蛋白质分子化学修饰PPT课件.ppt

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1、关于蛋白质分子的化学修饰第一张，PPT共八十八页，创作于2022年6月第一节第一节 酶的活性中心酶的活性中心第二节第二节 酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的第三节第三节 酶化学修饰的原理酶化学修饰的原理第四节第四节 酶化学修饰的设计酶化学修饰的设计第五节第五节 酶化学修饰的应用酶化学修饰的应用第六节第六节 酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程第二张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 第一节第一节 酶的活性中心（酶的活性中心（active siteactive site）一、活性中心的概念一、活性中心的概念vv酶的必需基团酶的必需基团酶的必需基团酶的必需基团(essential group):(es

2、sential group):(essential group):(essential group):与酶活性有关的基团与酶活性有关的基团与酶活性有关的基团与酶活性有关的基团vv酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心(active center):(active center):(active center):(active center):由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.第三张，PPT共八十八页，创作于2022年6月酶酶分分子子非必需基团非必需基

3、团必需基团必需基团活性中心活性中心必需基团必需基团活性中心外活性中心外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团非活性中心非活性中心活活性性中中心心第四张，PPT共八十八页，创作于2022年6月活性中心的重要化学基团活性中心的重要化学基团 7 7种氨基酸出现的频率最高种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr SerLys Asp Glu Cys His Tyr Ser 某些功能基团某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。和咪唑基）是酶的必需基团。赖氨酸的氨基赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基天冬氨酸和谷

4、氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基酪氨酸和丝氨酸的羟基第五张，PPT共八十八页，创作于2022年6月OH第六张，PPT共八十八页，创作于2022年6月第七张，PPT共八十八页，创作于2022年6月活性部位只占酶分子很小的一部分活性部位只占酶分子很小的一部分第八张，PPT共八十八页，创作于2022年6月胰凝乳蛋白酶 第九张，PPT共八十八页，创作于2022年6月活性部位是一个三维实体活性部位是一个三维实体第十张，PPT共八十八页，创作于2022年6月二、活性中心的共性二、活性中心的共性(1)(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（活性部位只

5、占酶分子很小的一部分（1-2%1-2%）。）。(2)(2)活性部位是一个三维实体。活性部位是一个三维实体。(3)(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。(4)(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。级键结合。第十一张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 酶的稳定性酶的稳定性 1.1.酶稳定的分子原因酶稳定的分子原因 1 1）共价键：）共价键：肽键（肽键（peptide bondpeptide

6、 bond）稳定蛋白质和酶主链的核心力量。稳定蛋白质和酶主链的核心力量。二硫键（二硫键（disulfide bonddisulfide bond）由两个由两个CysCys的侧链的侧链-SH-SH氧化而成，是某些蛋白氧化而成，是某些蛋白质维持结构稳定性的主要因素。质维持结构稳定性的主要因素。第十二张，PPT共八十八页，创作于2022年6月2 2）非共价键：）非共价键：疏水相互作用（疏水相互作用（hydrophobic interactionhydrophobic interaction）:是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。氢键（氢键（hydrogen bon

7、dhydrogen bond）：）：是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要力量。力量。第十三张，PPT共八十八页，创作于2022年6月静电相互作用（静电相互作用（electrostatic interactionelectrostatic interaction）：）：又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。范德华力：范德华力：在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的范德华在电中性分子之间

8、的非共价结合。分子间形成的范德华力越大越稳定。力越大越稳定。金属离子：金属离子：Ca2+Ca2+、MgMg2+2+和和ZnZn2+2+等高价阳离子与多肽链不稳定的弯等高价阳离子与多肽链不稳定的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。第十四张，PPT共八十八页，创作于2022年6月途径方法优点不足酶分子改造核酸水平蛋白质工程从根本上提高酶分子稳定性操作复杂，周期长蛋白质水平化学修饰适应所有酶，操作简单经济修饰过程破坏酶分子剂型固定化适应所有酶，稳定性高，可重复利用和连续生产载量较低，易失活交联酶晶体稳定性好，载量高，催化效率高成本高微环境改良稳定剂简单、经济

9、工作量大反应介质适用于特殊反应体系和酶类适合的酶类还不普遍2.稳定酶的方法稳定酶的方法第十五张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 三、研究酶活性中心的方法三、研究酶活性中心的方法 1.1.物理学方法：物理学方法：用用X X射线衍射法直接检测底物或其类射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。底物）的相对位置。第十六张，PPT共八十八页，创作于2022年6月2.2.化学修饰法：化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为根据所用修饰试剂不同，分为 1)1)非专一性化学修饰非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团

