实验三红曲色素的提取幻灯片.ppt

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1、实验三红曲色素的提取第1页，共44页，编辑于2022年，星期五123红曲霉菌红曲背景简介：背景简介：红曲色素第2页，共44页，编辑于2022年，星期五红曲霉菌 红曲霉菌是一种对人类有益的真菌，红曲霉菌能使大米发酵制成红曲米红曲米。红曲霉菌菌丝具有横隔、多核、分枝较多且不规律。由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明，称为丹曲，至今已有1000多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。第3页，共44页，编辑于2022年，星期五n红曲菌是腐生真菌，生长的最适pH为3.5-5，能耐pH3.5，尤嗜乳酸。n生长温度为26-42，最适温度为32-35；能耐10%乙醇。n能合成生

2、物素、泛酸、尼克酸硫胺素、核黄素等。还能产生色素、乙醇、琥珀酸及少量乳酸、醋酸等。红曲菌的液化型-淀粉酶的活性弱，而糖化型-淀粉酶的活性较强，故可用来生产红色麦芽糖。红曲菌的蛋白酶的活性较高。n红曲霉可代谢生成多种酶类，有葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。特性：第4页，共44页，编辑于2022年，星期五红曲 红曲又名丹曲、赤曲、红曲米，是以籼米为原料，经红曲霉菌液体深层发酵精致而成，是一种纯天然、安全性高、有益于人体健康的食品添加剂。而且本品色泽鲜艳、色调纯正是天然绿色食品理想的着色剂。它应用范围广泛，包括食品类（肉制品、果汁、色酒、果酱、饮料、糖果、糕点、酱油、保健醋等）；药品

3、类（药品着色剂、功能性保健品）；化妆品类。第5页，共44页，编辑于2022年，星期五 红曲色素红曲色素 红曲色素是一种由红曲霉属的丝红曲色素是一种由红曲霉属的丝状真菌经发酵而成的优质的天然食用状真菌经发酵而成的优质的天然食用色素，是红曲霉的色素，是红曲霉的次级代谢产物。次级代谢产物。红曲色素，红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素。商品名叫红曲红，是以大米、大豆为主要原为主要原料，经料，经红曲霉菌红曲霉菌液体发酵培养、提取、液体发酵培养、提取、浓缩、精制而成，或者是以浓缩、精制而成，或者是以红曲米红曲米为为原料，经萃取、浓缩、精制而成的天原料，经萃取、浓缩、精制而成的天然红色色素。然红色色素。第

4、6页，共44页，编辑于2022年，星期五 第7页，共44页，编辑于2022年，星期五 红曲色素红曲色素 物理性质：物理性质：红曲色素呈深紫红色粉末，略带异臭，熔点为165192。化学性质：化学性质：红曲色素中的脂溶性色红曲色素中的脂溶性色素均能溶于乙醇等有机溶剂。常用的素均能溶于乙醇等有机溶剂。常用的溶剂是溶剂是乙醇乙醇和和醋酸醋酸，红曲色素含量低时其溶液呈鲜红色，含量高时呈带黑褐色并伴有荧光产生。对蛋白质的着色性能极好，一旦染着，虽经水洗，亦不掉色。第8页，共44页，编辑于2022年，星期五红曲色素的特性：1 1 热稳定性热稳定性 经研究证明，红曲色素的热稳定性较好，优于其他合成色素，在天然

5、色素中其耐热性经研究证明，红曲色素的热稳定性较好，优于其他合成色素，在天然色素中其耐热性能也属优良。能也属优良。2 2 光稳定性光稳定性 红曲色素的醇溶液受紫外线的影响较小，但日光能使色度降低。通过对红曲色红曲色素的醇溶液受紫外线的影响较小，但日光能使色度降低。通过对红曲色素中红、橙、黄素中红、橙、黄3 3类色素光稳定性实验分析发现，红曲色素中红、橙、黄类色素光稳定性实验分析发现，红曲色素中红、橙、黄3 3类色类色素间光稳定性差别很大，黄色素的光稳定性最强，其次为红色素，橙色素对光素间光稳定性差别很大，黄色素的光稳定性最强，其次为红色素，橙色素对光最不稳定。最不稳定。3 3 对其他物质的稳定性

