阴离子树脂反离子反离子反离子反离子相对选择系数相对选择系数相对选择系数相对选择系数反离子反离子反离子反离子相对选择系数相对选择系数相对选择系数相对选择系数H H H H+NaNaNaNa+NHNHNHNH4 4 4 4+K K K K+MnMnMnMn2+2+2+2+MgMgMgMg2+2+2+2+FeFeFeFe2+2+2+2+1.01.01.01.01.51.51.51.51.951.951.951.952.52.52.52.52.352.352.352.352.52.52.52.52.552.552.552.55OHOHOHOH-柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸乙酸乙酸乙酸乙

7、酸 ClClClCl-HCOHCOHCOHCO-HPOHPOHPOHPO-苯苯苯苯1.01.01.01.02202202202203.23.23.23.2 222222226.06.06.06.05.55.55.55.5 500500500500 第11页/共45页三、离子交换柱层析原理示意图三、离子交换柱层析原理示意图动画按钮第12页/共45页第二节第二节 离子交换剂的分类及性质离子交换剂的分类及性质一、离子交换剂分类一、离子交换剂分类二、离子交换剂性质二、离子交换剂性质 第13页/共45页一、离子交换剂分类一、离子交换剂分类1疏水性2亲水性(1)阳离子交换剂(2)阴离子交换剂（1）纤维素离

8、子交换剂（2）交联葡聚糖离子交换剂（3）琼脂糖离子交换剂第14页/共45页1 1疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 R-SO R-SO-3 3H+NaH+Na+=R-SO=R-SO3 3Na+HNa+H+R-PO R-PO（OHOH）2 2+Na+Na+=R-POOHONa+H=R-POOHONa+H+R-NR-N+（CHCH3 3）3 3 OHOH-+ClCl-=R-NR-N+（CHCH3 3）3 3 ClCl-+OHOH-R-NR-N+（CHCH3 3）2 2 OHOH-+H+H2 2O=R-NO=R-N+（CHCH3 3）2 2 H HOHOH-R-N R-N+（CHCH3 3）2 2 H

9、 HOHOH-+Cl+Cl-=R-N=R-N+（CHCH3 3）2 2 H HCl+OHCl+OH-阴离子交换剂 阳离子交换剂第15页/共45页2 2亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 磷酸纤维素 CM-纤维素 DEAE-纤维素 CM-交联葡聚糖 DEAE-交联葡聚糖CM-Sepharose CL-6BCM-Sepharose CL-6B 第16页/共45页二、离子交换剂性质二、离子交换剂性质 颜色与形状颜色与形状 交联度交联度 吸水量或膨胀度吸水量或膨胀度 交换容量交换容量稳定性稳定性 比重比重 第17页/共45页交换容量交换容量交换容量交换容量:是指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换

10、的能力。(mgg或mmolg、mgml或mmolml)交换容量的交换容量的测定测定：强酸型与强碱型测定其解离盐的能力；弱酸型与弱碱型测定其中和酸碱的能力。影响交换容量的影响交换容量的因素因素：筛孔、离子强度、pH值。第18页/共45页强酸型阳离子交换介质强酸型阳离子交换介质交换容量的测定法交换容量的测定法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净用1mol1molL L的的NaOHNaOH处理，去离子水洗至中性，处理，去离子水洗至中性，1mol1molL L的的HClHCl处理，去离子水洗至中性。然后用处理，去离子水洗至中性。然后用1mol

11、1molL L的的NaClNaCl洗脱，洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的收集洗脱液，再通过已标定的NaOHNaOH滴定洗脱液中的氢离子滴定洗脱液中的氢离子浓度，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介浓度，计算出吸附氢离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量，即可得到交换容量。质的质量，即可得到交换容量。计算公式如下：计算公式如下：第19页/共45页强碱型阴离子交换介质强碱型阴离子交换介质交换容量的测定方法交换容量的测定方法 取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，取一定量的离子交换介质，去离子水溶胀，漂洗干净，用漂洗干净，用1mol1molL L的的HClHCl处理，去离子水洗至处理，去离

