westernblot详解学习教程.pptx

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1、垂直电泳、电转装置电泳槽 玻璃板、梳子、加样校准架等电转移槽 切胶板、黑白夹板、海绵垫等电泳仪 用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹）实验中非常重要的部分。第1页/共53页WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体（一抗）起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过

2、底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western blot 实验原理抗原一抗生物素标记的二抗ECL发光试剂第2页/共53页Western blot Western blot 检测蛋白表达实验流检测蛋白表达实验流程程第3页/共53页SDS-PAGE电泳的基本原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶是在PAGE凝胶中引进SDS（十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32-），SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋

3、白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS-PAGE胶中的迁移率主要取决于其分子量的大小。第4页/共53页PAGEPAGE：聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。第5页/共53页聚丙

4、烯酰胺凝胶的聚合方式：聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光化学催化（核黄素TMTED）体系。第6页/共53页第7页/共53页一配分离胶准备物品：玻璃板洗衣粉灌胶架移液枪两个烧杯（1ml200ul20ul）30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris

5、-HCL溶液（PH=8.8），ddH2O10%AP（-20冰箱），TEMD（4度），SDS（常温）1清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在通风处或烘箱中2配制分离胶：玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡在架子上准备灌胶。先配制分离胶。配方如下：第8页/共53页 具体情况依照说明书第9页/共53页灌分离胶：用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶

6、会被冲变形。温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶，灌胶速度须缓慢，避免产生气泡灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平第10页/共53页灌制分离胶灌制分离胶隔绝空气隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%第11页/共53页二 配制浓缩胶准备物品：移液枪烧杯（1ml200ul20ul）Tips：30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris-HCL溶液（PH=6.8），ddH2O10%AP（-20冰箱），TEMD（4度），SDS（常温）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝了。倾倒掉胶上层的异丙醇，后用吸水纸吸干。注意吸水纸不要触碰分离胶10%的分离胶配

7、合6%的浓缩胶使用。配制浓缩胶，配方如下：第12页/共53页6%的浓缩胶4mlddH2O2.39ml30%Acrylamide0.544ml1M Tris-HCL 溶 液（PH=6.8）1.02ml10%APS40.82ulTEMD2.04ul第13页/共53页配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后震荡。灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。冰箱过夜待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草纸铺于保鲜膜上。用d

8、dH2O浸湿草纸。取玻璃板放于草纸上，包好。放入4冰箱过夜。第14页/共53页浓缩胶的浓度比较低（5%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺），里面的孔径也比较大，所有的蛋白都能够在进入分离胶之前在同一水平线上（因为在你加样的时候蛋白是分布在加样孔中的，不在同一水平线上。）分离胶的胶浓度比较大（10%），里面胶孔径也比较小，这样施加电压的时候小的蛋白可以穿过孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可能被拦住，就跑的慢。通过这种方式以分子量大小的区别来分离蛋白质第15页/共53页插梳子插梳子第16页/共53页第17页/共53页三电泳：固定：将玻璃板等装置固定在电泳槽内上样：上所需要的蛋白质样品电泳第18页/共53页3

9、1固定用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。向电泳槽中加入1x电泳液拔掉梳子，注意动作轻柔。5X电泳液缓冲液Tris（MW121.14）15.1g甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.00g蒸馏水至1000ml第19页/共53页32上样蛋白质样品的提取与制备蛋白浓度的测定计算上样量用微量注射器吸取蛋白加入到上样孔中。一般蛋白MARK的上样孔在两边。第20页/共53页311 蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸使其吸干培养液。2、向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul

10、/孔，冰上放置，摇床20min3、用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中，勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作）4、于4下12000rpm离心5min。5、将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80保存。第21页/共53页 （2）组织中总蛋白的提取：1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（5ml离心管）。2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于冰上。3.10，000g,4,10min,（5ml管）离心4.取上清至1.5ml管，12，000g,4,60min,离心5.取上清至新1.5ml管,-80储存第22页/共53页312蛋白蛋白样品浓度的样品浓度

11、的测定方法测定方法定氮法双缩脲法Folin-酚试剂法紫外吸收法考马斯亮蓝法BCA法第23页/共53页1.Bradford法简介原理：考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。制作标准曲线（插入表格）检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。第24页/共53页2.BCA法简介实验试剂:BCA试剂，标准蛋白质溶液试验方法:根据吸光值可以推算出

12、蛋白浓度。实验操作:绘制标准曲线原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。第26页/共53页313313蛋白蛋白上上样样量量的计算的计算 取含有提取好的蛋白的EP管，放在冰上融化，计算上样量。可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）取出样品至EP管中，加入1上样缓冲液至相同的

13、上样体积（上样总体积一般不超过30l）。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。4X上样缓冲液 1.0 mol/L TrisHCl（pH6.8）2ml SDS 0.8g 溴酚蓝 0.04g 甘油 4ml去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。使用时稀释成1X。第27页/共53页314上样上样(注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用。)Marker 6l （Marker加在最边上的加样孔中）样本 20-30l 实验所用Marker电泳后出现10条带：10，15，25，35，40，55，70，100，130，170KDa 根据分子量的大小确定电压和时间，marker

14、跑开后变压，一般溴酚蓝离胶下cm停止电泳进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）第28页/共53页主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。蛋白质蛋白质MarkerPrestained protein laddersUnstained protein laddersFermentas第29页/共53页上样缓冲液Loadingbuffer显示电泳进程其中甘油可以增大样品密度，使样品沉降到点样孔上，防止样品漂出第30页/共53页上样第31页/共53页Anode-内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶

