实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验.ppt

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1、蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验的检验（一）蜡样芽胞杆菌生物学性状（一）蜡样芽胞杆菌生物学性状 1 1、形态和染色特性、形态和染色特性 该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端,多呈链状排列多呈链状排列,无荚膜，有周鞭毛无荚膜，有周鞭毛。2 2、培养特性、培养特性 （1 1）需氧菌，生长温度范围在）需氧菌，生长温度范围在10-4510-45之间。最适之间。最适 生长温度为生长温度为28-3528-35。（2 2）在普通培养基上生长良好。）在普通培养基上

2、生长良好。本菌在普通琼脂平板上，生长本菌在普通琼脂平板上，生长的菌落呈乳白色，不透明，直的菌落呈乳白色，不透明，直径径4-6mm,4-6mm,边缘不整齐，表面粗边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。糙，呈毛玻璃状或白蜡状。（3 3）在血液琼脂平板上形成）在血液琼脂平板上形成浅灰色、不透明、似毛玻璃浅灰色、不透明、似毛玻璃状的菌落。状的菌落。菌落周围初呈草菌落周围初呈草绿色溶血绿色溶血,时间稍长即完全透时间稍长即完全透明明。（4 4）蜡状芽胞杆菌在甘露醇）蜡状芽胞杆菌在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂卵黄多粘菌素琼脂(MYP)(MYP)上的菌落为上的菌落为粉红色粉红色(表示不发表示不发酵甘露醇酵甘露醇

3、)，周围有粉红色的，周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。晕（表示产生卵磷脂酶）。（5 5）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有常有菌膜或壁环菌膜或壁环，振摇易乳化。，振摇易乳化。3 3、生化性状：、生化性状：（1 1）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中，）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下厌氧条件下3535培养培养24h24h。培养基应由红色变。培养基应由红色变 为黄色。为黄色。（2 2）硝酸盐还原试验：阳性（红色）。）硝酸盐还原试验：阳性（红色）。（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸）（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸）（3 3）

4、V-PV-P试验：接种于改良试验：接种于改良V-PV-P培养基中，培养基中，3535 培养培养48 h48 h。加。加V-PV-P试剂及肌酸数粒，静止试剂及肌酸数粒，静止 1h1h，应为阳性反应（，应为阳性反应（伊红色伊红色）。）。（4 4）L-L-酪氨酸分解试验：接种于酪氨酸分解试验：接种于L-L-酪氨酸琼脂培酪氨酸琼脂培 养基上，养基上，3535培养培养48 h,48 h,阳性反应菌落周围培阳性反应菌落周围培 养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白 酶）。阴性时应继续培养酶）。阴性时应继续培养72 h72 h再观察。再观察。（5 5）溶菌酶试验：用直径）溶

5、菌酶试验：用直径2mm2mm接种环取纯菌悬液接种环取纯菌悬液 一环一环,接种于溶菌酶肉汤中，接种于溶菌酶肉汤中，3535培养培养24h24h。该菌在本培养基（含该菌在本培养基（含0.0010.001的溶菌酶）中能的溶菌酶）中能 生长。如出现阴性反应生长。如出现阴性反应,应继续培养应继续培养24 h24 h。4 4、致病性、致病性 蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌外，肠毒素也是重要的致病因素。外，肠毒素也是重要的致病因素。耐热性肠毒素：耐热性肠毒素：1003010030分钟不能被破坏，为引起分钟不能被破坏，为引起呕吐呕吐 型型中毒的致病

6、因素中毒的致病因素,常在米饭中形成。常在米饭中形成。不耐热肠毒素：是引起不耐热肠毒素：是引起腹泻型腹泻型胃肠炎的病因，能在各种胃肠炎的病因，能在各种 食物中形成。食物中形成。5 5、抵抗力、抵抗力 蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌100 20100 20分钟即可被杀死；对酸分钟即可被杀死；对酸碱不敏感，碱不敏感，pH6-11pH6-11对本菌基本上不受影响，对本菌基本上不受影响，pH5pH5以以下，生长可受到抑制。下，生长可受到抑制。（二）流行病学特点（二）流行病学特点 1 1、季节性特点：、季节性特点：以夏、秋季，尤其是以夏、秋季，尤其是6 61010月为多见。月为多见。2 2、食品种类、食品种类剩

7、饭，特别是大米饭。剩饭，特别是大米饭。乳及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、乳及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、豆芽、甜点心、调味汁、色拉。豆芽、甜点心、调味汁、色拉。国内：与淀粉质食品相关多。国内：与淀粉质食品相关多。3 3、临床症状、临床症状 呕吐型中毒呕吐型中毒：多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性：多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为2 23 3小时，最短小时，最短为为3030分钟，最长分钟，最长5 56 6小时；症状以呕吐，腹痉挛为主，小时；症状以呕吐，腹痉挛为主，腹泻则少见，一般经过腹泻则少见，一般经过8

8、 81010小时而治愈。小时而治愈。腹泻型中毒腹泻型中毒：由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜：由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期在伏期在6 6小时以上，一般为小时以上，一般为6 61414小时；症状以腹泻，腹小时；症状以腹泻，腹痉挛，而呕吐却不常见；病程痉挛，而呕吐却不常见；病程24243636小时。小时。1.蜡样芽孢杆菌检验程序：蜡样芽孢杆菌检验程序：检样25g(ml)+225ml生理盐水中华人民共和国国家中华人民共和国国家标准食品卫生微生物标准食品卫生微生物学检验蜡样芽孢杆菌学检验蜡样芽孢杆菌检验检验GB/T 4789.28-GB/T 4789.28-20032003做成10-1-10-5

