现代生物技术综合实验.pptx

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1、实验一 质粒DNA的制备与质量鉴定一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。第1页/共44页二、实验原理 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质，

2、混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。第2页/共44页三、实验材料与主要试剂 实验材料：含pEGFP质粒的大肠杆菌DH5 主要试剂：溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L 溶液II：0.2 mol/L NaOH溶液（内含1%SDS）,现配现用 溶液III（pH4.8）:60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，28.5 mL H2O；饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V）TE缓冲液（pH8.0）:10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，含RNA酶（RNas

3、eA）:20 g/ml 醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇第3页/共44页第4页/共44页四、实验步骤1)吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。2)离心(8 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复12次）。3)加入150 L 溶液，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。4)加入200 L溶液，加盖后温和颠倒56次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。5)加入150 L预冷的溶液，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。6)离心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心管。第5页/共44页7)7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/

4、异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出现分层。8)移取上层水相溶液（约450500L）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出现分层。9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。10)离心(14 000r/min，10min，4)，倒掉上清液。第6页/共44页11)加0.5 ml 预冷的70%酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5 min，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥.13)加2030L TE缓冲液使DN

5、A完全溶解，室温放置10min，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检测，剩余质粒-20保存备用。14)1%琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入100ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5L溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。第7页/共44页15)每位同学各取5L质粒DNA加入1L 6loading buffer，混匀，进行点样。16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。五、实验结果 观察并分析电泳图片六、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。第8页/共44页实验二 质粒DNA的片断化及分

6、离 一、实验目的 1、学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量 2、采用型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。第9页/共44页二、实验原理 DNA吸收光谱峰在260 nm处，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50 g/mL，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质吸收峰在280 nm处，在测定DNA含量时，通过计算OD260/OD280值，可了解所测DNA的纯度，如该值为1.82.0时，DNA纯度高。已知型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在该处切断双链DNA，形成一定长度和序列的DNA片段。酶切反应需Mg2+等金

7、属离子以及一定浓度的盐离子，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高（5%），会使酶的识别位点发生改变，产生星活性。绝大多数酶的反应温度37。第10页/共44页三、实验材料：实验一提取的质粒DNA四、试剂 限制性核酸内切酶Xba I；缓冲液10M Buffer；0.1%BSA;0.5TBE Buffer；1%琼脂糖五、实验步骤 1、DNA的测定 空白测定(Blank)：吸取200 l TE缓冲液至比色杯，进行空白测定。DNA测定(Sample)：取质粒DNA 1 l至一干净的离心管，加入199 l TE缓冲液稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定260 nm及2

8、80 nm的光吸收值；计录DNA浓度及OD260/OD280比值。第11页/共44页第12页/共44页2 2、酶切反应 酶切反应液的配制:Xba I I 1l 10M buffer 2l 0.1%BSA 2l DNA 5l(根据质粒浓度来确定用量)ddH2O 10l 酶切反应条件：3737水浴2 23 3小时。3 3、电泳检测 反应结束后，向反应液中加入2.5l 102.5l 10loading loading bufferbuffer，混匀，用以停止酶切反应，所有22.5l22.5l样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：120V,20120V,20分钟左右。第13页/共44页六、实验结果 观察

9、并分析电泳图片。七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。第14页/共44页实验三 大分子DNA的制备和质量鉴定 一、实验目的 采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从植物组织中提取基因组DNA，并进行DNA纯度分析和琼脂糖凝胶电泳检测。第15页/共44页二、实验原理 核酸是生物有机体的重要成分，在细胞中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。在浓NaCl溶液(12mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶

10、解度很大。因此，可利用不同浓度的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。分离得到核蛋白后，可用氯仿等将蛋白等杂质除去。第16页/共44页有效制备大分子DNA的两个原则：1）防止和抑制内源DNase对DNA的降解。2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。第17页/共44页三、实验材料：植物叶片约0.2克四、实验试剂 1M Tris-HCl(pH8.0)(提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏)CTAB分

