实验大肠菌群的检验幻灯片.ppt

《实验大肠菌群的检验幻灯片.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验大肠菌群的检验幻灯片.ppt（28页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、实验大肠菌群的检验第1页，共28页，编辑于2022年，星期五实验目的实验目的掌握鉴别大肠菌群的方法。掌握鉴别大肠菌群的方法。掌握以最大概率数法测定大肠菌群数量的掌握以最大概率数法测定大肠菌群数量的方法。方法。第2页，共28页，编辑于2022年，星期五实验原理实验原理 大肠菌群指一群能大肠菌群指一群能发酵乳糖发酵乳糖、产酸产气产酸产气、需氧和兼性厌氧需氧和兼性厌氧的的革兰氏阴性无芽孢杆菌革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有否被肠道致病菌污染。否被肠道致病菌污染

2、。食品中大肠菌群以食品中大肠菌群以100ml 检样内大肠菌群检样内大肠菌群最可能数（最可能数（MPN）表示。表示。第3页，共28页，编辑于2022年，星期五第4页，共28页，编辑于2022年，星期五实验设备实验设备恒温培养箱恒温培养箱：（：（361）显微镜显微镜培养皿培养皿 试管、移液管、三角烧瓶、小倒管试管、移液管、三角烧瓶、小倒管天平天平载玻片载玻片第5页，共28页，编辑于2022年，星期五实验试剂实验试剂乳糖胆盐发酵管：乳糖胆盐发酵管：20g蛋白胨、蛋白胨、5g 猪胆盐及猪胆盐及10g乳糖乳糖溶于溶于1L水中，校水中，校正正pH为为7.4，加，加25ml溴溴甲酚紫指示液甲酚紫指示液(0.

3、4 g/L)，分装分装每管每管20 ml,并放入一个小倒管，并放入一个小倒管，115高压灭菌高压灭菌20 min。伊红美蓝琼脂平板：伊红美蓝琼脂平板：10g蛋蛋白白陈陈、2gK2HPO4及及17g琼琼脂脂溶溶解解于于1L水水中中，校校正正pH至至7.1，分分装装于于锥锥形形瓶瓶内内，121高高压压灭灭菌菌15min。临临用用时时加加人人10g乳乳糖糖并并加加热热溶溶化化琼琼脂脂，冷冷至至5055。加加人人20mL伊伊红红溶溶液液（20g/L)和和10ML美美蓝蓝溶溶液液（6.5g/L）摇匀，倾注平板。摇匀，倾注平板。第6页，共28页，编辑于2022年，星期五乳糖发酵管：乳糖发酵管：将将20 g

4、蛋蛋白白陈陈和和10g乳乳糖糖溶溶于于1L水水中中，校校正正pH至至7.4，加加入入25mL溴溴甲甲酚酚紫紫指指示示液液(0.4g/L)，按按检检验验要要求求分分装装，并并放放人人一一个个小小倒倒管管，加加热热至至115高高压压灭灭菌菌15 min灭菌生理盐水灭菌生理盐水：0.9第7页，共28页，编辑于2022年，星期五革兰氏染色液：革兰氏染色液：结晶紫染色液：结晶紫染色液：1g结结晶晶紫紫溶溶于于20mL95%乙乙醇醇，与与80mL草草酸酸铵铵溶溶液（液（10g/L)混合，摇匀。混合，摇匀。革兰氏碘液：革兰氏碘液：1g碘碘与与2g碘碘化化钾钾混混合合后后，用用少少量量水水溶溶解解，稀稀释释至

5、至300 mL。沙黄复染液：沙黄复染液：0.25g沙沙黄黄溶溶于于10ml95%乙乙醇醇中中，然然后后用用90ml水水稀稀释，混匀。释，混匀。第8页，共28页，编辑于2022年，星期五实验内容与步骤实验内容与步骤1）检样稀释）检样稀释（无菌操作）无菌操作）将将25mL（或或g）检样置于含检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用800010000r/min的速度处理的速度处理1 min）制成制成1：10的均匀稀释液。的均匀稀释液。用用1mL灭灭菌菌吸吸管管吸吸取取1：10稀稀释释液液1mL，注注入入含含有

6、有9mL灭灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成菌生理盐水的试管内，混匀，制成1：100的稀释液。的稀释液。另另取取1mL灭灭菌菌试试管管，按按操操作作依依次次做做10倍倍递递增增稀稀释释液液，每稀释一次，换用一支每稀释一次，换用一支1 mL灭菌试管。灭菌试管。第9页，共28页，编辑于2022年，星期五 2）乳糖发酵实验）乳糖发酵实验 接接种种2mL待待检检样样品品于于乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管内内。接接种种3个个稀稀释释度度，每每一一稀稀释释度度接接种种3管管，置置（36土土1)温温箱箱内内培培养养（24士士2)h。如如所所有有乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管都都不不产产气气，则则可可报报告告为为大

