现代分子生物研究方法.pptx

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1、分子生物学从20世纪中叶开始高速发展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作：DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。第1页/共73页跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等3个环节。第2页/共73页5

2、1 重组DNA技术史上的重大事件半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，主要有3大成就:第一，解决了遗传的物质基础问题基因的分子载体是DNA;第二，DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题;第三，“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。第3页/共73页DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特定碱基序列

3、位点切开DNA。1972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别GAAUC序列，将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。第4页/共73页他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此“粘合”起来。此后，大量类似于EroRl但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。第5页/共73页第6页/共73页第7页/共73页52 DNA操作技术521 核酸的凝胶电泳1基本原理 生物大分子在一定pH

4、条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。第8页/共73页在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的

5、电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。第9页/共73页2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。第10页/共73页琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为11000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离1-6bp的DNA小片段，而若要分离1000bp的DNA片段，就要

6、用3%的聚丙烯酰胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%1.0%)的琼脂糖凝胶。第11页/共73页第12页/共73页在凝胶电泳中，加入适量嗅化乙锭(ethidium bromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测灵敏快捷，DNA带中含0.05g的微量DNA，可以清晰地检测出来。EB能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间(图5-4)，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA分子能吸收EB并发出荧光。在

7、适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。第13页/共73页5.2.2 核酸的分子杂交将特定的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段（互补）就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。第14页/共73页在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细

8、管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地吸印上去的，因此，核酸杂交也被称为DNA印迹杂交。由于该方法是EMSouthern于1975年首先设计出来的，所以又叫做Southern blotting。杂交中常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。第15页/共73页核酸分子杂交包括两个步骤：第一，将样品转移到滤膜（印迹转移）;第二，将滤膜与DNA或RNA探针进行杂交。具体步骤：1、转移。2、在80下烘烤12h或用紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上。3、放入探针溶液中进行核酸杂交。一旦与滤膜上的单链DNA杂交之后，就很难再解链。4、用

9、漂洗法去掉没有杂交上的探针分子。放射性同位素标记的探针可检测2ng；为了安全，我们用DIG（地高辛）标记探针，荧光法检测杂交信号。第16页/共73页第17页/共73页基因组DNA被限制性内切酶酶切为DNA片段；各片段经电泳后在凝胶分为条带；（c）中由下到上是：玻璃板、一层滤纸、凝胶、滤膜、很多层滤纸、玻璃板、重物。通过毛细管作用将凝胶上的DNA条带原封不动地吸印到滤膜上去。（d）在80下烘烤12h或用紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上并形成单链。(e)滤膜放入带标记的DNA或RNA核酸探针溶液中进行核酸杂交。第18页/共73页523 细菌转化 细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了外源DN

10、A导致性状特征发生遗传改变的生命过程。大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。将快速生长中的大肠杆菌置于经低温(0)预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀(形成原生质球)，并与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。立即将该体系转移到42下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。发生了遗传改变的菌株带着变异而遗传。第19页/共73页524 核苷酸序列分析仪器分析发展很快。如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。下面介绍测序的基本原理。第20页/共73页第21页/共73页525 基因扩增 聚合酶链式反应

11、，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。第22页/共73页PCR技术的原理首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动(引导)新链的合成，所以，新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。第23页/共73页PCR反应的全过程DNA解链(变性)、引物与模板DNA

12、相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。第24页/共73页53 基因克隆的主要载体系统531 质粒DNA及其分离纯化细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成分，质粒都是由环形双链DNA组成的复制子（有少量线性质粒、RNA质粒报道）。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。第25页/共73页质粒用作基因克隆的载体分子，获得大量纯化的质粒DNA分子

13、很重要。寄主细胞的裂解是分离质粒DNA的关键步骤，加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠(SDS)来促使大肠杆菌细胞裂解。细胞裂解反应需要相当温和，同时实验操作又十分谨慎仔细，这样，绝大部分的染色体DNA分子都将以高分子量的形式释放出来，可以用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到高纯度的质粒DNA。第26页/共73页5311氯化铅密度梯度离心法质粒DNA一般仅占细胞总DNA的l%2%左右，而且其化学结构与寄主染色体DNA之间并没有什么差别，所以，质粒DNA的纯化须从两者高级结构上的差异寻找依据。在细胞裂解及DNA分离的过程中，大分子质量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒D