6、质对其他物质的稳定性质 实践证明，红曲色素不受常见金属离子与氧化剂和还原剂的影响。实践证明，红曲色素不受常见金属离子与氧化剂和还原剂的影响。4 4 抗菌性抗菌性 对食品中对食品中 54 54 种易污染的微生物进行抑菌试验证明：红曲色素对肉毒梭状芽胞种易污染的微生物进行抑菌试验证明：红曲色素对肉毒梭状芽胞杆菌，蜡状芽胞杆菌、霉状杆菌、枯草杆菌、金黄葡萄球菌、荧光假单胞杆菌杆菌，蜡状芽胞杆菌、霉状杆菌、枯草杆菌、金黄葡萄球菌、荧光假单胞杆菌有较强的抑制作用。有较强的抑制作用。第9页，共44页，编辑于2022年，星期五一、实验目的 1 1、了解红曲菌液体菌种的制备方法,为红曲发酵实验准备液体种子。2

7、 2、了解固体发酵的工艺过程,在实验室中小规模制备红曲。3 3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。的测定方法。第10页，共44页，编辑于2022年，星期五123红曲液体菌种的制备红曲固体发酵项目项目红曲色素的提取及红曲色价测定第11页，共44页，编辑于2022年，星期五红曲液体菌种的制备一、实验原理 红曲霉菌是一种好氧性微生物,除了能进行固体浅盘培养外,还可以用液体摇瓶培养的方法来获得种子。液体菌种生产具有纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到固体培养料内有流动性好、萌发点多，菌丝生长迅速流动性好、萌发点多，菌丝

8、生长迅速等特种点。液体菌种应用于生产与固体菌种相比有以下优点：菌种生产周期短；接种后，萌发点多；接种方便、成本低；适宜工厂化生产。液体菌种为固态发酵的集约化、标准化生产创造了更好的条件。第12页，共44页，编辑于2022年，星期五二、实验器材与试剂 1菌种：两种红曲菌种 2玉米面液体培养基（g/L）：蛋白胨 20；玉米面 20；酵母浸粉 10；硫酸镁0.5；磷酸氢二钾 1；硫酸亚铁 0.1；pH 6.0。3两个500ML三角瓶，酒精灯，接种针，恒温摇床,超净工作台,高压蒸汽灭菌锅等。第13页，共44页，编辑于2022年，星期五第14页，共44页，编辑于2022年，星期五三、实验步骤1.配制玉米

9、面液体培养基。500mL 三角瓶中装玉米面液体培养基 150mL,包扎后 0.lMPa 灭菌 20 分钟。第15页，共44页，编辑于2022年，星期五2.玉米面液体培养基灭菌冷却后，每瓶中接入 1/4 支红曲斜面菌苔(注意无菌操作)。第16页，共44页，编辑于2022年，星期五3.接种后置30恒温摇床中 180 rpm 摇瓶培养 3天。第17页，共44页，编辑于2022年，星期五红曲固体发酵第18页，共44页，编辑于2022年，星期五一、实验原理红曲霉菌作为红曲的生产菌,以其可产生大量天然色素而著称。红曲的应用主要有三方面：食品色素、药物和发酵食品。红曲的主要成分 1）红曲色素：黄色素、橙色素