9、的稀释液选择性培养基（菌数测定）MYP选择性培养基（分离培养）MYP37，18h-24h菌数计算营养琼脂培养基36 112h20h36 112h20h生长及菌落观察染色镜检检生化试验菌株保存报 告（三）检测方法（三）检测方法10-110-5的的稀释液的制备稀释液的制备 每个稀释度每个稀释度0.1mL接种于接种于2个个MYP培养基培养基361 1220h 菌落计数菌落计数361 1220h 挑取菌落接种肉汤和营养琼脂培养基（分离培养）挑取菌落接种肉汤和营养琼脂培养基（分离培养）证实试验证实试验 报报 告告 形态观察形态观察染色镜检染色镜检培养特性培养特性 生化特性生化特性 生化分型生化分型 2

10、2菌数测定菌数测定以无菌操作将检样以无菌操作将检样25g25g或或25 ml25 ml按菌落总数测定方式，用按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成1010-1-11010-5-5的稀释液。的稀释液。取各稀释液取各稀释液0.1ml0.1ml，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多黏，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用菌素琼脂）平板上，用L L形棒涂布于整个表面，置形棒涂布于整个表面，置3737培培养养121220h20h后，选取菌落数在后，选取菌落数在3030个左右者进行计数。蜡样个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表

11、示不发酵芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）甘露醇）,环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。酶）。计数后，从中挑取计数后，从中挑取5 5个这样的菌落作证实试验。根个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。计数后，从中挑取计数后，从中挑取5 5个此种菌落做证实试验，根据证实个此种菌落做证实试验，根

12、据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然的蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数，即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞后乘其稀释倍数，即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。杆菌数。例如将例如将0.1mL 100.1mL 10-4-4样品稀释液涂布于样品稀释液涂布于MYPMYP平板上，其可疑平板上，其可疑菌落为菌落为2525个，取个，取5 5个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌，个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌，则则1g1g（mLmL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数为：）检样中所含蜡样芽孢杆菌数为：选取具有选取具有15-15015-150个典型或可疑蜡样芽孢杆

13、菌菌落的平板个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板,进行计数。计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。进行计数。计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。254/510254/5104 410102102106 6 3 3分离培养分离培养 将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，置置3737培养培养121220h20h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于接种于肉汤和营养琼脂培养基上肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后做做纯培养，然后做证实试验。证实试验。4 4证实试验证实试验（1 1）形态观察）形态观察本菌应为本菌应为G G杆菌，

14、宽度在杆菌，宽度在1m1m或或1m1m以上，芽孢呈卵以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。（2 2）培养特性）培养特性本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。或融蜡状且边缘不齐。（3 3）生化特性）生化特性本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能氢酶试验阳性；溶血；不发

15、酵甘露醇和木糖；能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。萄糖。(4)(4)生化分型生化分型 根据蜡样芽孢杆菌对根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、还原、淀粉水解、V-PV-P反应、明胶液化的试验，反应、明胶液化的试验，分成不同型别，分成不同型别，见表见表1 1。表表1 1 蜡样芽孢杆菌生化分型蜡样芽孢杆菌生化分型型型别别生生 化化 试试 验验柠檬酸盐利用柠檬酸盐利用硝酸盐还原硝酸盐还原淀粉水解淀粉水解V-PV-P反应反应明胶液化明胶液化1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111

16、1212131314141515（4 4）与类似菌鉴别）与类似菌鉴别本菌与其他类似菌的鉴别见表本菌与其他类似菌的鉴别见表2 2。5.5.结果报告结果报告 报告报告1g1g（mLmL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数量）检样中所含蜡样芽孢杆菌数量 个个/g(mLg(mL)。实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验一、实验目的一、实验目的1学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。2了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特性了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特性和生化特性。和生化特性。v蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性杆菌

17、，在自然界分布较广，食品在正氏阳性杆菌，在自然界分布较广，食品在正常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种食品中检出。蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、食品中检出。蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、蔗糖和水杨苷，不发酵乳糖、甘露醇、木糖、蔗糖和水杨苷，不发酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇,卵磷脂酶和卵磷脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血，能酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血，能在在24h 内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条件下能发酵葡萄糖。件下能发酵葡萄糖。二、实验原理二、实验原理三、实验方法

18、与步骤三、实验方法与步骤1蜡样芽孢杆菌检验程序蜡样芽孢杆菌检验程序 2菌数测定菌数测定以无菌操作将检样以无菌操作将检样25g或或25 ml按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成或磷酸盐缓冲液做成10-110-5的稀释液。取各稀释液的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个形棒涂布于整个表面，置表面，置37培养培养1220h后，选取菌落数在后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（

19、表示不发酵甘露醇）样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）,环环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从中挑取绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。将检样或其稀释液划线于上述选择性培将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，置养基平板上

20、，置37培养培养1220h，挑取，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试验。验。3分离培养分离培养（1）形态观察）形态观察本菌应为本菌应为G杆菌，宽度在杆菌，宽度在1m或或1m以上，以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。央或稍偏于一端。（2）培养特性）培养特性本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛

21、玻璃状或融蜡状且边缘不齐。表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。4证实试验证实试验（3）生化特性）生化特性本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。萄糖。四、实验结果四、实验结果 根据以上实验作出检验报告。根据以上实验作出检验报告。五、思考题五、思考题1如何区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢如何区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢 杆菌？杆菌？2设计蜡样芽孢杆菌计数程序？设计蜡样芽孢杆菌计数程序？