下游加工过程概论.pptx

《下游加工过程概论.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《下游加工过程概论.pptx（27页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、本课程主要内容本课程主要内容13 13 生物下游加工过程概论生物下游加工过程概论14 14 发酵液的预处理和固液分离方法发酵液的预处理和固液分离方法15 15 细胞破碎细胞破碎16 16 沉淀法沉淀法17 17 膜分离技术膜分离技术18 18 溶剂萃取法溶剂萃取法19 19 双水相萃取双水相萃取20 20 吸附法吸附法2121离子交换法离子交换法22 22 液相色谱法液相色谱法23 23 亲和分离技术亲和分离技术24 24 结晶法结晶法25 25 基因工程药物生产实例基因工程药物生产实例 第1页/共27页主要参考书主要参考书新编生物工艺学新编生物工艺学，俞俊棠主编，化工出版，俞俊棠主编，化工出

2、版社，社，20032003生物分离工程生物分离工程（第二版），孙彦编著，化（第二版），孙彦编著，化工出版社，工出版社，20052005生物工程下游技术生物工程下游技术（第二版），刘国诠主（第二版），刘国诠主编，化工出版社，编，化工出版社，20032003生化分离工程生化分离工程严希康严希康 编著，化工业出版社编著，化工业出版社生物分离原理与技术生物分离原理与技术欧阳平凯欧阳平凯 编著，化工业出版社编著，化工业出版社第2页/共27页成绩成绩平时成绩占平时成绩占30%30%，包括平时作业、课堂，包括平时作业、课堂(提问提问,点名点名)等。等。期末考试占期末考试占70%70%，闭卷考试方法总成绩，闭

3、卷考试方法总成绩:平时平时(30%)+(30%)+期末期末(70%)(70%)。第3页/共27页13.1下游加工过程在生物技术中下游加工过程在生物技术中的地位的地位下游加工过程是生物工程的一个下游加工过程是生物工程的一个重要重要组成部分组成部分.发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程化、富集生物产品的过程称为称为下游加工过程下游加工过程(downstream processing)(downstream processing)它由一些化学工程的单元操作组成它由一些化学

4、工程的单元操作组成,但由于生物但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作在一般化学工业中应用较少。元操作在一般化学工业中应用较少。第4页/共27页在发酵产品的生产中，分离和精制过程所需的费用占成本的很大部分。在发酵产品的生产中，分离和精制过程所需的费用占成本的很大部分。对传统发酵工业对传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部分占整个工厂投资费，分离和精制部分占整个工厂投资费用的用的6060，对重组对重组DNADNA生产蛋白质、精制的费用可占整个生产费用的生产蛋白质、精制的费用可占整个生产费用的8080一一9

5、090。第5页/共27页从第一个基因工程药物，人胰岛素在从第一个基因工程药物，人胰岛素在19821982年投年投产后，人们逐渐认识到下游加工过程的落后有产后，人们逐渐认识到下游加工过程的落后有可能会阻碍生物技术的发展，特别是当有其他可能会阻碍生物技术的发展，特别是当有其他生产方法与其相竞争时。生产方法与其相竞争时。英国政府工业部，于英国政府工业部，于19831983年发起生物分离计划年发起生物分离计划(BIOSEP)(BIOSEP)，专门研究下游加工过程，有，专门研究下游加工过程，有7 7个国家、个国家、5050家公司参加。家公司参加。19871987年英国化学工业会召开了年英国化学工业会召开

6、了专门讨论下游加工过程的国际会议。专门讨论下游加工过程的国际会议。美国美国United Engineering Foundation United Engineering Foundation 从从19811981年开始连续召开了生物产品回收的会议。年开始连续召开了生物产品回收的会议。我国也于我国也于19891989年在济南召开了一次专门会议。年在济南召开了一次专门会议。人们逐渐取得了共识；现代生物技术的发展是人们逐渐取得了共识；现代生物技术的发展是和下游技术的进步紧密相关的。和下游技术的进步紧密相关的。第6页/共27页13.2传统生化产品和基因工程产品回收方法的比传统生化产品和基因工程产品回