10、和紫红色素 2）活性酶 3）洛伐他汀（日本发现）4）抑菌物质：桔霉素(Citrinin)等 国内红曲的生产现在普遍采用固态发酵固态发酵的方法。红曲固体发酵第19页，共44页，编辑于2022年，星期五红曲固态发酵固态发酵的定义：微生物在几乎没有游离可流动水的培养基上的生长过程及生物反应过程。第20页，共44页，编辑于2022年，星期五影响红曲发酵的因素影响红曲发酵的因素（1 1）菌种：应选择生长快、适应性强、产红色素明显的菌株；）菌种：应选择生长快、适应性强、产红色素明显的菌株；（2 2）原料：一般选用无黏性的梗米或籼米，其淀粉含量高、营养丰富，且）原料：一般选用无黏性的梗米或籼米，其淀粉含量高

11、、营养丰富，且可吸收适量水分。米的含水量对发酵影响很大，起始水分含量低，红曲色可吸收适量水分。米的含水量对发酵影响很大，起始水分含量低，红曲色素易生成；水分含量高，会抑制色素合成。一般米中含水量以素易生成；水分含量高，会抑制色素合成。一般米中含水量以25%25%30%30%为为宜；宜；（3 3）补水：红曲霉在生长繁殖过程中，需要补充适量水分，尤其在生长旺盛）补水：红曲霉在生长繁殖过程中，需要补充适量水分，尤其在生长旺盛期补水显得更为重要；期补水显得更为重要；（4 4）湿度：空气相对湿度关系到水分的蒸发，对发酵的影响也很大，一般）湿度：空气相对湿度关系到水分的蒸发，对发酵的影响也很大，一般RHR

12、H控制控制在在85%85%以上；以上；（5 5）温度：能在）温度：能在20203737范围内生长，通常冷却至范围内生长，通常冷却至3030左右即可接种，采用左右即可接种，采用3030发酵；发酵；（6 6）通气：红曲霉是一种好氧性微生物，因此培养过程中要注意保持良好的）通气：红曲霉是一种好氧性微生物，因此培养过程中要注意保持良好的通气。通气。第21页，共44页，编辑于2022年，星期五1.碳氮源和生长素 红曲霉能利用多种糖类生长，一般说来，淀粉、糊精、葡萄糖等都是良好的碳源，而在对麦芽糖、蔗糖等的利用上各菌株间差异很大。另外，适于红曲霉生长的碳源并不一定有利于色素的产生，如红曲霉Monascus

13、 sp.3.973菌株用合成培养基（糖5，NaNO3 1，KH2PO4 0.5%，MgSO47H2O 0.25，FeCl3微量，150 mL三角瓶内装25 mL培养基）培养时，若以麦芽糖为碳源，可得生物量（干重）0.1 g，稀释100倍后的发酵液其吸光度（A505nm）为0.860；而以木糖为碳源时，生物量仅0.04 g，但是1%发酵液的吸光度（A505nm）可达1.850，说明生长与色素的产生之间不呈正相关。就氮源而言，NaNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4和蛋白胨等都是红曲霉生长的良好氮源，然而菌体生长与色素生成之间也不呈正相关。泛酸钙、对氨基苯甲酸、维生素B6、肌醇等含氮物质具有促

14、进某些菌株生长及色素生成的作用。补充点：补充点：培养条件对菌体生长及红曲色素形成的影响培养条件对菌体生长及红曲色素形成的影响第22页，共44页，编辑于2022年，星期五培养条件对菌体生长及红曲色素形成的影响培养条件对菌体生长及红曲色素形成的影响2.2.温度和温度和pHpH 虽然不同的红曲霉菌株其最适生长温度和最适生长虽然不同的红曲霉菌株其最适生长温度和最适生长pHpH有所不同，但大有所不同，但大多数菌株的适温为多数菌株的适温为30303535，2525以下或以下或4040以上生长缓慢。最适以上生长缓慢。最适pHpH为为3.03.05.05.0，pH 3.0pH 3.0以下生长缓慢，以下生长缓慢