12、子水洗至中性，中性，1mol1molL L的的NaOHNaOH处理，去离子水洗至中性。处理，去离子水洗至中性。然后用然后用1mol1molL L的的NaClNaCl洗脱，收集洗脱液，再通洗脱，收集洗脱液，再通过已标定的过已标定的HClHCl滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，滴定洗脱液中的氢氧根离子浓度，计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子计算出吸附氢氧根离子的毫摩尔数量，除以离子交换介质的质量即可得到交换容量。计算公式如交换介质的质量即可得到交换容量。计算公式如下：下：第20页/共45页凝胶或纤维类弱碱型阴离子或弱酸性阳离子交换凝胶或纤维类弱碱型阴离子或弱酸性阳离子交换介质换容量的测定方法介

13、质换容量的测定方法 取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用取一定量的离子交换介质，漂洗干净，用1mol1molL L的的NaClNaCl处理，去离子水洗至中性，缓冲处理，去离子水洗至中性，缓冲液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至液平衡，用已知蛋白的浓度样品过柱吸附，直至柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定浓度的柱内的介质吸附的量达到饱和。用一定浓度的NaClNaCl或其他的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗或其他的洗脱剂洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白质的浓度，按如下计算公式交换容脱液中的蛋白质的浓度，按如下计算公式交换容量。量。第21页/共45页第三节第三节 离子交换剂与缓冲液的选择离子交

14、换剂与缓冲液的选择 一一、离离子子交交换换剂剂的的选选择择二、缓冲液的选择二、缓冲液的选择 第22页/共45页一、离子交换剂的选择一、离子交换剂的选择必须考虑的影响因素必须考虑的影响因素 1 1阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择2 2强、弱离子交换剂的选择强、弱离子交换剂的选择3 3不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择4 4不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择第23页/共45页必须考虑的因素必须考虑的因素要求要求 高度的不溶性和疏松的多孔结构或巨大的表高度的不溶性和疏松的多孔结构或巨大的表面积，较多的交换基团和稳定的物理化学性面积，较多的交换基团和稳定的物理化学性

15、质质 影响因素因素 对样品生物活性和可溶性的影响对样品生物活性和可溶性的影响 pHpH对交换基团、分离物电荷及电性强弱的影对交换基团、分离物电荷及电性强弱的影响响 分子大小及共存物质的影响分子大小及共存物质的影响第24页/共45页1 1阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择参照电泳结果参照电泳结果测定测定pIpI确定稳定确定稳定pHpH范围范围 碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c c 酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCGHCG第25页/共45页离子交换剂的选择图离子交换剂的选择图第26页/共45页2 2、强、弱

16、离子交换剂的选择、强、弱离子交换剂的选择第27页/共45页3 3、不同离子型交换剂的选择、不同离子型交换剂的选择选用何种类型离子交换剂?-取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。第28页/共45页4 4不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择基质的理化性质目标物质的理化性质溶液的组成及杂质含量第29页/共45页二、缓冲液的选择二、缓冲液的选择1 1、缓冲液、缓冲液pHpH的选择的选择 2 2、缓冲液离子组成的选择、缓冲液离子组成的选择3 3

17、、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择第30页/共45页1 1、缓冲液、缓冲液pHpH的选择的选择 要求：要求：起起始始缓缓冲冲液液能能使使样样品品中中有有效效成成分分与与离离子子交交换换剂剂结结合合，洗洗脱脱液液能能使使有有效效成成分分从从离离子交换剂上解离下来。子交换剂上解离下来。PHPH值与目标物值与目标物pIpI的关系（的关系（pH=pI1pH=pI1）选择性吸附选择性吸附 选选用用弱弱阳阳离离子子交交换换剂剂时时，pHpH高高于于其其pKpK；选选用用弱弱阴阴离离子子交交换换剂剂时时，pHpH低低于于其其pKpK；第31页/共45页2 2、缓冲液离子组成的选择、缓冲液离子组成的

18、选择缓冲液离子的缓冲液离子的pKpK值要接近所用的值要接近所用的pHpH，采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，如：如：TrisTris缓缓冲冲液液离离子子不不影影响响被被分分离离物物的的活活性性、测测定定、溶解度。溶解度。第32页/共45页3 3、缓冲液离子强度的选择、缓冲液离子强度的选择起起始始缓缓冲冲液液能能使使样样品品中中有有效效成成分分与与离离子子交交换剂结合，一般小于换剂结合，一般小于0.1mol/L0.1mol/L。洗洗