10、作用。用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：若某基团被修饰后：酶活性不变酶活性不变该基团可能不是酶的必需基团该基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失酶活性降低或丧失该基团可能是酶的必需基团该基团可能是酶的必需基团但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。第十七张，PPT共八十八页，创作于2022年6月活性中心基团的鉴定标准活性中心基团的鉴定标准 失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。S S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。先加先加S S或竞或竞

11、加共价修饰剂加共价修饰剂 透析除去透析除去S S或竞或竞 活性不丧失活性不丧失第十八张，PPT共八十八页，创作于2022年6月差别标记：差别标记：底物或抑制剂存在底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用活性基团不与修饰剂作用 去除底物或抑制剂去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记原来被保护的基团带同位素标记 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。化学修饰化学修饰含同位素标记含同位素标记 的同样试剂的同样试剂第十九张，PPT共八十八页，创作于2022年6月2)2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修

12、饰酶活性中心的某一氨基酸残用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。基的侧链基团。3)3)亲和标记（位点专一性修饰）亲和标记（位点专一性修饰）采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。的含有活泼反应基团的底物类似物。作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。标记。第二十张，PPT共八十八页，创作于2022年6月化学修饰的专一性化学修饰的专一性第二十一张，PPT共八十八页，创作于2022年6月亲和修饰剂：亲和修饰剂：与与S S结构相似结构相似，与活性

13、中心的氨基酸残基，与活性中心的氨基酸残基 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。残基亲和力小。具有活泼的化学基团具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。中心的基团形成稳定的共价键。第二十二张，PPT共八十八页，创作于2022年6月3.3.蛋白质工程：蛋白质工程：将酶相应的将酶相应的cDNAcDNA定点突变，突变的定点突变，突变的cDNAcDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。否为活力所必

14、需。第二十三张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 第二节第二节 酶化学修饰及修饰目的酶化学修饰及修饰目的 一、酶化学修饰一、酶化学修饰 1.1.限制酶大规模应用的原因：限制酶大规模应用的原因：第二十四张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、拟的。因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、环境保护和监测、化工产品的生产，以及基因工程等生物技术领域。环境保护和监测、化工产品的生产，以及基因工程等生物技术领域。但

15、是但是酶在实际应用中有酶在实际应用中有局限性局限性：1 1、作为异体蛋白在体内作为异体蛋白在体内难于吸收难于吸收、易引起、易引起免疫反应免疫反应和和被识别降解被识别降解(具有抗原性具有抗原性)；2 2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，半衰期短、半衰期短、易变性失活易变性失活(细胞外稳定性差细胞外稳定性差)；3 3、酶的活性、作用专一性和最适条件酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要不一定能适应生产工艺要求，求，限制了酶制剂的应用范围限制了酶制剂的应用范围(酶活性不够高酶活性不够高)。第二十五张，PPT共八十八页，创作于2

16、022年6月2.2.改变酶特性有两种主要的方法改变酶特性有两种主要的方法：1)1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。天然酶的活性。2)2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。因而达到改造酶的目的。第二十六张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 3.酶化学修饰的概念酶化学修饰的概念 （原理（原理 、方法、应用）、方法、应用）酶的化学修饰（酶的化学修饰（chemical modificationchemical modification）：）：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生

17、改变。通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。酶选择性化学修饰：酶选择性化学修饰：肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰 化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂

18、所具有的各种化学基团特性，特性，或直接或经过一定的活化过程或直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。第二十七张，PPT共八十八页，创作于2022年6月二、酶化学修饰的目的二、酶化学修饰的目的 1.1.研究酶的结构与功能的关系。（研究酶的结构与功能的关系。（5050年代末）年代末）2.2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（范围。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）提高酶的生物活

19、性（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4 4）产生新的催化能力。）产生新的催化能力。第二十八张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 第三节第三节 酶化学修饰的原理酶化学修饰的原理 凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结构发生改变构发生改变（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联），子内或分子间的交

20、联），都可称为蛋白质的化学修饰。都可称为蛋白质的化学修饰。达到：达到：改造酶的作用特性改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对效（包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求）应物响应性能及对辅助因子的要求）提高酶的稳定性提高酶的稳定性扩大在体内应用可能性扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性水解、减（防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用）少和消除免疫原性以利于医疗应用）第二十九张，PPT共八十八页，创作于2022年6月一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶修饰剂分子存在多个反应基

21、团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性刚性”结构。结构。二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖遮盖”了酶的活性了酶的活性部位部位。第三十张，PPT共八十八页，创作于2022年6月三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近大分子修饰