15、，pH5.0pH5.0以上则不适于产生色素。以上则不适于产生色素。3.3.无机盐类无机盐类 高浓度的高浓度的CoCl2CoCl2（10104 4）、）、CuCl2CuCl2（10106 6）和）和ZnCl2ZnCl2（10103 3）对大多）对大多数红曲霉株的生长有抑制作用，低浓度的数红曲霉株的生长有抑制作用，低浓度的CoCl2CoCl2（10105 5）、）、CuCl2CuCl2（10107 7）和）和ZnCl2ZnCl2（10105 5）可促进色素生成。）可促进色素生成。第23页，共44页，编辑于2022年，星期五二、实验器材与试剂1、制曲原料:优质籼米。2、蒸锅、三角瓶、玻璃棒、移液管（

16、灭菌），超净工作台。第24页，共44页，编辑于2022年，星期五工艺流程：菌种选育斜面培养摇瓶培养液体种子发酵大米清理浸泡清洗蒸饭冷却接种固体培养干燥粉碎红曲色素提取第25页，共44页，编辑于2022年，星期五三、实验步骤1 浸米:取1/3袋左右的大米，25 以上浸米约20h,大米吸收水分约在 28%30%。2蒸米:将浸好的米用清水淋去米浆水,沥干,即可蒸米。上汽火力要强,加水40%，121，蒸30分钟，待全部圆气以后，饭粒呈玉色,粒粒疏松,不结团块。3摊凉接种:将蒸熟的曲料倒在超净工作台上迅速打碎团块,摊平冷却到 3032。每组准备好500ml三角瓶装5-10厘米左右米饭。然后在无菌操作台上

17、接种，接种量2%10%，接种前用具消毒灭菌，在酒精灯火焰上方操作接种。充分翻拌混合均匀,操作要迅速,以减少杂菌污染。第26页，共44页，编辑于2022年，星期五4发酵培养:接好种的三角瓶在恒温恒湿生长培养箱中，3035培养58d。每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”，使曲粒吸收一定水分,以利菌丝逐渐向内生长。吃水方法:一边拌曲，一边向曲盘中喷洒无菌水,使曲粒表面润湿并微有发胀。培养3天后米粒逐渐成红色。观察记录色素产生的过程。培养5-7天后，固态发酵结束的红曲置于鼓风干燥箱内50-60鼓风干燥。第27页，共44页，编辑于2022年，星期五5成品质量检查

18、外观检查:曲粒表层光滑紫红,曲粒中心呈玉色,不得有空心和红心。曲粒断面菌丝均匀，具有红曲特有的曲香,不得有酸气等不正常气味。生物与理化项目检查:水分12%以下,容量(l00mL)44.546.5g,淀粉含量%,无细菌和其他霉菌污染。第28页，共44页，编辑于2022年，星期五四、注意事项1、浸米时用醋酸调PH至5.0-5.5左右，有利于发酵产品色价的提高。2、清洗时要至无混浊。3、蒸饭时，要熟过心，但不能结团。4、接种时注意无菌操作。5、注意控制过程中的温度。第29页，共44页，编辑于2022年，星期五一、实验原理 大米经红曲菌固体发酵后产生了一系列红曲菌的代谢产物,但这些产物的量非常少,大米

19、仍占固体发酵产物的绝大部分体积,为了降低运输成本,常常要对红曲菌的代谢产物进行提取和浓缩。红曲的代谢产物中既有水溶性组分,也有脂溶性组分,因此可用 80%的丙酮(丙酮:水=80：20)抽提。用 HCl 或 NaOH 处理可以将其中的酸溶性组分、碱溶性组分和中性组分分开。红曲色素的提取及红曲色价测定第30页，共44页，编辑于2022年，星期五一、实验原理 选择溶剂一般要注意以下四点：溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。溶剂不能与天然药物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。沸点宜适中，便于回收反复使用。红色素能溶于80%的乙醇中，可通过萃