15、底部接触Cathode+带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳小分子量蛋白跑的比较快.蛋白根据分子量大小分开蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动标本加入到上样孔中第32页/共53页第33页/共53页四转膜准备物品：转移槽黑红夹子NC膜滤纸海绵垫转膜缓冲液（1）转一张膜需准备6张滤纸和1张NC膜。切滤纸和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。10X转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07）151.1gTris（MW121.14）30.3g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存,用时稀释10

16、倍，并加入甲醇至20%第34页/共53页（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸-海绵将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在1X转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。第35页/共53页将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在

17、槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件；转膜时电极方向注意是膜正胶负。第36页/共53页五封闭准备物品：封闭液BSA（5%脱脂牛奶)摇床1x洗膜液1转完膜后，关闭电源。取出转膜槽，拿出夹子，取膜。2取已经配制好的封闭液（5%脱脂牛奶)，加入到容器中。用镊子将膜的一角夹起，放入到封闭液（5%脱脂牛奶)，注意使转有蛋白的一面朝上。放置在摇床上封闭2-3h或过夜。根据蛋白Marker的标记，切出目的蛋白的条带和内参蛋白的条带。第37页/共53页1XTBST缓冲液10XTBS缓冲

18、液100ml蒸馏水900mlTween-201ml因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。溶解后室温保保存存。封闭液BSA（5%脱脂牛奶)：1XTBST缓冲液95-100ml脱脂奶粉/BSA5g溶解后4保存，可于一周内使用。第38页/共53页六六 抗体的孵育抗体的孵育一抗的孵育准备物品：目的蛋白一抗内参蛋白（GAPDH，beta-actin或beta-tubulin）一抗摇床将一抗用封闭液稀释至适当浓度（目的蛋白GluT31:300,actin1:2000）；将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体放在摇床上室温下孵育1-2h或过夜（目的蛋白GluT31.5h,ac

19、tin1h）洗膜TBST洗膜放在摇床上震荡10min，弃去洗膜液，如此反复3次。第39页/共53页二抗的孵育二抗的孵育根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时或过夜洗膜TBST洗膜放在摇床上震荡10min，弃去洗膜液，如此反复3次。准备物品：目的蛋白二抗内参蛋白（GAPDH，beta-actin或beta-tubulin）二抗容器4冰箱摇床从-20冰箱中取出已经稀释好的二抗溶液，室温下融化。二抗的选择根二抗的选择根据一抗的种属据一抗的种属来源，如：一来源，如：一抗是兔抗大鼠

20、抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗目的蛋白的抗体，则二抗应体，则二抗应选择山羊或其选择山羊或其他来源抗兔的他来源抗兔的抗体，而且二抗体，而且二抗要标记有同抗要标记有同位素或酶。位素或酶。第40页/共53页七七 ECLECL化学发光化学发光检测检测（显影）（显影）准备物品及仪器：Imagequant仪器显影液（A+B）移液枪Tips 玻璃板EP管浅盘1洗膜后，将膜放于草纸上，将洗膜液吸净2进入曝光室后，关闭电源，注意避光。3根据膜的大小来估计加入显影液的量。将等量A液和B液加入到EP管中混匀后，用移液枪吸取均匀点于膜上。4放入机器中，点击fouces按钮，观察膜的位置是否放正。5点击Start按钮，选择a

21、uto进行曝光。然后进行图片保存，注意，有两种图片保存格式。7根据曝光后条带显影的强弱选择手动曝光的时间。第41页/共53页手动曝光手动曝光将A和B两种试剂等量（常用各500l）在5ml离心管中等体积混合；打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光）将显影液和定影液分别到入盘中；在红灯下，取出X光片，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，将X-光片迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影结束后，再放到定影液

22、中进行定影。定影时间一般为510min，以胶片透明为止第42页/共53页第43页/共53页第44页/共53页SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳uu胶不平？胶不平？uu凝胶漏液？凝胶漏液？胶板洗刷干净胶板洗刷干净加入加入APAP和和TEMEDTEMED的量要合适的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐常见问题第45页/共53页uu条带比正常的窄？条带比正常的窄？uu“微笑微笑”或或“倒微笑倒微笑”条带？条带

23、？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适气泡。同时注意电泳槽装置是否合适SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳第46页/共53页转膜及抗体检测转膜及抗体检测uu凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？uu条带歪斜或漂移？条带歪斜

24、或漂移？uu单个或多个白点？单个或多个白点？uu转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡泡5-10min5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温转膜过程注意降温第47页/共53页转移到膜上的蛋白很少1.蛋白分子量 10KD2.蛋白的等电点 93.SD

25、S浓度不合适4.凝胶太厚 原因对策1.蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜2.更换高pH值Buffer3.在阴极buffer中加入0.005-0.01%SDS 可提高转膜效率4.延长转膜时间第48页/共53页1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交叉反应5.抗体浓度过高 原因对策1.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度背景太高第49页/共53页杂交信号很弱1.抗体保存不当2.抗原不充足3.膜的漂洗过度 原因对策1.抗体长期保存应在70，使用前做效价检测2.增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照3.减少漂洗的时间和次数第50页/共53页1.一抗不是唯一特异的2.二抗出现非特异结合 原因对策1.制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点2.设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合出现非特异带第51页/共53页Thank Thank you!you!第52页/共53页感谢您的观看！第53页/共53页