19、脱脱液液能能使使有有效效成成分分从从离离子子交交换换剂剂上上解解离离下来，一般下来，一般0.15mol/L0.15mol/L（或采用（或采用pHpH洗脱）。洗脱）。第33页/共45页第四节第四节 离子交换拄层析操作方式离子交换拄层析操作方式一一、离离子子交交换换剂剂的的处处理理、转转型型和和再再生生二、分离物质的交换二、分离物质的交换三、物质的洗脱与收集三、物质的洗脱与收集 第34页/共45页一、离子交换剂的处理和转型一、离子交换剂的处理和转型一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 用用2-42-4倍的倍的2mo

20、l/L NaOH2mol/L NaOH或或2mol/L HCl2mol/L HCl溶液处理溶液处理 亲水性离子交换剂亲水性离子交换剂 用用0.5mol/LNa0H0.5mol/LNa0H或或0.5mol/LHCl0.5mol/LHCl溶液处理；溶液处理；转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程。欲欲使使阳阳离离子子交交换换剂剂转转成成钠钠型型时时，则则需需用用NaOHNaOH处处理理；欲欲使使其其转转成成氢氢型型时时，则则需需用用HClHCl处处理理；欲欲使使其其带带铵离子时，则需用铵离子时，则需用NHNH4 4OHOH或或NHNH4 4C1

21、C1处理。处理。目的：使离子交换剂带上所希望的离子或基团第35页/共45页二、分离物质的交换二、分离物质的交换分批法分批法柱层析法柱层析法实际交换量只能按理论交换量的实际交换量只能按理论交换量的2525-50-50计计算算。第36页/共45页分批法分批法第37页/共45页柱层析系统的组装柱层析系统的组装柱层析系统的连接第38页/共45页三、物质的洗脱与收集三、物质的洗脱与收集 梯度混合器及形成的梯度混合器及形成的梯度变化梯度变化离子强度离子强度梯度洗脱梯度洗脱pHpH值梯度洗脱值梯度洗脱第39页/共45页产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变化变化 C=C C=

22、CB B-（C CB B-C-CA A）（）（1-V1-V2 2/V/V1 1）B1/A1B1/A1 C CA A、C CB B 梯度混合器梯度混合器A A瓶、瓶、B B瓶的浓度；瓶的浓度；A1 A1、B1 B1 A A瓶、瓶、B B瓶的横切面积；瓶的横切面积；V V2 2流经层析柱的体积，流经层析柱的体积，V V1 1梯度洗脱液的总体积。梯度洗脱液的总体积。第40页/共45页线性和阶梯式梯度溶液分离牛血线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱清白蛋白的图谱第41页/共45页第五节第五节 离子交换拄层析应用离子交换拄层析应用 一、去离子水的制备一、去离子水的制备二、制备、纯化生命物质二、制备

23、、纯化生命物质二、测定蛋白质的等电点二、测定蛋白质的等电点 第42页/共45页思考题思考题1 1、离子交换剂有那几部分组成？何为阳离子和阴、离子交换剂有那几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？离子交换剂？2 2、弱酸性和弱碱性的纤维素离子交换剂分别适宜、弱酸性和弱碱性的纤维素离子交换剂分别适宜在那些在那些PHPH范围内应用？为什么？范围内应用？为什么？3 3、解释选择系数、转型及再生的含义？、解释选择系数、转型及再生的含义？4 4、梯度缓冲液液如何配制？、梯度缓冲液液如何配制？5 5、用阳离子交换树脂分离下列氨基酸对，用、用阳离子交换树脂分离下列氨基酸对，用pH7.0pH7.0的缓冲液洗脱时那种氨基酸先被洗脱下的缓冲液洗脱时那种氨基酸先被洗脱下来来?（1010）(1)Asp(1)Asp和和Lys (2)ArgLys (2)Arg和和Met (3)GluMet (3)Glu和和Val (4)GlyVal (4)Gly和和Leu (5)SerLeu (5)Ser和和AlaAla6 6、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为为4.04.0、6.06.0、7.57.5和和9.09.0的蛋白质混合液的方的蛋白质混合液的方案，并简述理由。案，并简述理由。第43页/共45页稍息稍息第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页