20、取从米粒中提取出来,红曲色素在505nm 处有最大的吸收峰,可用分光光度计来测定。第31页，共44页，编辑于2022年，星期五二、实验器材与试剂1、旋转蒸发仪,分液漏斗，分光光度计,水浴锅,量筒等。2、酸乙酯,丙酮，80%乙醇等第32页，共44页，编辑于2022年，星期五 三三.实验步骤实验步骤12 红曲色素的提取红曲色价测定第33页，共44页，编辑于2022年，星期五一般提取方法：一般提取方法：萃取法组织培养法粉碎法压榨法酶反应法微生物发酵法人工合成法 红曲色素的提取红曲色素的提取第34页，共44页，编辑于2022年，星期五红曲色素的提取第35页，共44页，编辑于2022年，星期五具体步骤：

21、1、取、取 200g 固体发酵之红曲固体发酵之红曲,在植物粉碎机中将其粉碎；在植物粉碎机中将其粉碎；第36页，共44页，编辑于2022年，星期五2、将红曲粉放于、将红曲粉放于 500mL 三角瓶中三角瓶中,加入提取液加入提取液(丙酮丙酮:水水=80:20)200-300mL；第37页，共44页，编辑于2022年，星期五3、室温下摇动、室温下摇动10-15min左右，过滤；左右，过滤；4、在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮、在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮(尚有水分，尚有水分，60)；第38页，共44页，编辑于2022年，星期五5、用、用 l mol/L HCl 调残留液调残留液(约约 l00mL)的的pH至

22、至3.0,加至分加至分液漏斗中；加入液漏斗中；加入150ml的醋酸乙酯的醋酸乙酯（EtOAc)分次抽提。分次抽提。第39页，共44页，编辑于2022年，星期五图一：红曲代谢产物分离工艺流程图第一次第一次第二次第二次第三次第三次第四次第四次第40页，共44页，编辑于2022年，星期五分工：一组：配制提取液（丙酮：水一组：配制提取液（丙酮：水=80=80：2020），），2000ml2000ml；二组：配制二组：配制1mol/L HCl1mol/L HCl，1000ml 1000ml；三组：配制三组：配制2mol/L NaOH,500ml;2mol/L NaOH,500ml;四组：配制NaNa2

23、2CO3 3(pH=9),500ml;(pH=9),500ml;第41页，共44页，编辑于2022年，星期五具体方法：红曲色价测定：1 1、称取红曲米样品、称取红曲米样品 0.5g,0.5g,放入带有刻度的放入带有刻度的 lO mL lO mL 具塞试管具塞试管中；中；2 2、加入、加入 80%80%的乙醇的乙醇 8 mL,8 mL,摇匀摇匀,6060水浴保温萃取水浴保温萃取0.5h0.5h；3 3、取出冷却、取出冷却,用普通定性滤纸过滤入用普通定性滤纸过滤入lO mL lO mL 量筒中量筒中,用用 80%80%乙醇洗涤残渣乙醇洗涤残渣 2 2 次次,合并滤液合并滤液,并用并用 80%80%

24、乙醇定容至乙醇定容至10mL10mL；4 4、以、以 80%80%乙醇作对照乙醇作对照,在在 505nm 505nm 波长下波长下,用用 lcm lcm 比色皿测定样品的吸光度。比色皿测定样品的吸光度。5 5、计算、计算:红曲色价红曲色价(以以lglg样品计样品计)=A505lO2)=A505lO2注意：发酵后期注意：发酵后期,若红色素产生量多若红色素产生量多,可稀释后测定。可稀释后测定。第42页，共44页，编辑于2022年，星期五四、注意事项四、注意事项1.无水 Na2S04 可回收,反复使用,不要扔掉。2.2.有机溶剂易燃有机溶剂易燃,注意远离火源注意远离火源,原则上应在通风柜中进行。原则上应在通风柜中进行。第43页，共44页，编辑于2022年，星期五五、思考题:1 1为什么要用无水为什么要用无水 Na2S04 Na2S04 脱水脱水?2萃取后米粒中仍带有红色,是否会对结果产生影响?第44页，共44页，编辑于2022年，星期五