11、离缓冲液：2%CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.2%巯基乙醇(EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易从基因组DNA中除去)洗涤缓冲液：76%乙醇，10mmol/L乙酸铵 氯仿-异戊醇(24:1)、异丙醇、TE缓冲液 液氮第18页/共44页五、实验步骤1.CTAB分离缓冲液置于60水浴中预热；2.2人一组，摘取0.5g叶片，置于研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎；3.取约0.2

12、g叶片粉末加入到2.0mL离心管中，加入1ml预热的CTAB分离缓冲液，轻轻转动使之混匀；4.样品置于65保温30min；5.加等体积(1mL)的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀；6.室温下14000 rpm离心10min；第19页/共44页7.上层水相吸入另一干净1.5mL离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，静置5min，使核酸沉淀下来；8.室温下10000 rpm离心10min；9.弃去上清液，加入500L洗涤缓冲液，悬浮混匀；10.4条件下，14000 rpm离心10min；11.在室温下使DNA沉淀干燥至周围透明，中间有少许白色为止；12.将DNA沉淀溶于20L TE中，-20保存备

13、用；13.取5uL DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检查所提取DNA的完整性；14.利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度检测。（方法同实验二）第20页/共44页六、实验结果 基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。第21页/共44页实验四 PCR反应一、实验目的 了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。第22页/共44页二、实验原理PCR技术是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将将DNADNA某个特殊区域某个特殊区域扩增出来的技术。PCR的过程：高温变性：将反应体系置于高温下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。低温退

14、火：引物与模板链结合，形成部分双链DNA。中温延伸：Taq DNA聚合酶使引物从5端向3端延伸，4种dNTP掺入合成新的DNA互补链。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。第23页/共44页三、实验材料 质粒：pEGFP 四、试剂1.10 PCR buffer、rTaq 酶2.dNTP mixtures：dATP,dTTP,dGTP,dCTP 各2.5mM3.引物(2.5M)GFP-F:5:5-TAGTCGACT-TAGTCGACTATGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-5GTGAGCAAGGGCGAGGAG-5 (Tm=65.5)G

15、FP-R:5:5-GCGTCTAGA-GCGTCTAGATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-CTTGTACAGCTCGTCCATG-3 3 (Tm=61.5)4.2.0%琼脂糖凝胶 第24页/共44页五、实验步骤1、PCR反应混合液的配制(50l)10 PCR buffer 5l dNTP mixture 4l 前向引物(P1)8l 反向引物 (P2)8l DNA 模板 0.5l rTaq酶 0.5l 灭菌蒸馏水 24l 所有试剂按量仔细添加按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加30l矿物油覆盖。第25页/共44页2、PCR仪的参数设置 94 4

16、 min 94 30sec 40 cycles 61 30sec 72 50sec 72 5 min3、琼脂糖凝胶电泳检测 反应结束后，取5l PCR产品，加入1l 6loading buffer，混匀后点样，电泳20min。其余45l PCR产品保存在-20冰箱中，下次实验使用。第26页/共44页六、实验结果 观察并分析电泳图片七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。第27页/共44页实验五 PCR产品纯化及克隆一、实验目的 学习PCR产物纯化的实验技术，掌握基因工程操作技术中最常用的T-A克隆方法。第28页/共44页二、实验原理 PCR产物一般都含有过量的引物、Taq酶及dN

17、TP等成分，直接影响后续的DNA连接酶的连接反应;实验中可采用苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿依次使反应体系中的蛋白质杂质变性的方法纯化DNA产品，然后在酸性条件下用无水乙醇沉淀DNA。利用普通的Taq DNA聚合酶所扩增的PCR产物的3-端具有一个A突出末端，T载体的5-端具有一个T突出末端，二者正好互补，然后用T4 DNA连接酶在体外将目的片段与线性化载体连接的方法称为T-A克隆。第29页/共44页三、实验材料 实验四的 PCR产品 pMD19-T Vector四、试剂TE 缓冲液苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)、氯仿醋酸钠（pH5.2）、无水乙醇、70%乙醇T4 DNA连接酶混合物(Solu