22、剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。酶分子。“遮盖遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。酶分子上敏感键免遭破坏。2.2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。了受蛋白水解酶破坏的可能性。第三十一张，PPT共八十八页，创作于2022年6月四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1.1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 “遮盖遮盖”了抗原决定簇了抗原决定簇阻碍

23、抗原、抗体结合阻碍抗原、抗体结合2.2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成形成“缓冲外壳缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。酶活性部位微环境相对稳定。第三十二张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 第四节第四节 酶化学修饰的设计酶化学修饰的设计 一、充分认识酶分子的特性一、充分认识酶分子的特性 包括酶的包括酶的 1.1.活性部位情况活性部位情况 2.2.稳定条件及反应最佳条件稳定条件及反应最佳条件 3.3.侧链基团的化学性质及反应活泼性侧链基团的化学性质及反应活泼性第三十三

24、张，PPT共八十八页，创作于2022年6月二、二、修饰剂的选择修饰剂的选择 要考虑要考虑 1.1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）子量）2.2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）多的反应活性基团）3.3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件修饰剂上反应基团的活化方法与条件第三十四张，PPT共八十八页，创作于2022年6月三、反应条件的选择三、反应条件的选择 要注意要注意 1.1.酶与修饰剂的分子比例酶与修饰剂的分子比例 2.2.反应体系的溶剂性质、盐浓度、反应体系的溶剂性质、盐浓度、p

25、HpH条件条件 3.3.反应温度及时间反应温度及时间第三十五张，PPT共八十八页，创作于2022年6月第五节第五节 酶化学修饰的种类及应用酶化学修饰的种类及应用 一、酶的表面化学修饰一、酶的表面化学修饰 （一）大分子修饰（大分子结合修饰）（一）大分子修饰（大分子结合修饰）是目前应用最广的酶分子修饰方法。是目前应用最广的酶分子修饰方法。1.1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。能的方法。第三十六张，PPT共八十八页，创作于2022年6月2.2.修饰剂

26、：修饰剂：聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、右旋糖酐（）、右旋糖酐（dextrandextran）、肝）、肝素（素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（FicollFicoll）等。）等。修饰方法：修饰方法：修饰前修饰剂活化修饰前修饰剂活化 一定条件下与酶分子共价结合一定条件下与酶分子共价结合 对酶分子进行修饰。对酶分子进行修饰。第三十七张，PPT共八十八页，创作于2022年6月3、大分子修饰后酶性质的变化（1）提高酶活力（2）增加酶的稳定性 半衰期：酶活力降低原来活力一半所经过的时间。（3）降低抗原抗体反应 第三十八张，PPT共八十八页，创作于2022年6月4.4.

27、应用：应用：如：如：PEGPEG超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）PEGPEG溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）PEGPEG天门冬酰胺酶（天门冬酰胺酶（ASNaseASNase）消除了抗原性消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期延长了酶在体内的半衰期又如：用又如：用DextranDextran修饰修饰-淀粉酶，淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。提高了酶的热稳定性。第三十九张，PPT共八十八页，创作于2022年6月（二）小分子修饰（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）（酶蛋白侧链基团修饰）定义：定义：

28、通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰剂：侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。采用的各种小分子化合物。2020种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。第四十张，PPT共八十八页，创作于2022年

29、6月根据氨基酸侧链根据氨基酸侧链R R基的极性，基的极性，2020种氨基酸可分成种氨基酸可分成4 4类类。1.1.非极性非极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共8 8种）：种）：丙氨酸丙氨酸(Alanine,Ala,A),(Alanine,Ala,A),亮氨酸亮氨酸(Leucine,Leu,L),(Leucine,Leu,L),缬氨酸缬氨酸(Valine,Val,V),(Valine,Val,V),异亮氨酸异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),(Isoleucine,Ile,I),苯丙氨酸苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸

30、色氨酸(Tryptophan,Trp,W),(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸甲硫氨酸(Methionine,Met,M),(Methionine,Met,M),脯氨酸脯氨酸(Proline,Pro,P)(Proline,Pro,P)第四十一张，PPT共八十八页，创作于2022年6月2.2.无电荷的极性无电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共7 7种）：种）：丝氨酸丝氨酸(Serine,Ser,S),(Serine,Ser,S),苏氨酸苏氨酸(Threonine,Thr,T),(Threonine,Thr,T),酪氨酸酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),(Tyrosine,T