14、NA则由于其分子量较小、结构紧密，大部分仍能保持完整的环状结构。第27页/共73页方法：将含有EtBr的CsCl溶液加到大肠杆菌裂解液中，EtBr分子便会通过嵌入作用而结合到DNA链上，导致双螺旋结构发生解旋反应。大肠杆菌染色体DNA片段具有游离的末端而易于解旋，会结合大量的EtBr分子。共价闭合环状的DNA分子质粒，只能发生有限的解旋反应，限制了EtBr分子的结合数量，染色体DNA片段比质粒DNA结合更多的EtBr分子。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越多，其密度也就越低。因此，在EtBr达到饱和浓度的条件下，质粒DNA就要比线性的染色体DNA片段具有更高的密度。通过氯化铯

15、密度梯度离心之后，它们就会被平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA的目的。第28页/共73页第29页/共73页5312 碱变性法在pH值介于12.012.5的条件下加热DNA溶液，线性DNA会被变性，而闭合环状质粒DNA则不会被变性，尽管在这样的条件下连接DNA互补链之间的氢键也会断开，但由于闭合环状质粒DNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。与此相反，线性DNA的两条链则会完全分开。若用制冷或恢复中性的方法处理DNA混合物，质粒DNA能迅速而准确地复性，但随机断裂产生的线性染色体DNA分子，彼此已经分离的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形

16、成网状结构，与变性的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来。可以用酒精沉淀法收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。这目前最流行的方法。第30页/共73页532 重要的大肠杆菌质粒载体5321pSC101质粒载体pSC101是低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝。其分子大小为9.09 kb，编码有一个四环素抗性基因(tetr)。该质粒具有EcoRI、Hin d、Bam H I、Sal I、Xho I、Pvu 以及Sma I等7种限制性核酸内切酶的单切割位点，在Hin d、Bam H I和 Sal I 等3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活。第31页/共73页pSClO1

17、质粒具有可插人外源DNA的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，还具有四环素抗性的强选择记号，便于筛选。因此，它第一个被选为真核基因的克隆载体。这个质粒载体有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSClOl DNA，其产量就要比其他质粒载体低得多。第32页/共73页5322 pBR322质粒载体为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的强选择记号，又具有低分子质量、高拷贝以及外源DNA插入不影响复制功能的多种限制性核酸内切酶单切割位点等优点的新的质粒载体。目前，在基因克隆中广泛使用的pBR322质粒，就是按这种设想构建的一种大肠杆菌

18、质粒载体。第33页/共73页pBR322质粒是由3个不同来源的部分组成的:含有氨卡青霉素抗性基因（ampr)、四环素抗性基因(tetr)和DNA复制起点(ori)(图5-22)。pBR322质粒载体较小,其长度为4363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段较大（6-8kb）的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。第34页/共73页pBR322质粒载体具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号，方便选择。例如，将外源DNA克隆在Bam H I位点上，将这样的重组质粒转化到野生型大肠杆菌细胞中，并涂布在含有氨卡青霉素的选择性培养基平板上，那么存活下来的菌落都将具有Ampr的表型，它们也必定是获得

19、了编码有这种抗性基因的转化子。第三个优点是具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积10003000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。第35页/共73页533 噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名叫作bacteriophage，来源于希腊文“phagos”，系指吞噬之意。如同质粒分子一样，噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA片段，是一种良好的基因克隆载体。作为细菌寄生物的噬菌体，它可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，这是因为大多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖

20、。第36页/共73页噬菌体有两种类型：1、溶菌周期（烈性噬菌体）：噬菌体将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。2、溶源生长周期（温和噬菌体）：在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA被整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。第37页/共73页以噬菌体DNA分子作载体，克隆含有目的基因的外源DNA片段，只要不导致重要的噬菌体基因失活，这种重组的噬菌体DNA感染了寄主细胞之后，插入的外源DNA片段便会随着噬菌体DNA分子一道增殖。可按照类似于制备质粒DNA的方法，分离到大量的重组体噬菌体DNA，实现克隆基因的扩增。第38页/共73页噬菌体的

21、分子为48.5kb，是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的噬菌体基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的调控（必需基因）;另一部分基因则被称为非必需基因；当它们被外源基因取代之后，不影响噬菌体的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重组噬菌体DNA，可以随寄主细胞一起被复制和增殖。第39页/共73页在噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列（粘性末端）。当噬菌体的线性DNA分子注入到被感染寄主细胞内时，会通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5-P和3-OH基团封闭起来。这种

