脂肪干细胞体外培养PPT课件.ppt
《脂肪干细胞体外培养PPT课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《脂肪干细胞体外培养PPT课件.ppt(26页珍藏版)》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、关于脂肪干关于脂肪干细胞的体胞的体外培养外培养第一张,PPT共二十六页,创作于2022年6月脂肪干细胞生物学特性脂肪干细胞生物学特性l2001年,年,Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分离出一种多向分化干细胞,因其等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分离出一种多向分化干细胞,因其与骨髓间充质干细胞与骨髓间充质干细胞(BMSC)形态相似而称为脂肪间充质干细胞(形态相似而称为脂肪间充质干细胞(ASC)。l脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能方向分化的多分化潜能,是一种
2、理想的种子细胞。因脂肪干细胞具有分化为脂肪的是一种理想的种子细胞。因脂肪干细胞具有分化为脂肪的潜能,且其具有易获得性、可迅速扩增、不易衰老等特点,目前脂肪干细胞已成潜能,且其具有易获得性、可迅速扩增、不易衰老等特点,目前脂肪干细胞已成为脂肪组织工程中种子细胞的研究热点。为脂肪组织工程中种子细胞的研究热点。lZuk等认为,等认为,ASC可能由多种异源性细胞构成,其中包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑可能由多种异源性细胞构成,其中包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等肌细胞以及前体脂肪细胞等。现有。现有ASC主要由成纤维细胞以及来自间叶组织的细胞构主要由成纤维细胞以及来自间叶组织的细胞
3、构成,仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞成,仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。上述细胞在上述细胞在ASC中的含量甚低,不可能定向中的含量甚低,不可能定向培养分化为其他组织细胞,但进一步确认和识别真正的培养分化为其他组织细胞,但进一步确认和识别真正的ASC的表面蛋白及其基因仍是的表面蛋白及其基因仍是必要的。必要的。第二张,PPT共二十六页,创作于2022年6月脂肪来源干细胞脂肪来源干细胞第三张,PPT共二十六页,创作于2022年6月脂肪来源干细胞脂肪来源干细胞第四张,PPT共二十六页,创作于2022年6月脂肪来源干细胞的命名脂肪来源干细胞的命名脂肪来源干细胞(AdiposeDerivedStemCel
4、l,ADSC)脂肪来源间充质干细胞(AdiposeDerivedMsenchymalStemCell,AD-MSC(ASC)脂肪来源血管基质成分(StromalVascularFraction,SVF)富含大量的CD34+细胞,从脂肪组织直接获得富含一定量的CD34+细胞,SVF培养P0-P2不富含CD34+细胞,SVF培养P2之后第五张,PPT共二十六页,创作于2022年6月脂肪干细胞的鉴定脂肪干细胞的鉴定l在缺少分化刺激因子的条件下,在缺少分化刺激因子的条件下,ASC表面标志蛋白有表面标志蛋白有HLA-ABC、CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49、CD54、C
5、D55、CD59、CD105、CD146、CD166;l经过经过14d的诱导培养后的诱导培养后,ASC虽然发生了形态变化,表现出成脂细胞、成软骨细胞、成骨细虽然发生了形态变化,表现出成脂细胞、成软骨细胞、成骨细胞等分化的特征,但表面蛋白的表达却大致与未分化前一致,这些表面蛋白与胞等分化的特征,但表面蛋白的表达却大致与未分化前一致,这些表面蛋白与BMSC的表的表面蛋白很相似。面蛋白很相似。lASC和和BMSC均表达均表达CD13、CD29、CD44、CD105,均不表达,均不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR。虽然从分子标识上看。虽然从分子标识上看ASC和和BMSC具有相同的表面粘附
6、分子和受体分子,但两者仍有具有相同的表面粘附分子和受体分子,但两者仍有区别。区别。ASC表达表达CD49d,而不表达,而不表达CD106,BMSC则相反,造成这种区别的机制可能与细则相反,造成这种区别的机制可能与细胞所处的微环境及具体功能有关。胞所处的微环境及具体功能有关。l间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检测等免疫表间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用,但鉴定脂肪干细胞的最好方法是进行多系定向诱型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用,但鉴定脂肪干细胞的最好方法是进行多系定向诱导,并进行相