7、收方法的比较较1.生化产品的类型按用途分类按用途分类 食品类。食品类。保健品类。保健品类。医用类产品（医用类产品（19981998年，年，719719种）。抗生素种）。抗生素112112种种 农业用产品（农业用产品（19981998年，年，3636种）。种）。生物试剂类（生物试剂类（19981998年，年，975975种）。种）。按分子量大小分类按分子量大小分类 Mass 1000DMass 1000DMass 1000D：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类按发酵时目的产物所在的位置分类按发酵时目的产物所在的位置分类 cellcell内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、

8、重组蛋白质内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 cellcell外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（-淀粉酶）等淀粉酶）等第7页/共27页2.传统生化产品和基因工程产品在提取和精制上的差异传统生化产品都为小分子传统生化产品都为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高、提取方法较工业用酶除外，但它们对纯度要求不高、提取方法较简单简单)其理化性能其理化性能(如平衡关系等如平衡关系等)数据都为已知，因此放大比较有根据；基因数据都为已知，因此放大比较有根据；基因工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭

9、经验。第8页/共27页由于第一代基因工程产品都以由于第一代基因工程产品都以E.coliE.coli作为宿主，作为宿主，表达产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细表达产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞内物质释放出来，给提取增加了很多困难；胞内物质释放出来，给提取增加了很多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定一般大分子较小分子不稳定(易失活，如对剪切易失活，如对剪切力力)，故提取较困难。，故提取较困难。大分子大分子(蛋白质蛋白质)的分离主要困难在于杂蛋白的的分离主要困难在于杂蛋白的分离，由于蛋白质都内氨基酸所构成，所以性分

10、离，由于蛋白质都内氨基酸所构成，所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法，质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法，如色谱分离等。如色谱分离等。第9页/共27页3.3.分离效率的评价分离效率的评价浓缩率（富积率浓缩率（富积率，concentrationfactor）原料(Rawmaterial)分离器产品(Product)FW,VW,cT,W,cX,W废液(Wastefluid)意义：1）如mT 1，则目标产物得到富积；2）如mT=mX，则目标产物未得到分离纯化。第10页/共27页分分离离因因子子(separativefactor)，或分分离离系系数数(separativecoefficie

11、nt)意义：A、目标产物浓度，杂质浓度，则分离因子大，分离效率；B、=1时，则未分离。故在分离为主要目的时,第11页/共27页回收率回收率(recovery)：纯化因子纯化因子(purificationfactor)对于具有生物活性的蛋白质或酶，常常用分离前后目标产物的比活对于具有生物活性的蛋白质或酶，常常用分离前后目标产物的比活 A in A in U/mgU/mg之比表示目标产物的分离纯化程度之比表示目标产物的分离纯化程度，第12页/共27页13.3 13.3 生化产品及加工过程的特点生化产品及加工过程的特点1)1)应用面广。应用面广。医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等医药卫生、

12、环保、动植物生长调节、食品和试剂等2)2)种类繁多。分子量种类繁多。分子量X0X0X000000X000000，结构功能复杂，生物活性各异。，结构功能复杂，生物活性各异。3)3)目的产物在初始物料中的含量低。目的产物在初始物料中的含量低。青霉素（青霉素（4.2%4.2%）、庆大霉素（）、庆大霉素（0.2%0.2%）、干扰素（）、干扰素（50ug/ml50ug/ml）。）。第13页/共27页4)产品价格与产物浓度呈反比产品价格与产物浓度呈反比原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离过程成本越大。第14页/共27页5)5)初始物料成分复杂初始物料成分复杂,常需多个步骤常需多个步骤,产品总收率产品

13、总收率低。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、低。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。机盐等。第15页/共27页6)6)生物活性物质的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、生物活性物质的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、pHpH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。7)7)产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原 -青霉噻唑蛋白必须控制青霉噻唑蛋白必须控制RI