7、大肠肠杆杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。第10页，共28页，编辑于2022年，星期五3）分离培养分离培养 将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（脂平板上，置（36士士1)恒温箱内培养恒温箱内培养18一一24 h。取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。实试验。第11页，共28页，编辑于2022年，星期五4）证实试验证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1一一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，个进行革兰氏染色，同时

8、接种乳糖发酵管，置（置（36士士1)恒温箱内培养（恒温箱内培养（24士士2)h，观察产观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。第12页，共28页，编辑于2022年，星期五实验报告实验报告 根根据据证证实实为为大大肠肠菌菌群群阳阳性性的的管管数数，查查MPN检检索索表表，报报告告每每100mL（或或g）大大肠肠菌群的菌群的MPN。第13页，共28页，编辑于2022年，星期五第14页，共28页，编辑于2022年，星期五第15页，共28页，编辑于2022年，星期五第16页，共28

9、页，编辑于2022年，星期五第17页，共28页，编辑于2022年，星期五注：注：本表采用本表采用3 3个稀释度：个稀释度：1 1ML(g)ML(g)，0.1mL(g0.1mL(g）和和0.01 0.01 mL mL(g)(g)。每稀释度每稀释度3 3管。管。表内所列检样量如改用表内所列检样量如改用1010mL(g)mL(g)，1mL(g1mL(g）和和0.1mL(g0.1mL(g）时，表内数字应相应降低时，表内数字应相应降低1010倍；如改用倍；如改用0.10.1ML(g),0.01ML(gML(g),0.01ML(g）和和0.0010.001mL(gmL(g）时，则表内数时，则表内数字应相应

10、增加字应相应增加1010倍，其余可类推。倍，其余可类推。第18页，共28页，编辑于2022年，星期五1.斜线法斜线法 2.曲线法曲线法 3.方格法方格法 4.放射法放射法 5.四格法四格法附附1：平板划线接种方法：平板划线接种方法第19页，共28页，编辑于2022年，星期五第20页，共28页，编辑于2022年，星期五第21页，共28页，编辑于2022年，星期五第22页，共28页，编辑于2022年，星期五附附2：革兰氏染色法操作步骤：革兰氏染色法操作步骤1、涂片涂片：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。2、染色染色：用草酸铵结晶紫染色：用草酸铵结晶紫染色1min,用

11、水冲洗。用水冲洗。3、媒染媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，用水冲去碘液。用水冲去碘液。4、乙醇脱色乙醇脱色：斜置载玻片于一烧杯上，滴加：斜置载玻片于一烧杯上，滴加95%乙醇，乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约0.5min）。）。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时

12、阴性菌被误染为阳性菌。脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。第23页，共28页，编辑于2022年，星期五5、复染复染：蕃红染液复染：蕃红染液复染1min,水洗。水洗。6、吸干并镜检吸干并镜检：若研究工作中要确证未知菌：若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作对照。染色作对照。第24页，共28页，编辑于2022年，星期五步骤：结果:阳性菌阳性菌紫色紫色 阴性菌阴性菌红色红色结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色蕃红复染涂片固定革兰氏染色法（革兰氏染色法（Gram Stain）第25页，共28页，编辑于2022年，星期五 细菌经细菌经结晶紫结晶紫初染染成

13、初染染成紫色紫色。革兰氏染色阳性菌革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，为空细胞壁肽聚糖层数多，为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为物不易从细胞内漏出，仍为紫色紫色。革兰氏染色阴性菌革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透层数少，为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经蕃红复染成再经蕃红复染成红色红色。第26页，共28页，编辑于2022年，星期五大肠杆菌革兰氏染色照片大肠杆菌革兰氏染色照片第27页，共28页，编辑于2022年，星期五思考题思考题1大大肠肠菌菌群群的的检检验验分分哪哪几几个个步步骤骤？各各有有何何作用？作用？2在在糖糖发发酵酵试试验验中中，若若发发现现发发酵酵倒倒管管内内存存在在极极微微小小的的气气泡泡，这这种种情情况况可可否否算算作作产产气阳性？气阳性？3造成本实验误差的主要原因有哪些？造成本实验误差的主要原因有哪些？第28页，共28页，编辑于2022年，星期五