7、应检测以确定诱导成功。导,并进行相应检测以确定诱导成功。第六张,PPT共二十六页,创作于2022年6月脂肪干细胞的表面标记脂肪干细胞的表面标记a)a)粘附分子:粘附分子:ADASADAS细胞始终表达细胞始终表达tetraspantetraspan蛋白蛋白(CD9)(CD9)、整合素、整合素1(CD29)1(CD29)和和4(CD49 d)4(CD49 d);细胞;细胞间粘附分子间粘附分子1(ICAM1(ICAM1 1,CD54)CD54)、endoglin(cd102)endoglin(cd102)、血管细胞粘附分子、血管细胞粘附分子(VCAM(VCAM,CD106)CD106)及及活化的淋巴
8、细胞粘附分子活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM(ALCAM,CD166)CD166)。但不表达神经细胞粘附分子。但不表达神经细胞粘附分子(NCAM(NCAM,CD56)CD56)、细、细胞间粘附分子胞间粘附分子3(ICAM-33(ICAM-3,CD50)CD50)、整合素、整合素b(CD11b)b(CD11b)和和2(CD18)2(CD18)及内皮选择蛋白及内皮选择蛋白(E(Eselectinselectin,CD62)CD62);b)b)分子受体:可表达透明质酸盐分子受体:可表达透明质酸盐(CD44)(CD44)和转铁蛋白和转铁蛋白(CD71)(CD71)的受体;的受体;c)c)细胞外基质蛋
9、白和糖蛋白:细胞外基质蛋白和糖蛋白:ADASADAS细胞能生成细胞能生成和型胶原、骨桥蛋白、和型胶原、骨桥蛋白、ostenectinostenectin、Thy-1(CD90)Thy-1(CD90)和和MUC-18(CD146)MUC-18(CD146);d)d)肌蛋白:能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白;肌蛋白:能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白;e)e)造血细胞标记:不表达造血细胞标造血细胞标记:不表达造血细胞标志物志物CD14CD14、CD31CD31或或CD45CD45;f)f)补体调节蛋白:确定能表达衰变加速因子补体调节蛋白:确定能表达衰变加速因子(CD55)(CD55)和补
10、体蛋白;和补体蛋白;g)g)组织相容性抗原:表达类组织相容性蛋白组织相容性抗原:表达类组织相容性蛋白HLA-ABCHLA-ABC,而不表达类蛋白,而不表达类蛋白HLA-DRHLA-DR。不同的试验结果结果有不同,但这种差异可能是在细胞分离、培养、纯正化方法不不同的试验结果结果有不同,但这种差异可能是在细胞分离、培养、纯正化方法不同,以及免疫组化技术和流式细胞仪敏感性的不同而造成。总的来说,同,以及免疫组化技术和流式细胞仪敏感性的不同而造成。总的来说,PALPAL细胞的细胞的免疫表型与已经报道的骨髓间充质干细胞是相似的。免疫表型与已经报道的骨髓间充质干细胞是相似的。第七张,PPT共二十六页,创作
11、于2022年6月脂肪干细胞的体外培养 脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低,要利用脂肪干细胞就必须进行体外分离培养扩脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低,要利用脂肪干细胞就必须进行体外分离培养扩增。常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心,倾去上层脂肪及上清,获得基质血管层,增。常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心,倾去上层脂肪及上清,获得基质血管层,将其收集到培养瓶中培养,除去未贴壁的红细胞和残渣,剩余的细胞群体称为加工过的将其收集到培养瓶中培养,除去未贴壁的红细胞和残渣,剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物。原代培养的细胞中贴壁的细胞较少,细胞生长至融合后传代,传代后的细脂肪吸取物。原代培养的细胞中贴壁的
12、细胞较少,细胞生长至融合后传代,传代后的细胞称为脂肪干细胞。平均每胞称为脂肪干细胞。平均每300mL300mL脂肪组织可获得脂肪组织可获得2102108 86106108 8 个这样的细胞。个这样的细胞。体外培养条件下,体外培养条件下,ASCASC的培养不像的培养不像BMSCBMSC对培养基中胎牛血清的来源和质量对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求,有严格要求,DMEMDMEM、MEMMEM、RPMI1640RPMI1640是是ASCASC的常用培养基。一般只添加体积分的常用培养基。一般只添加体积分数为数为1010的胎牛血清,并且血清无生产批号限制。在传代培养中,平均倍增时的胎牛血清,并且