31、yr,Y),半胱氨酸半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),(Asparagine,Asn,N),甘氨酸甘氨酸(Glycine,Gly,G),(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)(Glutamine,Gln,Q)3.3.带正电荷的极性带正电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共3 3种）：种）：赖氨酸赖氨酸(Lysine,Lys,K),(Lysine,Lys,K),精氨酸精氨酸(Arginine,Arg,R),(Arginine,Arg,R),组氨酸组氨酸(H

32、istidine,His,H)(Histidine,His,H)4.4.带负电荷的极性带负电荷的极性R R基氨基酸基氨基酸（共（共2 2种）：种）：天冬氨酸天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D),(Aspartic acid,Asp,D),谷氨酸谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)(Glutamic acid,Glu,E)第四十二张，PPT共八十八页，创作于2022年6月几种重要的修饰反应：几种重要的修饰反应：烷基化反应烷基化反应酰化反应酰化反应氧化还原反应氧化还原反应芳香环取代反应芳香环取代反应第四十三张，PPT共八十八页，创作于2022年6月1.1.化学修饰反应的类

33、型化学修饰反应的类型 1)1)烷基化反应烷基化反应试试剂剂特特点点：烷烷基基上上带带活活泼泼卤卤素素，导导致致酶酶分分子子的的亲亲核核基基团团（如（如NHNH2 2，-SH-SH等）发生烷基化。等）发生烷基化。可作用基团：可作用基团：氨氨基基（LysLys，ArgArg），巯巯基基（CysCys），羧羧基基（AspAsp、GluGlu），甲甲硫基（硫基（MetMet），咪唑基（），咪唑基（HisHis）。）。修饰剂修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。第四十四张，PPT共八十八页，创作于2022年6月烷基化反应第四十五张，PPT共八十八页，创作于

34、2022年6月 2)2)酰基化反应酰基化反应试剂特点：试剂特点：含含有有 结结构构，作作用用于于侧侧链链基基团团上上的的亲亲核核基团，使之酰基化。基团，使之酰基化。可作用基团：可作用基团：氨氨基基，巯巯基基，醇醇羟羟基基（SerSer、ThrThr），酚酚羟羟基基（TyrTyr）第四十六张，PPT共八十八页，创作于2022年6月酰基化反应 第四十七张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 3)3)氧化和还原反应氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：氧化剂：H2O2，N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺可可被被氧氧化化的的侧侧链链基基团团：巯巯基基，甲甲

35、硫硫基基，吲吲哚哚基基（Trp）、咪咪唑唑基，酚基等。基，酚基等。还原剂：还原剂：2巯基乙醇、巯基乙醇、DTT等。等。可被还原的侧链基团：二硫键。可被还原的侧链基团：二硫键。第四十八张，PPT共八十八页，创作于2022年6月连四硫酸盐氧化巯基，连四硫酸盐氧化巯基，DTTDTT还原逆回，用于保护巯基。还原逆回，用于保护巯基。第四十九张，PPT共八十八页，创作于2022年6月2.2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1)1)氨基的化学修饰：氨基的化学修饰：来源：来源：Lys,Arg,His,GlnLys,Arg,His,Gln修饰反应：酰基化与烷基化修饰反应：酰基化与

36、烷基化酰基化酰基化修饰剂修饰剂:三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）、丹磺酰氯（）、丹磺酰氯（DNSDNS）烷基化烷基化修饰剂修饰剂：2 2，4 4二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等亚硝酸等第五十张，PPT共八十八页，创作于2022年6月第五十一张，PPT共八十八页，创作于2022年6月2)2)羧基的化学修饰羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。可定量测定酶分子中羧基的数目。+水溶性碳化

37、二亚胺水溶性碳化二亚胺第五十二张，PPT共八十八页，创作于2022年6月3)3)胍基的化学修饰胍基的化学修饰来源：来源：ArgArg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：修饰剂：丁二酮丁二酮 二羰基化合物二羰基化合物 1 1，2 2环己二酮环己二酮 苯乙二醛苯乙二醛第五十三张，PPT共八十八页，创作于2022年6月第五十四张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 4)4)巯基的化学修饰巯基的化学修饰 来源：来源：CysCys 修饰反应修饰反应:烷基化烷基化 修饰剂：碘乙酸修饰剂：碘乙酸(IAA)(IAA)碘乙酰胺碘乙酰胺(IAM)(IAM)E-SH+

38、R-X E-SH+R-X E-SR+HX E-SR+HXN-N-乙基马来酰亚胺（乙基马来酰亚胺（NEMNEM）（常用的专一修饰巯基试剂）（常用的专一修饰巯基试剂）E ESH SH 第五十五张，PPT共八十八页，创作于2022年6月5)5)二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰还原：还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTTDTT）第五十六张，PPT共八十八页，创作于2022年6月氧化：氧化：过甲酸过甲酸:Performicacid第五十七张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 6)6)咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰 来源：来源：HisHis 修饰反应修饰反应:酰基化与烷基化酰基化