14、ARIA值（放射免疫测定）小于值（放射免疫测定）小于100100（1.5*10-61.5*10-6），蛋白类药物（杂质），蛋白类药物（杂质 2%2%）、重组胰岛素中）、重组胰岛素中杂蛋白小于杂蛋白小于0.01%0.01%。第16页/共27页13.413.4生物技术下游加工过程的一般流程和生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作单元操作 动、植物组织、体液等胞外产物提取发酵液预处理c分离c破碎碎片分离初步纯化精制制成品培养液 加加 热热 沉沉 淀淀 匀匀 化化 离离 心心 沉沉 淀淀 分分子子筛筛 无菌过滤无菌过滤酶反应液 调 pH 离 心 超 声 萃 取 吸 附 离 子 超 滤 絮 凝 过 滤

15、 胞 溶 过 滤 萃 取 亲 和 冻 干 错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤 吸 附 喷 干 憎 水 结 晶 电 泳发酵液预处理细胞破碎初步纯化高度纯化第17页/共27页13.6 13.6 纯化方法选择的基本原则纯化方法选择的基本原则1)1)尽可能简单、低耗、高效、快速。尽可能简单、低耗、高效、快速。反面例子反面例子 -中药现代化、超临界萃取；中药现代化、超临界萃取；正面例子正面例子2)2)分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。A)A)分分离离步步骤骤越越多多，回回收收率率越越低低；如如Y Y1010 =0.950.951010 =0.630.63，Y Y5 5

16、=0.95=0.955 5=0.77=0.77 B)B)分分离离步步骤骤多多，设设备备投投入入大大，人人员员物物资资消消耗耗大大，生生产周期长产周期长第18页/共27页3)3)避免相同原理的分离技术多次重复出现避免相同原理的分离技术多次重复出现 分分子子筛筛和和超超滤滤技技术术按按分分子子量量大大小小分分离离，重重复应用两次以上，意义就不大了。复应用两次以上，意义就不大了。4)4)尽量减少新化合物进入待分离的溶液。尽量减少新化合物进入待分离的溶液。A)A)引引起起新新的的化化学学污污染染；B)B)蛋蛋白白质质的的变变性性失失活活5)5)合理的分离步骤次序。合理的分离步骤次序。原原则则是是：先先

17、低低选选择择性性，后后高高选选择择性性；先先高高通通量量，后后低低通通量量；先先粗粗分分，后后精精分分；先先低低成本，后高成本。成本，后高成本。第19页/共27页13.7 13.7 纯化流程设计前应了解的信息纯化流程设计前应了解的信息要掌握的产物物化性质，主要包括：要掌握的产物物化性质，主要包括：(1)(1)、溶溶解解度度及及影影响响因因素素，包包括括温温度度、pHpH值值、有有机机溶溶剂和盐等；剂和盐等；(2)(2)、分分子子量量和和分分子子形形状状。对对于于高高分分子子物物质质非非常常有有意意义；义；(3)(3)、沸沸点点和和蒸蒸汽汽压压。对对于于热热稳稳定定的的小小分分子子物物质质非非常

18、常有意义；有意义；(4)(4)、极性大小；、极性大小；(5)(5)、分子电荷及影响因素，包括、分子电荷及影响因素，包括pHpH值和盐等；值和盐等；(6)(6)、功功能能团团。功功能能团团为为萃萃取取剂剂和和特特异异性性吸吸附附的的选选择择提供依据；提供依据；(7)(7)、免疫原性。设计亲和色谱；、免疫原性。设计亲和色谱；(8)(8)、稳稳定定性性及及其其影影响响因因素素，包包括括温温度度、pHpH值值、毒毒性性试剂等试剂等(如青霉素低如青霉素低pHpH不稳定不稳定)；(9)(9)、分分子子的的淌淌度度及及影影响响因因素素，包包括括pHpH值值、离离子子强强度度和盐等；和盐等；(10)(10)、