13、血清无生产批号限制。在传代培养中,平均倍增时间为间为60h60h。并表现低水平衰老,。并表现低水平衰老,1 1代时细胞没有出现衰老现象,代时细胞没有出现衰老现象,1010代时少于代时少于5 5细细胞出现衰老,胞出现衰老,1515代时衰老细胞比例仍低于代时衰老细胞比例仍低于1515,这表明脂肪,这表明脂肪ASCASC体外扩增能力很体外扩增能力很强,传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。强,传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。第八张,PPT共二十六页,创作于2022年6月脂肪干细胞成脂分化lASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞,长在特定促进因素下可分化为脂肪细胞,长期期培养仍可维持此种分化能力
14、培养仍可维持此种分化能力。l脂肪细胞分化过程大致如下:脂肪细胞分化过程大致如下:(1)脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化,形成脂肪母细胞(一种尚未出现脂滴的梭形细胞);()脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化,形成脂肪母细胞(一种尚未出现脂滴的梭形细胞);(2)脂)脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖,形成前体脂肪细胞(此时细胞刚开始出现脂滴);肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖,形成前体脂肪细胞(此时细胞刚开始出现脂滴);(3)前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖和一系列基因表达的变化,形成不成熟脂肪细)前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖和一系列基因表达的变化,形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞(内含大量小脂
15、滴);(胞或多室脂肪细胞(内含大量小脂滴);(4)多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积,)多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积,小脂滴逐渐汇集成一个大脂滴充满脂肪细胞的大部分,形成成熟脂肪细胞或单室脂小脂滴逐渐汇集成一个大脂滴充满脂肪细胞的大部分,形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞,成为成熟的脂肪细胞。肪细胞,成为成熟的脂肪细胞。l目前普遍认为脂肪母细胞是脂肪干细胞接受相关刺激,如寒冷、激素、生物活性因子、体外目前普遍认为脂肪母细胞是脂肪干细胞接受相关刺激,如寒冷、激素、生物活性因子、体外实验性诱导剂刺激后,由多能变为单能定向分化的起始阶段。实验性诱导剂刺激后,由多能变为单能定向分化的起始阶段。l前脂
16、肪细胞的增殖与分化的关系为:生长停顿前脂肪细胞的增殖与分化的关系为:生长停顿生长再续生长再续细胞分化。其中生长停顿是必要细胞分化。其中生长停顿是必要的第一步,由单层细胞形成产生的接触抑制或是药物的作用、营养因子缺乏引起。的第一步,由单层细胞形成产生的接触抑制或是药物的作用、营养因子缺乏引起。第九张,PPT共二十六页,创作于2022年6月脂肪干细胞成脂分化v目前已鉴定出的对前脂肪细胞增殖和分化有直接影响的转录因子主要有:过氧化物酶增殖体(PPARs)在前脂肪细胞的成脂分化中起主要调控作用;CCAT增强子结合蛋白(CEBP)与ADD-1可启动和维持前脂肪细胞向脂肪方向分化,PPARs与配体结合激活
17、脂肪发育过程中关键基因的转录;脂肪酸转运蛋白(FA)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)及其受体在此阶段也有表达。第十张,PPT共二十六页,创作于2022年6月脂肪干细胞成脂分化v脂肪细胞分化过程中,其细胞形态、膜表面蛋白、胞质内容物和基因表达均发生了极大的改变。可以根据这些变化来判定脂肪细胞的分化状态。(1)细胞形态。脂肪细胞贴壁后最初为小圆形,核浆比例增大,4d后即可观察到细胞渐成梭形,7d后梭形细胞扩大增殖,开始积聚脂肪颗粒,9d时可观察到细胞由梭形渐变成椭圆形,积聚有脂肪颗粒的细胞增多。到2周时分化成多脂滴或单脂滴的细胞。(2)脂肪细胞内的脂肪含量。对前脂肪细胞分化结果的定性研究一般采
18、用油红O或甲烯兰染色,一般来说,前脂肪细胞在培养的前3d即开始有脂肪的积聚,1周后积聚量明显增高,2周后达到高峰。(3)脂肪细胞分化不同时期的标志物。细胞开始分化后,随时间的推移出现PobmRNA 以及 LPLmRNA这两种转化早期的标志物,其中前者是体内及体外脂肪状态的独特标志物,此时如果外界条件改变,解除了这种生长停顿,则前脂肪细胞的早期标志物消失,重新出现生长和增殖,DNA合成增加。否则,将出现磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA这个晚期标志物,并最终变成脂肪细胞。除了上述分化标志外,脂肪细胞在分化过程中还表达其他的标志物,如早期标志物FA transport,中期标志物FAS、HSL、ACC
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 脂肪 干细胞 体外 培养 PPT 课件
限制150内