39、与烷基化 酰基化修饰剂酰基化修饰剂:常用焦碳酸二乙酯（常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonatediethyl paracarbonate）+C2H5OH+CO2C2H5OH+CO2 烷基化修饰剂：碘乙酸烷基化修饰剂：碘乙酸+ICH2COOH+HI第五十八张，PPT共八十八页，创作于2022年6月7 7）酚羟基的化学修饰）酚羟基的化学修饰来源：来源：TyrTyr修饰反应：芳香环取代反应修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）第五十九张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 4)4)芳香环取代反应芳香环取代反应试剂：卤（碘）

40、化，硝化试剂。试剂：卤（碘）化，硝化试剂。碘代：碘代：I2+HI 硝化：硝化：(NO2)4C+(NO2)3CH（四硝基甲烷）（四硝基甲烷）第六十张，PPT共八十八页，创作于2022年6月8 8）吲哚基的化学修饰）吲哚基的化学修饰 来源：来源：TrpTrp 修饰反应：氧化反应修饰反应：氧化反应 修饰剂：修饰剂：N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺第六十一张，PPT共八十八页，创作于2022年6月氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂LysLys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸AspAs

41、p、GluGlu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮CysCys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTHisHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷TrpTrp吲哚基吲哚基N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂第六十二张，PPT共八十八页，创作于2022年6月酶化学修饰的应用酶化学修饰的应用 在医药方面：在医药

42、方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。和抗原性。在生物技术领域：在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pHpH等酶学等酶学性质。性质。在酶结构功能研究中：在酶结构功能研究中：1.1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.2.确定氨基酸残基的功能；确定氨基酸残基的

43、功能；3.3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。测定酶分子中某种氨基酸的数量。第六十三张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 化学修饰效果举例化学修饰效果举例 用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了性提高了100100倍倍 用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的NHCHNHCH2 2COOHCOOH后，该酶对后，该酶对60C60C热处理的稳定性增高了热处理的稳定性增高了10001000倍。倍。超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SO

44、D)(superoxide dismutase,SOD)、L L谷氨酰胺谷氨酰胺酶、酶、L L天门冬酰胺酶、尿酸酶等用天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)修饰后，完全修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存被清除的速度，酶的活力可以保存15154545。第六十四张，PPT共八十八页，创作于2022年6月酶蛋白化学修饰的局限性酶蛋白化学修饰的局限性1.1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的相对的，很少有对，

45、很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.2.化学修饰后酶的化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。碍对修饰结果的解释。3.3.酶的化学修饰酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。4.4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一酶化学修饰的结果对于

46、研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需必需”的，为什么是必需的，还得用的，为什么是必需的，还得用X X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。缺乏准确性和系统性。第六十五张，PPT共八十八页，创作于2022年6月（三）交联修饰（交联法）（三）交联修饰（交联法）用双功能基团试剂用双功能基团试剂(如戊二醛如戊二醛)，与酶分子内，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加不

47、同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。稳定。（四）固定化修饰（共价偶联法）（四）固定化修饰（共价偶联法）通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适酶的最适pHpH、最适温度和稳定性发生改变。、最适温度和稳定性发生改变。第六十六张，PPT共八十八页，创作于2022年6月二、酶分子内部修饰二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）利用肽链有限水解，使酶的空间结构发生精细利用肽链有限水解，使酶的空间结构发生精

48、细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。酶或肽酶为修饰剂）。（与前面化学修饰区别）（与前面化学修饰区别）第六十七张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：三种情况中的一种：1 1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2 2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3 3 有利于活性中心与底物结合并

49、形成准确的催化部位，酶活力有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。提高。后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。限水解。第六十八张，PPT共八十八页，创作于2022年6月修饰后酶性质的变化修饰后酶性质的变化1 1）提高酶活力）提高酶活力2 2）消除抗原性）消除抗原性第六十九张，PPT共八十八页，创作于2022年6月（二）金属离子置换修饰（二）金属离子置换修饰1、概念、概念 通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。发生改变的方法。2、作用范围含

50、有金属离子的酶、作用范围含有金属离子的酶 金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。分，对酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。原离子则酶复活。（2）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。呈现不同特性。第七十张，PPT共八十八页，创作于2022年6月 3、常用金属离子常用金属离子 （往往是二价离子）（往往是二价离子）:Ca 2+，Mg 2+，Mn 2+，Zn 2