22、粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点cohesive-end site，粘性末端位点)。第40页/共73页野生型的噬菌体DNA具有太多的常用限制性核酸内切酶切割位点（5个Eco R I酶切位点和7个Hin d 酶切位点）。这使它不适于用作基因克隆的载体，想办法从野生型噬菌体基因组DNA上消去一些多余的酶切位点并切除非必要区段，将它改造成适用于基因克隆的载体。介绍改造后的两种类型：1插入型载体 外源DNA克隆到插入型载体分子上，就会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。根据插入失活效应的特异性，可分为以下两种亚型。第41页/共73页(1)免疫功能失活插入型载体：载体的基因组中

23、有一段免疫区，其中带有一两种限制性内切酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，阻碍其进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插人的重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。这种形态学上的差异，为分离重组体分子提供了方便的标志。第42页/共73页(2)-半乳糖苷酶失活插入型载体：这种载体的基因组中含有大肠杆菌的lacZ区段，编码-半乳糖苷酶。由这种载体感染大肠杆菌的lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，但在克隆过程中，如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，那么由

24、这种重组体感染的lac-指示菌，由于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。第43页/共73页2替换型载体又叫作取代型载体（substitution vector)，是在噬菌体基础上改建的，在其中央部分有一个可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段。当外源DNA插人此类载体时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。第44页/共73页在NM781替换型载体中，可取代的Eco R I片段，编码有一个supE基因，这种NM781噬菌体感染细胞后，其lacZ基因的突变琥珀被抑制，因此能在X-gal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。但是，如果这个具有su

25、pE基因的Eco R I片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。第45页/共73页534 柯斯质粒载体“Cosmid”一词是由英文“cos site-carring plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点的质粒。柯斯质粒是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒载体pHC79质粒兼具了噬菌体载体和pBR322质粒载体两方面的优点，其克隆能力为3145kb，而且能够被包装成为具有感染能力的噬菌体颗粒。第46页/共73页柯斯质粒载体的特点第一，具有噬菌体的特性。在克隆了合适长度的外源DNA，

26、并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效转染对噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的柯斯质粒DNA分子，能按照噬菌体DNA同样的方式环化。第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此能像质粒DNA一样在寄主细胞内进行复制，并且能在氯霉素作用下，获得进一步扩增。第47页/共73页第三，具有抗菌素抗性基因，可供重组体分子选择。第四，具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和cos位点等三个组成部分，其分子较小，一般只有57kb左右。因此，可以插入到载体上并能被包装成噬菌体颗粒的最大外源DNA片段，克隆极限可达45kb左右。第48页/共73页

27、54 基因的分离与鉴定生命科学各个研究，“克隆”（clone)被广泛使用。通常克隆是无性繁殖。在不同层面的含义：在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体；从同一受精卵分裂而来的单卵双生子属于同一克隆。在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子生物学上，将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。第49页/共73页基因克隆包含待研究的目的基因的分离和鉴定两个主要内容，整个过程包括如下4个基本步骤:(1)用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分子的片段化;(2)外源DN

28、A片段与载体分子的体外连接反应;(3)将人工重组的DNA分子导人它们能够进行正常复制的寄主细胞;(4)重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。第50页/共73页54l DNA片段的产生与分离从实验材料中制备包括“目的基因”在内的DNA片段群体，必须包容整个基因组的全部序列，DNA片段的大小要适合于基因操作的要求。第51页/共73页鸟枪法(shot-gun approach)：限制性内切酶消化供体基因组DNA，直接将消化产物与载体分子相连接。重组体分子带有大小不同的插入片段。真核基因组庞大，载体承受外源DNA插入为10003000bp，将产生几十万个大小不同的DNA片段，这些大小不同的DNA片段形成

29、的重组体分子组成相应克隆群体。要想从如此巨大的群体中选出带有目的基因的克隆太费事。第52页/共73页局部双酶消化法可以保证DNA产物大小在1030kb左右，通过离心或制备凝胶电泳技术，得到约为20kb的随机群体并将其克隆到合适的载体上，克服鸟枪法的困难。第53页/共73页542 重组体DNA分子的构建1外源DNA片段定向插入载体分子：载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对(NE1和NE2)切割，二者将按一种取向退火形成重组DNA分子，保证外源DNA片段定向插入载体分子。若载体分子和外源DNA插入片段不能产生出互补的粘性末端，则采用附加衔接物的办法来提高平末端之间的连接效率。第54页/共73页