18、tion I)第30页/共44页第31页/共44页五、实验步骤1、PCR产品纯化将PCR产品（约45l）小心转入1.5ml离心管中，加入55l TE缓冲液至总体积100l，混匀；加入100l苯酚/氯仿/异戊醇，涡旋混合1 min，14000 rpm离心5 min；将上层水相转移至新离心管，加入100l氯仿，涡旋混合1 min，14000 rpm离心5 min；再将上层水相转移至新离心管，加10l醋酸钠（pH=5.2）和250l无水乙醇，颠倒混匀，将离心管插入冰中放置 30 min；第32页/共44页在4，14000 rpm离心10 min，弃去上清液，观察DNA沉淀；加入500l预冷 70乙醇

19、，洗涤DNA沉淀,4 14000 rpm离心5min，弃去上清液；空气干燥DNA沉淀，加5l无菌水溶解 DNA。2、连接反应经纯化的PCR产品4.5l转移到PCR管中，加入0.5l pMD19-T载体，再加入5l T4 DNA连接酶混合物（Solution I），轻轻混匀，稍加离心即可；连接反应混合物放置在PCR仪中，16连接过夜；连接产物用于下次转化实验。第33页/共44页六、实验结果 本次实验结果必须等到下次实验完成后才能确定是否连接成功。七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。（下周不用交报告，实验六完成后再交）第34页/共44页实验六 感受态细胞的制备和转化一、实验目的1

20、.了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.学习用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习外源DNA转化大肠杆菌受体细胞的方法。第35页/共44页二、实验原理 转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株(R-，M-)，这些变异株可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些化学试剂如CaCl2、RbCl等处理后，细胞膜的通透性会发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。第36页/

21、共44页 三、实验材料 E.coli DH5菌株：R-，M-，Amp-实验五的连接产物：pMD19/GFP四、试剂 1、含氨苄青霉素(Amp,100mg/L)的LB固体培养基 2、X-gal储存液（20mg/ml）3、IPTG储存液（200mg/ml）4、0.10 mol/L CaCl2溶液第37页/共44页五、实验步骤1、受体菌的培养 从LB平板上挑取新鲜活化的E.coli DH5单菌落，接种于3-5mL LB液体培养基中，37下振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mL LB液体培养基中，37振荡培养2-3h至OD600=0.5左右。(实验

22、老师已帮大家完成)第38页/共44页2、感受态细胞的制备(CaCl2法)吸取1.5mL培养液到一灭菌的离心管中，将离心管插入冰中放置10min，然后于4下10 000 rpm离心10min。弃去上清，用1mL预冷的0.10mol/L CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞，将离心管插入冰中放置30min，4下10 000rpm离心10min。弃去上清，加入100 l预冷的0.10mol/L CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰中放置几分钟，即成感受态细胞。第39页/共44页3、连接产物的转化 向制备的感受态细胞中加入10l连接产物，轻轻摇匀，插入冰中，放置30min。含有混合物的离心管置入42水浴中热击90

23、秒，热击后迅速插入冰中，冷却3-5min。向离心管中加入900 L LB液体培养基，混匀后37振荡培养12h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。第40页/共44页4、转化产物的涂布筛选培养基(含X-gal和IPTG)的准备：在事先制备好的含100 mg/L Amp的LB平板表面（中央位置）加40l X-gal储存液和4 l IPTG储存液，用无菌玻棒将溶液涂布均匀，置于超净工作台上，使培养基表面的液体完全被吸收。取500 l复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住培养皿边缘，倒置培养皿，37培养过夜。第41页/共44页全班做两个对照:(由班长和学委各做一个)阴性对照组：以10l无菌水代替连接产物，其它操作相同。此组正常情况下在含Amp的LB平板上应没有菌落出现。阳性对照组：以1l的质粒DNA代替连接产物，其它操作相同。此组正常情况下应产生大量白色菌落。第42页/共44页六、实验结果 第二天上午十点左右回实验室观察平板上是否长出转化子(直径约1mm)，各自拍照记录实验结果，然后将平板保存在4冰箱中，作为综合实验的筛选材料。七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。第43页/共44页感谢您的观看！第44页/共44页