19、等电点、等电点pIpI；第20页/共27页成品规格（或产品质量标准）成品规格（或产品质量标准）表1.3五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页）指标名称指标含量（C37H49N7O9S）97.0-103.0比旋光度-25-29吸收值比A(280nm):A(288nm)=1.12-1.22氨基酸各氨基酸之比为1干燥失重，%0.5进料的组成和物性进料的组成和物性(1)1)、目的产物的浓度。高？低？、目的产物的浓度。高？低？(2)(2)、物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。、物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。(3)(3)、目的产物的定位。是胞内还是胞外？、目的产物的定位。

20、是胞内还是胞外？(4)(4)、菌种的种类和形态。、菌种的种类和形态。(5)(5)、微生物的含量和发酵液的黏度。、微生物的含量和发酵液的黏度。第21页/共27页生产规模生产规模 危害性危害性(1)(1)离离心心产产生生的的气气溶溶胶胶、发发酵酵产产生生的的废废气气、干干燥燥产产生生的的粉粉尘等。尘等。(2)(2)目目的的产产物物本本身身的的危危害害性性；抗抗肿肿瘤瘤代代谢谢类类药药物物，类类固固醇醇类抗生素，激素类药物等。类抗生素，激素类药物等。(3)(3)试剂危害。萃取试剂试剂危害。萃取试剂CClCCl4 4、甲苯、苯、二甲苯、甲苯、苯、二甲苯、CNBrCNBr。(4)(4)微微生生物物的的危

21、危害害。重重组组DNADNA工工程程菌菌不不能能任任意意排排放放。这这一一菌菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。分批分离还是连续纯化分批分离还是连续纯化第22页/共27页13.813.8非蛋白质类杂质的去除非蛋白质类杂质的去除在纯化过程中，三种可能存在的非蛋白质类杂质需要特别注意，它们是在纯化过程中，三种可能存在的非蛋白质类杂质需要特别注意，它们是DNADNA、热原质和病毒。、热原质和病毒。DNADNA的除去的除去热原的除去：细菌内毒素热原的除去：细菌内毒素病毒的除去病毒的除去第23页/共27页13.913.9目标蛋白质的表征和分析方法目标蛋

22、白质的表征和分析方法蛋白质在分离、纯化过程个易发生变化，因此得到的产品应与已知标准品蛋白质在分离、纯化过程个易发生变化，因此得到的产品应与已知标准品对照，证明为同一物质并检查其纯度。为达此目的，仅用一种分析方法是对照，证明为同一物质并检查其纯度。为达此目的，仅用一种分析方法是不够的，常需用几种方法。不够的，常需用几种方法。HPLCHPLC选用基于个同原理的两种层析系统选用基于个同原理的两种层析系统(如反相层析和离子交换层析如反相层析和离子交换层析)，如只得到单个对称峰则表明纯度较高；如只得到单个对称峰则表明纯度较高；聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PALE)(PALE)和等电聚焦；和等电

23、聚焦；顺序分列顺序分列N N端和端和C C端顺序分析可用来表征蛋白质：端顺序分析可用来表征蛋白质：其他分析，如氨基酸分析、肽图、免疫化学分析等可进一步提供产品纯其他分析，如氨基酸分析、肽图、免疫化学分析等可进一步提供产品纯度达到均质度达到均质(homogeneity)(homogeneity)和标准品一致的证明。和标准品一致的证明。第24页/共27页13.10 13.10 发展趋向发展趋向操作集成化操作集成化方法集成化方法集成化大分子与小分子分离方法的相互渗透大分子与小分子分离方法的相互渗透亲和技术的推广使用和亲和配基的人工合成亲和技术的推广使用和亲和配基的人工合成优质亲和层析介质的开发优质亲和层析介质的开发基因工程对下游过程的影响基因工程对下游过程的影响发酵与提取相耦合发酵与提取相耦合第25页/共27页思考题下游加工技术的定义。下游加工过程的特点。浓缩率，分离因子，回收率，纯化因子的概念及表达式。第26页/共27页谢谢大家观赏！第27页/共27页