30、第55页/共73页2最佳连接反应经限制性内切酶切割后的线性载体分子的自身不允许再环化。采用碱性磷酸酯酶处理由内切酶消化产生的线性载体分子，除去该DNA的5-P末端，而留下一个5-OH基团。当插入了外源DNA片段，其5为-P末端，从而能有效重组。第56页/共73页在连接反应中，使用正确的载体DNA和外源DNA的比例，是获得高产重组转化子的重要因素。用噬菌体或柯斯质粒作载体时，配制高比值的载体DNA/供体DNA的连接反应体系有利于重组分子的形成。用质粒作为克隆载体，其重组体分子由一个载体分子和一个供体DNA片段连接环化而成，当载体DNA与供体DNA的比值为1时，有利于这类重组体分子的形成。第57页

31、/共73页3重组体分子导人受体细胞的途径将外源重组体分子导人受体细胞的主要途径包括转化(或转染)、转导、显微注射和电穿孔等。转化和转导主要适用于细菌一类原核细胞和酵母等低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动物的真核细胞。在基因工程中有详细介绍。第58页/共73页543 cDNA基因克隆真核生物基因组DNA大，含有大量的重复序列和内含子，难以直接分离到目的基因。通过RT-PCR可以部分解决。高等生物一般具有35万种左右不同的基因，在一定时间阶段的单个细胞或组织中，仅有15%左右的基因得以表达，产生出约500010000种不同的mRNA分子。第59页/共73页cDNA克隆的基本过程是通

32、过一系列酶催作用，使总poly(A)mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。第60页/共73页1高质量mRNA的制备可应用Promega PolyAT tract mRNA分离系统分离poly(A)mRNA。将用生物素标识的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。第61页/共73页2反转录生成cDNAmRNA5AAAA互补21-CCC TTTT-20 21-GGG所有包含Poly(A)尾巴的mRNA被反转录生

33、成cDNA。以21和20为引物做PCR：21AAAA-20互补互补2120第62页/共73页3、重组体分子的构建及转化寄主菌株双链cDNA群体插入载体：21AAAA-20互补互补2120设计21时，让其有酶1的切点，20有酶2的切点，在质粒载体上有相应的切点，就可以定相将所有PCR片段插入载体。第63页/共73页转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。载体分子有抗药性基因，在培养基中加入相应的抗生素进行筛选。第64页/共73页经过特殊处理的具有吸收外源DNA能力的细菌细胞为感受态细胞。当重组质粒分子与感受态细胞混合，感受态细胞数量 重组质粒分子时，在培养基上长出的

34、单菌落是由一个重组质粒分子导入一个细菌细胞后经过繁殖而形成的。第65页/共73页在组织和培养的细胞中，一个细胞中有些mRNA可拥有数千个拷贝，而有些mRNA只有几个拷贝。根据mRNA分子含量的多寡，可以将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度3种不同的类型。第66页/共73页第67页/共73页从表中看出低丰度mRNA，其总量约占总mRNA的30%，约有11000个左右的不同种类的mRNA。如果获得11000个克隆，得到每一种低丰度mRNA的可能只有30，因此，为了获得一个能够代表全部低丰度mRNA序列的cDNA基因文库，必须的最低克隆数(理论值)应是11000/03037000。第68页/共73

35、页由于在实验中存在着取样差异，有些序列容易被克隆，有些序列不容易被克隆，为了保证cDNA文库中能够包含所有的序列，必须增加克隆的数目。为了使低丰度mRNA的cDNA克隆达到99%的期望率，需要筛选170000个克隆。第69页/共73页544 克隆基因的分离1应用核酸探针分离克隆目的基因:把cDNA文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。第70页/共73页应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。适用于大规模筛选。只要有合适的现成可用的核酸探针，就有可能从生物体的任何组织中分离到目的基因，也就能够有效地检测任何一种插入的外源DNA序列。第71页/共73页分离克隆基因的办法很多，根据不同的需要再去学习具体的方法，这里就不作一一介绍了。第72页/共73页感谢您的观看！第73页/共73页